Genotypic 접근 방법을 사용하여 시퀀스 분석에 의한 HIV-1 Coreceptor 사용 (Tropism)의 예측

다음 실험의 전반적인 목표는 새로운 계열의 항레트로바이러스제 투여를 위해 HIV-1의 공동 수용체 사용 여부를 예측하는 것입니다. 이는 환자의 혈액에서 바이러스 유전체 핵산인 바이러스 RNA 또는 프로바이러스 DNA를 분리한 후, 엔벨로프 영역을 증폭하여 수행합니다. Tropism의 주요 결정 요인인 바이러스 V3 영역을 중첩 PCR(nested PCR)로 증폭합니다.

다음으로, fasta 파일을 생성하기 위해 서로 다른 프라이머를 사용하여 V3 amplicon을 시퀀싱합니다. 온라인 해석 툴인 geno to pheno coreceptor를 통해 얻은 위양성률(FPR)을 바탕으로 바이러스의 친화성(tropism)과 공동 수용체 길항제 민감성을 보여주는 결과를 얻습니다. 공동 수용체 사용 여부에 따라 HIV 바이러스는 R5 또는 X4로 분류됩니다.

Maraviroc은 CCR5 수용체에 결합하여 표적 세포로의 R5 바이러스 진입을 억제합니다. 질병의 경과 동안 X4 바이러스가 출현하여 R5 바이러스를 압도하며 증식할 수 있습니다. 따라서 EMA와 FDA의 요구사항에 따라 maraviroc 투여 전에는 수용체 사용 양상, 즉 친화성(tropism)의 변화 여부를 반드시 확인해야 합니다.

이 기술의 주요 장점은 다른 항레트로바이러스제 계열에 대한 내성을 매우 쉽게 병렬적으로 결정할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 트로피즘 결과에 대한 컷오프 값을 환자의 필요에 따라 수정할 수 있어 훨씬 더 개인 맞춤형 의료를 가능하게 합니다. 저희는 90년대 초반, HIV 균주의 서로 다른 세포 배양 성장과 환자의 질병 진행의 분자적 근거를 알고자 했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었으며, 본 프로토콜을 시작하기 전 저희 그룹의 기술자가 이 절차를 시연할 것입니다.

임상 현장에서 EDTA 혈액으로 샘플을 수집하여 실험실로 송부하며, 제조사의 지침에 따라 mag pure compact system 및 핵산 분리 키트를 사용하여 전혈 혈청 또는 혈장 1000 µL로부터 HIV 핵산을 분리하기 시작합니다. 얻어진 RNA 또는 DNA는 50 µL TE buffer에 용해합니다. 다음 단계는 본문에 설명된 대로 RNA의 경우 역전사 PCR을, DNA의 경우 일반 PCR을 통해 핵산의 envelope 영역을 증폭하는 것입니다. 이 반응을 통해 envelope 단백질 영역의 대부분을 포함하는 1,245 bp 길이의 산물이 생성되어야 합니다. envelope 단백질의 V3 영역을 증폭하려면 첫 번째 PCR 반응액 5 µL를 템플릿으로 사용하여 nested PCR을 수행합니다.

본문에 설명된 대로 nested in-house PCR용 마스터 믹스를 사용하여 반응액을 준비합니다. Nested PCR 수행 파라미터 또한 해당 부분에 기술되어 있습니다. V3 영역의 증폭 후, 시퀀싱을 진행하기 전에 젤 전기영동을 통해 902 base pair 길이의 예상 생성물이 생성되었는지 PCR 산물을 분석하여 확인합니다.

서면 프로토콜에 기술된 대로 PCR 산물을 정제하십시오. PCR 산물이 정제되면, 텍스트에 설명된 대로 시퀀싱 반응을 수행하고 반응이 완료될 때까지 기다리십시오. 정제된 산물을 시퀀싱하기 위해 본 절차의 서면 부분에 있는 지침에 따라 cidex G 50 superfine 및 durapore 막이 장착된 멀티 스크린 필터 플레이트를 사용하여 시퀀싱 샘플을 정제하고, 폴리머를 확인하고 버퍼를 교체하여 시퀀서를 준비하십시오.

그런 다음 샘플을 로딩하고, 조건을 설정한 뒤 런을 시작합니다. 시퀀싱 런이 끝나면, DNA STAR laser gene 프로그램을 사용하여 서열을 정렬하고 편집할 수 있습니다.

V3 앰플리콘은 적어도 하나의 정방향 프라이머와 하나의 역방향 프라이머를 사용하여 시퀀싱합니다. Lasergene은 시퀀서에서 얻은 ABI 파일을 참조 서열과 정렬합니다. V3, consensus B 및 envelope lasergene은 참조 서열을 제외하고 사용 가능한 모든 원천 데이터를 사용하여 분석된 샘플의 컨센서스 서열을 생성하며, 이를 FASTA 파일로 저장합니다.

FASTA 파일은 샘플 이름이 포함된 헤더와 뉴클레오타이드 서열로 구성된 텍스트 파일입니다. 데이터 해석 및 친화성 예측을 시작하려면 웹 기반 해석 시스템에 FASTA 파일을 업로드하십시오. Geno Tono 공동 수용체에서 바이러스가 R5로 분류되는 기준이 되는 FPR 컷오프 값을 선택하십시오.

독일 지침을 사용하여 바이러스를 R5로 분류합니다. FPR이 20% 이상일 때 R5로, FPR이 12.5% 미만일 때 X4로 분류합니다. 사용 가능한 추가 임상 파라미터를 선택한 후, align and predict를 선택하십시오. 이 서버는 뉴클레오타이드 서열을 아미노산으로 번역하고, 이를 V3 consensus B 서열과 정렬하여 서브타입 분류를 생성합니다. 또한, FPR로 표현되는 공동 수용체 사용 예측 결과를 생성합니다.

출력 결과는 공동 수용체 사용 가능성에 따른 단계별 해석을 보여줍니다. FPR 값이 높으면 바이러스가 X four가 아니라는 점이 상당히 확실하며, 해석 텍스트와 배경색이 녹색인 경우 FPR 값이 낮으면 바이러스의 특성을 확신할 수 없습니다. 녹색은 Ravi Rock의 안전한 투여를 나타내며, 노란색은 Ravi Rock 사용 시 낮은 위험 가능성이 있음을 시사하고, 빨간색은 Ravi Rock을 처방해서는 안 됨을 나타냅니다.

또한, 서버는 출력하여 의사에게 보낼 수 있는 PDF 보고서를 생성합니다. 환자의 성명이나 채혈 날짜와 같은 추가 데이터는 PDF 작성 프로그램을 사용하여 수동으로 포함할 수 있습니다. 사용자의 컴퓨터 내의 개인적인 환경에서 특정 코멘트를 추가하는 것도 가능합니다.

이 영상을 시청한 후, geno pheno receptor 도구를 사용하여 바이러스 찹(viral chops)을 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행하는 동안 주기적으로 품질 관리를 실시하는 것이 중요합니다. HIV를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 항상 예방 조치를 취하고 공인된 생물 안전 실험실을 이용해야 함을 잊지 마십시오.