Name: 얼음 총액 : 성장을위한 방법 Arabidopsis높은 처리량 Genotyping을위한 96 - 웰 플레이트에와 토마토 식물 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 배우세요 96-웰 플레이트에서 Arabidopsis와 토마토 식물을 재배하여 뿌리 조직을 비파괴적으로 채취하는 Ice-Cap 방법을 통해 고속 유전자형 분석을 수행하는 기술입니다.

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이 작품은 국립 과학 재단 (부여 번호 MCB - 0447750)에서 부여에 의해 투자되었다.

<ol><li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+%28Ice-Cap+2.0%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li>
<li>Krysan, P. I. ce-cap <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li>
<li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li>
<li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li>
<li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li>
<li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li>
<li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTILLING%3A+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li>
<li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING%3A+practical+single-nucleotide+mutation+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li>
<li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li>
<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+%28TILLING%29+for+plant+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 아이스 캡 방법은 하루에 각 식물의 수백, 또는 수천의 조직 샘플을 수집하고 효율적으로 genotyping 반응에 사용하기 위해 이러한 샘플에서 게놈 DNA를 추출 한 과학자 수 있습니다. 개별 과학자 시간의 짧은 기간에 모종의 수천을 유전자형 수있는 능력을 제공함으로써, 아이스 캡 방식은 다르게 수행하는 실용적 않을 유전자 실험의 숫자를 촉진시킬 잠재력이있다. 몇 가지 예제가 아래에 제공됩니다. <ol><li> 유전자 매핑. 연구원은 염색체 3 따라 특정 간격 내에 재조합 이벤트를 식별할 수있다면 미세 규모의 유전자 매핑을 빠른 수 있습니다. 이 간격이 매우 짧은 유전자 거리를 포함한다면, 재조합 이벤트 segregating 매핑 인구 비교적 드문 것입니다. 이런 이유로, 그것은 원하는 다시 찾을 개별 식물의 화면 수천해야 할 수도 있습니다combinant 개인. 이 과정은 크게 얼음 모자의 사용을 통해 빠른 수 있습니다. 심지어 게놈 와이드 다시 시퀀싱의 시대에 직접 주어진 돌연변이가 관심의 표현형 직접 책임이있다는 것을 입증하는 여전히 필요합니다. 이러한 경우에는, 그것은 후보 변이 실제로 원인이되는 것입니다 증명하기 위해 다른 밀접하게 연결된 돌연변이 떨어져 관심의 변이를 분리하기 위해 필요합니다. 이러한 상황에서는, 아이스 캡은 밀접하게 연결된 한 쌍의 변이 사이의 연동을 깨는위한 효율적인 방법을 제공합니다. </li><li> 멀티 돌연변. 그것은 기능 중복 4-6을 극복하기 위해 하나의 개인으로 몇 가지 별개의 loci에서 돌연변이 대립 유전자를 조합하여 Arabidopsis를 공부하고 연구에 대한 일반되었다. 예를 들어, 하나는 유전자 횡단을 통해 단일 ​​공장으로 네 가지 loci에서 돌연변이 대립 유전자를 결합하고자 사건을 고려하십시오. 이 프로젝트에 대해, 그것은을 생성하는 데 필요한 것입니다횡단 계획의 일환으로이 네 loci에서 heterozygous있다 N 개별. 이 사중 - heterozygote 세트의 씨앗이, 사중 homozygote는 자손의 결과 인구 256의 밖으로 하나의 비율로 존재 것으로 예상하는 경우. 전통적인 방법으로이 드문 개인에 대한 선별하는 것은 매우 노동 집중 것입니다. 비교함으로써,이 프로젝트 얼음 모자를 사용하면 하나의 세대에 희귀한 사중 homozygote 식별을 위해 효율적인 전략으로 과학자를 제공할 것입니다. </li><li> iTILLING. 저희 연구실은 최근 Arabidopsis 7의 관심 유발 변이 유전자의 존재를 검사하기위한 새로운 접근 방식을 설명했다. 이 방법은 화학 mutagen 80-10로 치료 개인의 주문 인구의 변이를 찾을 ​​사용되는 TILLING라는 설립된 기술에 대한 변화이다. 그것이 산업 있습니다 TILLING의 개별 버전이기 때문에 우리는 우리의 방법 iTILLING 이름을 붙여 놨ividual 과학자는 전통적으로 완료하는 데 큰 연구팀 필요가 무언가를 달성할 수 있습니다. 아래에 설명된대로 아이스 캡은 iTILLING 방법 7의 중요한 부분을 형성한다. </li></ol> iTILLING 뒤에 아이디어는 전통적인 TILLING 프로젝트 만든 내구성 돌연변이 인구 대비 서 임시 돌연변이 인구를 생산하는 것입니다. iTILLING 들어, bulked M2 인구의 종자가 50-100 얼음층 블록에 sown하고 있으며, DNA는 아이스 캡 방법을 사용하여 추출됩니다. Arabidopsis 모종은 다음 4에 배치됩니다 ° C 돌연변이 검사는 아이스 캡 DNA를 사용하여 수행하는 동안 preps. 토마토 모종은 12 ° C.에 저장됩니다. 모종 운반 원하는 돌연변이가 확인되고 나면, 그들은 아이스 캡 접시에서 회복하고 흙으로 전송됩니다. iTILLING는 화면 전체 연구 커뮤니티에 대한 지속적인 돌연변이 인구를 제공하기위한 것이 아닙니다. 대신, iTILLING는 전략을 제공하는과학자 한사람 효율적으로, 그리고 상대적으로 낮은 비용으로 신속하게 유전자의 소수의 돌연변이에 대한 사용자 지정 돌연변이 인구를 스크린 수 있습니다. 우리는 Arabidopsis, 토마토, 그리고 쌀을 재배하고 genotyping을위한 효과적인 방법으로 얼음 모자를 발견했습니다. 우리는 식물의 다른 종류도 아이스 모자 의무가되어야한다는 기대합니다. 아이스 캡에 의해 수용 수있는 수종의 다양한 한 제한은 종자의 크기입니다. 96 - 웰 플레이트의 우물에 들어갈만큼 작은 씨앗과 식물만이 현재 구성에서 아이스 모자와 호환됩니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, 뉴저지 </td><td> 2000 제노 / 그라인더 </td><td> DNA 추출을위한 루트 번호판을 수수 혐의로 머신 </td></tr><tr><td> ABgene 써모 - 실러 </td><td> ABgene 미국 </td><td> AB - 0384 </td><td> 조직 중단하기 전에 루트 판하는 데 사용되는 수동 열 씰링 기계 </td></tr><tr><td> 스윙 microplate 캐리어가 장착된 원심 분리기 </td><td> 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> Allegra 25R </td><td> 스윙 microplate 캐리어와 함께 모든 원심 분리기는 적절한 것입니다 </td></tr><tr><td> MicroFill Microplate 디스펜서 </td><td> BioTek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> 충전 microplates에 대한 자동화된 액체 디스펜서 </td></tr><tr><td> Bialetti 브랜드17x11 인치 대형 상업 쿠키 시트 </td><td> 대상 백화점 </td><td> www.bialetti.com </td><td> 특정 쿠키 시트는 얼음 모자를위한 이상적인 깊이를 가지고 </td></tr><tr><td> 사용자는 금속 랙을 제작 </td><td> 철물점 </td><td></td><td> 전체 설명에 대한 텍스트를 참조하십시오 </td></tr><tr><td> 33 리터 플라스틱 저장 박스 </td><td> 대상 백화점 </td><td> Sterilite 브랜드 </td><td> 아이스 캡 분수하십시오. 17x11 인치 쿠키 시트를 고정할 정도의 커다란 플라스틱 저장 박스 </td></tr><tr><td> 시간 분수 펌프 당 30갤런 </td><td> Sunterra </td><td> 104,506 </td><td> 정원 공급 상점에서 사용 가능한 소형 잠수정의 분수 펌프 </td></tr><tr><td> 분수 펌프를위한 호스 </td><td> 모든 실험실 공급 회사 </td><td></td><td> 분수 펌프와 호환 호스 </td></tr><tr><td> 플라스틱 클램프 </td><td> 철물점 </td><td></td><td> 쿠키에 호스를 잡아 고정시트 </td></tr><tr><td> 팔콘 Microtest 평면 바닥 96 - 웰 폴리스티렌 접시에서 투명한 플라스틱 뚜껑 </td><td> BD 팔콘 www.bdbiosciences.com </td><td> 351,172 </td><td> 아이스 캡 묘목 플레이트를 덮고위한 투명한 플라스틱 뚜껑 </td></tr><tr><td> 3M Micropore 외과 테이프 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch 직경 스테인레스 스틸 공 </td><td> 하트 포드 테크놀로지, 록키 힐, CT </td><td> 034-006 - 1K </td><td> 수확 후 뿌리 조직을 방해하는 데 사용 </td></tr><tr><td> 3 인치 탄성 헤어 밴드 </td><td> 지역 식료품 가게 </td><td></td><td> 묘목 플레이트에 루트 플레이트를 확보하는 데 사용 </td></tr><tr><td> 4mm 직경 나무 꼬치 </td><td> 지역 식료품 가게 </td><td></td><td> 이러한 꼬치 일반적으로 kabobs를 준비하는 데 사용됩니다 </td></tr><tr><td> 피셔 과학 Nunc 브랜드 프릿없이 1 - ML 필터 플레이트 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 278,012 </td><td> 바닥에 구멍이있는 96 - 웰 플레이트 묘목. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96 - 잘 크고 - 굴뚝 PCR 플레이트 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14-230-242 </td><td> 96 - 웰 플레이트 루트 </td></tr><tr><td> 한천 - 세포 배양 테스트 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4 - Morpholinoethanesulfonic 산 (MES) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige와 Skoog (MS) 기초 소금 혼합물 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M - 5524 </td><td></td></tr><tr><td> 호일을 밀봉 쉽게 벗겨 열 </td><td> ABgene 미국 </td><td> AB - 0745 </td><td> 조직 중단하기 전에 루트 번호판을 씰링을위한 열 씰링 필름 </td></tr><tr><td> 오리 브랜드 엑스트라 와이드 포장 테이프, 3.00 &quot;X 54.6 야드 </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> 아무 항목 없습니다. 21242139 </td><td> 접착제 테이프스토리지를위한 DNA 추출물을 포함하는 씰링 microplates에 대한 </td></tr><tr><td> 실링 롤러 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> MSR - 0001 </td><td> 손 microplates에 접착 씰링 테이프를 누르면위한 압연 도구를 개최 </td></tr><tr><td> 96 - 웰 금속 열 차단 </td><td> 콜 - Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> 조직의 수확의 루트 번호판을 동결하는 데 사용 </td></tr><tr><td> 워트 먼지 필터 용지 </td><td> 워트 먼지 국제 </td><td> 1002 090 </td><td> 표면 살균 씨앗에 사용 </td></tr><tr><td> 일회용 파스퇴르 피펫 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-678 - 6A </td><td> 5 어 &quot;일회용 파스퇴르 피펫은 묘목 플레이트에 씨앗을 전송에 사용 </td></tr><tr><td> Pyrex 베이킹 접시 (20cm X 30cm) </td><td> 대상 백화점 </td><td></td><td> 드라이 아이스 / 에탄올 목욕을 구축하는 데 사용됩니다. </td></tr></tbody></table>

얼음 총액 : 성장을위한 방법 arabidopsis높은 처리량 genotyping을위한 96 - 웰 플레이트에와 토마토 식물

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

그것은 식물이 다수의 genotyping을 필요로 프로젝트를 개발하기 위해 식물 과학자에 대한 일반지고 있습니다. 모든 genotyping 프로젝트의 첫 번째 단계는 각각의 공장에서 조직 샘플을 수집하는 것입니다. 이 작업에 대한 전통적인 접근 방식은 샘플 식물 하나에서 - - 시간입니다. 개인의 유전자형 수백 또는 수천 한 소망 그러나, genotyping 파이프라인에 상당한 병목 현상이 전략 결과를 사용하는 경우. 우리가 여기서 설명하는 아이스 캡 방식은 과학자 한사람 하루 1,2에서 수천 모종의 조직을 수집할 수 있도록 허락해하여이 도전하는 높은 처리량 솔루션을 제공합니다. 처리량이 수준은 조직이 아니라 하나에서 - - 시간보다, 식물의 96시 - 시간을 수확있다는 사실에 의해 가능하게됩니다. 아이스 캡 방법은 묘목의 성장, 조직 수확 및 DNA 추출을 수행하기위한 통합 플랫폼을 제공합니다. 얼음 모자의 기초는 seedli의 성장입니다96 - 웰 플레이트의 스택 쌍의에 ngs. 상단 접시의 우물 개별 모종은 발아되는 한천 성장 미디어의 플러그가 포함되어 있습니다. 뿌리는 한천 매체를 통해 구멍을 통해 상부 판을 종료하고, 낮은 플레이트가 포함된 물에 통과 아래로 성장합니다. 상단 플레이트에있는 묘목은 실온에서 유지하면서 DNA 추출, 뿌리 조직을 포함하는 낮은 접시에 물이 조직을 수확하는 것은 급속 냉동입니다. 상부 판은 다음 얼음과 96 가능한 모종 한 판에 얼어 붙 어서 96 루트 조직 샘플 한 접시를 항복, 멀리 낮은 접시에서 벗겨 있습니다. 그것은 루트 조직을 캡처하는 얼음을 사용하기 때문에이 기술은 &quot;아이스 모자&quot;라는 것입니다. 묘목을 포함한 96 - 웰 플레이트 다음 호일에 싸여과 낮은 온도로 전송하실 수 있습니다. 이 과정은 모종의 추가 성장을 정직 시키실지만, 그들의 생존에 영향을주지 않습니다. 유전자형 분석이 완료되면 원하는 유전자형과 모종은 96 잘 P에서 전송할 수 있습니다자세한 전파를 위해 토양에 늦었어요. Arabidopsis thaliana 우리는, 토마토, 그리고 쌀 모종을 사용하여 아이스 캡 방식의 유틸리티를 증명하고있다. 우리는 방법도 96 - 웰 플레이트의 우물에 들어갈만큼 작은 씨앗과 식물의 다른 수종에 적용되어야한다고 기대합니다.

아이스 캡 방식은 하나가 각 묘목의 96 - 웰 플레이트 및 비 destructively 수확 루트 조직에 식물을 성장 할 수 있습니다. 이 루트 조직에서 추출한 DNA는 genotyping 반응에 사용될 수 있습니다. 우리는 얼음 모자가 잘 작동하는지 발견<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, 토마토, 쌀 모종.

얼음 총액 : 성장을위한 방법 Arabidopsis높은 처리량 Genotyping을위한 96 - 웰 플레이트에와 토마토 식물

식물학자들이 다수의 식물에 대한 유전자형 분석(genotyping)이 필요한 프로젝트를 개발하는 것이 일반화되고 있습니다. 모든 유전자형 분석의 첫 번째 단계는...

본 실험의 전반적인 목적은 DNA 추출 및 유전자형 분석을 위해 96웰 플레이트에서 배양한 식물 유묘로부터 뿌리 조직 샘플을 분리하는 것입니다. 이를 위해 먼저 한천 성장 배지가 포함되어 있고 각 웰 바닥에 구멍이 뚫린 특수 96웰 플레이트에서 유묘를 발아시킵니다. 그다음 단계로, 유묘가 담긴 플레이트를 물이 채워진 표준 96웰 플레이트 위에 쌓아 올립니다.뿌리가 아래쪽 96웰 플레이트로 자라 내려오면, 적층된 플레이트를 냉동 블록에 넣어 아래쪽 플레이트의 물을 얼립니다. 마지막 단계로 위쪽 플레이트를 아래쪽 플레이트에서 떼어내어, 아래쪽 플레이트에 얼어 있는 뿌리를 끊어냅니다. 최종적으로 이렇게 얻은 뿌리 조직 샘플을 사용하여 개별 식물로부터 DNA 샘플을 추출해 유전자형 분석을 수행할 수 있습니다.대체 방법과 비교했을 때 ice cap의 주요 장점은 단 하루 만에 수천 개 식물에서 DNA를 분리할 수 있다는 점입니다. 이러한 수준의 생산성이 가능한 이유는 기존의 방식처럼 한 번에 하나씩 처리하는 것이 아니라, ice cap을 통해 식물을 한 번에 96개씩 처리할 수 있기 때문입니다. icecap의 활용 사례로는 대량의 식물 군집을 스크리닝하여 다수의 서로 다른 매핑된 돌연변이를 보유한 밀접하게 연결된 IDE 생성 식물 간의 희귀 재조합체를 식별하거나, 작물 종에서 마커 보조 선택을 수행하는 것 등이 있습니다.기본적으로 유전형 분석 비용이 발생하는 모든 실험에서, 다수의 개별 식물을 다룰 때 icecap 용기를 통해 잠재적인 이점을 얻을 수 있습니다. 당사는 원래 토끼 농양 사용을 위해 icecap을 개발했으나, 벼와 토마토 묘목에서 조직을 수집하는 데에도 성공적으로 활용하였습니다. 씨앗의 크기가 96-well 플레이트에 들어갈 정도로 충분히 작다면, icecap이 다른 종에서도 효과적일 것으로 기대합니다.먼저 유묘 플레이트를 호일로 감싼 뒤 동시에 고압 증기 멸균합니다. 멸균 사이클이 완료되면 유묘 플레이트용 투명 플라스틱 덮개를 95% ethanol에 담가 소독하고, 층류 정화 작업대(lamina flow hood)에서 유묘 플레이트와 덮개를 완전히 건조시킵니다. 플레이트가 완전히 마르면, 각 유묘 플레이트 바닥에 패킹 테이프를 붙이고 롤러를 사용하여 단단히 밀봉합니다.그런 다음 마이크로필 마이크로플레이트 디스펜서 또는 멀티채널 피펫을 사용하여 각 유묘 플레이트의 웰에 450 µL의 용해된 성장 배지를 분주합니다. 플레이트를 플라스틱 뚜껑으로 덮고 성장 배지가 실온에서 고체화되도록 둡니다. 건조된 종자를 왓만 여과지에 뿌리고 각 종자가 95% ethanol에 완전히 잠기도록 덮어줍니다.그런 다음 종자를 충분히 자연 건조시킵니다. 다음으로, 개조된 유리 피펫의 화염 밀봉된 끝부분을 한천 배지의 표면에 먼저 접촉시켜 종자를 유묘 플레이트로 옮깁니다. 이렇게 하면 피펫 끝이 적셔져 단일 종자를 쉽게 집어 한천 표면으로 옮길 수 있습니다.각 웰에 씨앗이 담기면, 각 유묘 플레이트를 투명 플라스틱 덮개로 덮고 마이크로포어 수술용 테이프로 밀봉합니다. 쌓아둔 플레이트들을 알루미늄 호일로 감싸 4°C에서 4일 동안 보관하여 씨앗을 층적 처리하고 발아 시기를 동기화합니다. 4일 후, 유묘 플레이트를 18~20°C의 형광등 아래에 두고 추가로 4일 동안 둡니다.발아를 시작하려면 식물 성장실의 선반 위에 아이스 캡 파운틴(ice cap fountain)을 설치하여 아이스 캡 파운틴의 표면에 형광등 빛이 직접 닿게 하십시오. 조립 방법은 다음과 같습니다. 먼저, 맞춤형 랙 구조물을 플라스틱 보관함 안에 넣은 다음, 그 위에 쿠키 시트를 배치하십시오.레벨링 너트를 사용하여 쿠키 시트의 수평을 조절하십시오. 그런 다음 저장 박스에 수중 펌프를 넣고, 스프링 클램프를 사용하여 펌프의 출력 호스를 쿠키 시트 측면에 고정하십시오. 다음으로, 증류수 3부와 수돗물 1부의 혼합액을 아이스 캡 분수에 채우십시오.수중 펌프가 수면보다 수 센티미터 아래에 위치할 때까지 물을 추가해야 합니다. 플라스틱 보관 용기의 최종 수위를 실험용 테이프와 마커 펜을 사용하여 표시하십시오. 96 웰 루트 플레이트의 각 웰에 스테인리스강 구슬을 하나씩 넣어 루트 플레이트를 준비합니다.그 후, 3부의 증류수와 1부의 수돗물을 혼합한 혼합액 340 µL를 뿌리 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 유묘 플레이트 바닥의 접착 필름을 벗겨내고 투명 플라스틱 덮개를 제거합니다.금속 구슬과 물이 들어 있는 뿌리 플레이트에 각 유묘 플레이트를 넣고, 두 개의 고무줄을 사용하여 쌍을 이룬 플레이트를 함께 고정합니다. 그다음 적층된 플레이트를 아이스 캡 파운틴(ice cap fountain)에 넣습니다. 쌍을 이룬 플레이트는 아이스 캡 파운틴에 10~14일 동안 두어야 합니다.이 기간 동안 증류수를 보충하여 아이스 캡 파운틴(ice cap fountain)의 수위를 유지하십시오. 대부분의 묘목의 뿌리 조직이 루트 플레이트(root plate)를 관통하면, 뿌리 조직 수확을 준비하기 위해 아이스 캡 파운틴에서 플레이트를 제거하십시오. 플레이트를 아이스 캡 파운틴에서 제거한 후, 적층된 묘목 플레이트와 루트 플레이트의 웰(well) 사이에 나무 꼬챙이 3개를 삽입하십시오.꼬챙이는 묘목 플레이트의 끝부분을 뿌리 플레이트의 웰 위로 들어 올리게 됩니다. 나무 꼬챙이가 삽입된 상태로 적층된 아이스 캡 플레이트를 조명 아래에서 하룻밤 동안 둡니다. 이 배양 과정을 통해 뿌리 플레이트 내 액체가 약간 증발하며, 이는 이후의 동결 및 플레이트 분리 과정을 용이하게 합니다.조직 수확 당일에 냉각조를 준비합니다. 드라이아이스와 95% ethanol 혼합물이 담긴 Pyrex 접시에 96웰 금속 열전도 블록을 배치합니다. 열전도 블록이 온도에 적응하도록 약 20분 동안 둡니다.나무 꼬치로 고정하여 쌓은 아이스 캡 플레이트를 냉각된 서멀 블록 위에 올리고 5분 동안 배양합니다. 이 과정 동안 루트 플레이트의 물이 완전히 얼게 됩니다. 냉각조에서 적층된 아이스 캡 플레이트를 꺼내 상온의 실험대 위에 놓고, 적층된 플레이트에서 고무줄과 나무 꼬치를 제거합니다.묘판 상단을 세게 눌러 판을 깨뜨립니다. 그런 다음 뿌리판과 묘판을 조심스럽게 분리합니다. 뿌리판의 물이 상온에서 녹도록 둡니다.그렇지 않으면, 서멀 블록(thermal block)에서 뿌리 플레이트를 배양하여 해동 속도를 높일 수 있습니다. 뿌리 플레이트가 해동되는 동안 온도를 25 °C로 설정하십시오. 묘목 플레이트를 보관 준비할 수 있습니다.이를 위해, 묘판의 하단을 접착 테이프로 밀봉하십시오. 그런 다음 묘판 위에 투명 플라스틱 덮개를 덮고 마이크로포어 테이프로 고정하십시오.유묘 플레이트를 함께 쌓은 다음 알루미늄 호일로 감싸고 arabidopsis 유묘를 4°C에 보관하십시오. 유묘는 생존력에 영향을 주지 않고 이 온도에서 수 주 동안 보관할 수 있습니다. 뿌리 플레이트의 물이 완전히 해동되었는지 확인하십시오.DNA 추출 절차를 수행하기 전, 플레이트를 점검하여 수분량이 평균보다 현저히 적은 웰이 있는지 확인하고, 추가 수분이 필요한 웰에 증류수를 피펫으로 분주하십시오. 그다음, 뿌리 플레이트의 각 웰에 500 millimolar TRISS 50 millimolar EDTA 용액 25 µL를 피펫으로 분주하십시오. 이후 열 밀봉 포일과 열 밀봉기를 사용하여 뿌리 플레이트의 웰을 밀봉하십시오.밀봉된 뿌리 플레이트의 밀봉된 끝부분이 아래를 향하도록 하여 geno grinder 기기에 배치합니다. geno grinder에서 분당 1,350회 속도로 3분 30초 동안 플레이트를 흔들어 줍니다. 마이크로플레이트 캐리어가 장착된 원심분리기로 플레이트를 옮긴 후, 4 °C에서 3,500 RPM으로 10분 동안 원심분리하여 분쇄된 뿌리 조직을 침전시킵니다.멀티 채널 파이펫을 사용하여 루트 플레이트의 각 웰에서 상층액 20 µL를 각 웰에 80 µL의 milli Q water가 포함된 새로운 96-웰 플레이트로 옮깁니다. 이 희석된 추출물에는 표준 프로토콜에 따라 유전자형 분석 PCR 반응에 직접 사용할 수 있는 게놈 DNA가 포함되어 있습니다. 각 유묘의 유전자형이 확인되면, 냉장 보관 중인 유묘 플레이트를 꺼내고 가압 공기와 고무 호스를 사용하여 물로 포화된 토양 혼합물이 담긴 화분을 준비합니다. 유묘 플레이트 웰의 작은 구멍에 부드럽게 공기압을 가하여 아가 플러그와 유묘가 플레이트에서 실험대로 튀어나오게 합니다.토양에 한천 플러그 크기와 비슷한 작은 구멍을 만듭니다. 그다음 한천 플러그를 토양에 넣고, 플러그 주변을 습한 토양으로 채워 묘목을 토양에 고정합니다. 이식한 묘목을 18 to 22 °C의 조명 아래에 둡니다.이식 후 처음 이틀 동안은 각 화분을 플라스틱 덮개로 덮어줍니다. 그 후 덮개를 제거하고 표준 성장 조건에서 식물을 재배합니다. 이 이미지는 아이스 캡 파운틴(ice cap fountain)에서 2주 동안 재배되어 조직 수확 준비가 된 Arabidopsis 묘목을 보여줍니다.두 개의 웰 각각에 Arabidopsis 묘목이 들어 있습니다. 루트 플레이트의 동일한 두 웰을 측면에서 본 모습은 뿌리가 웰의 내벽을 따라 꼬여 있음을 보여줍니다. 이 기술을 통해 하루 8시간 동안 최대 40개의 icecap 플레이트를 처리할 수 있습니다.이를 통해 한 명의 연구원이 하루에 3,800개 이상의 개별 묘목으로부터 DNA prep을 생산할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 묘목이 발아하자마자 배양 접시를 아이스 캡 파운틴으로 옮겨야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 적절한 데이터 전송 시점을 놓치지 않도록 매일 접시를 확인하십시오. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

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생물학

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