아데노 바이러스 파생 시스템의 도움으로 효율적인 재조합 파르 보 바이러스 생산

이 실험 절차의 전반적인 목표는 품질을 유지하면서 생산 시간과 비용을 줄이고, 고역가의 재조합 파보바이러스(rec PVS)를 생산하는 것입니다. 이는 먼저 rec PV 플라스미드와 아데노바이러스 5형 유래 벡터를 HEC 293T 세포에 함께 트랜스펙션하여 초기 rec PV 바이러스 스톡을 생성함으로써 달성됩니다. HEC 293T 세포에 ad 게놈 요소가 도입되면 rec PVS의 생산량이 10배 이상 증가하기 때문입니다.

기존 프로토콜과 비교하여, 재조합 파르보바이러스 생산을 증진하는 데 필요한 게놈 아데노바이러스 요소와 파르보바이러스 VP 유전자 단위를 포함하는 새로운 AD VP 헬퍼가 생성되었습니다. 다음 단계는 표준 프로토콜에 따라 이 새로운 AD VP 헬퍼를 생산하고 정제하는 것입니다.

이 절차의 마지막 단계는 rec PV와 AD ADP 바이러스를 NB three 20 4K 세포에 공동 감염시켜 rec PVS를 증폭하는 것입니다. 이러한 전략을 통해 rec PV 생산 효율을 100배 이상 향상시킬 수 있으며, 이는 트랜스펙션을 통해 소량의 rec PVS가 생산된 이후에만 독점적으로 사용할 수 있습니다. 최종적으로, 생산된 바이러스 스톡의 역가를 측정하기 위해 정량적 실시간 PCR 또는 형질전환 분석이 사용됩니다.

또한, 생산 과정 중 원치 않는 복제 가능 바이러스가 생성되지 않았음을 확인하기 위해 플라크 분석(plaque assay)을 수행합니다. 플라스미드 전이 및 처리 세포를 통한 전통적인 재조합 파보바이러스 생산과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 아데노바이러스 VP 헬퍼 내에서 재조합 파보바이러스의 초기 스톡을 일단 생산하고 나면 이후 생산 과정이 전적으로 바이러스 감염에 의존한다는 점입니다. 이를 통해 파보바이러스 생산 효율은 높지만 형질전환이 어려운 NBK 세포를 사용할 수 있습니다.

이러한 방식으로 재조합 바이러스를 증폭시키고 바이러스 역가를 100배 이상 높임으로써 생산 시간과 비용을 절감할 수 있습니다. 본 절차의 시연은 바이러스 생산 부서장이며 이 새로운 프로토콜을 함께 개발한 Barbara Loic이 진행하겠습니다. 이 영상이 도움이 되길 바라며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 기원합니다.

트랜스펙션을 통한 재조합 파보바이러스(recombinant parvovirus 또는 rec PV)의 생산은, 이후 감염을 통한 rec PVS 생산 시 접종균으로 사용할 최소량의 rec PVS를 제조하기 위해 필요합니다. 트랜스펙션 하루 전 rec PVS 생산을 위해 생물안전 2등급(BSL-2) 실험실이 필요합니다. 50%의 세포 합류도(cellular confluency)를 얻기 위해 10cm 플레이트에 200만 개의 HEC 2 9 3 T 세포를 분주합니다.

형질전환 당일에 10% FBS, L-glutamine, penicillin 및 streptomycin이 첨가된 10 mL의 DMEM에서 세포를 배양하며, 37°C, 5% CO₂ 및 92% 습도 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 형질전환 당일에 1.5 mL 튜브에 바이러스 제조 혼합물을 준비합니다. 관심 전이유전자를 포함하는 3 µg의 rec PV 벡터를 포함하여 다음 시약들을 1:2:1의 몰 비로 첨가합니다.

파르보바이러스 캡시드 유전자 단위를 포함하는 벡터 P-C-M-V-V-P 6 µg과 아데노바이러스 유래 헬퍼 플라스미드 8 µg을 준비합니다. 플라스미드 혼합물을 무혈청 배지로 850 µL까지 희석하여 최종 농도를 20 ng/µL로 맞춥니다. 다음으로, FU gene reagent 대 DNA의 비율을 2.5:1로 하여 FU gene HD transfection reagent 42.5 µL를 첨가합니다.

FU 유전자 시약이 튜브 벽면에 닿지 않도록 주의하며 5~10초 동안 가볍게 볼텍싱한 후, 형질전환 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 형질전환 혼합물을 세포에 한 방울씩 첨가합니다. 플레이트를 가볍게 흔들어 혼합물이 고르게 분산되도록 합니다.

플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 및 92% 습도 조건에서 72시간 동안 배양합니다. 이 기간 동안 바이러스를 수확하기 위해 파보바이러스 플라스미드로부터 후손 파보바이러스 입자가 형성됩니다. 먼저 배지가 포함된 상태에서 세포를 긁어낸 다음, 플레이트에서 현탁액을 흡입하여 15 mL 플라스틱 튜브로 옮깁니다.

튜브를 250 G에서 5분 동안 원심 분리합니다. 실온에서 상층액의 95%를 제거하고, 약 0.5 milliliters만 남깁니다. 튜브를 가볍게 볼텍싱하여 펠릿을 남은 상층액에 재현탁시킨 후, 1.5 milliliter 에펜도르프 튜브로 옮깁니다.

현탁액을 액체 질소 조에 넣어 동결시킨 후 37 °C의 온수에서 해동하십시오. 튜브를 15초 동안 강하게 볼텍싱합니다. 동결-해동 사이클을 두 번 더 반복하십시오.

튜브를 4°C에서 16,000 G로 15분 동안 원심분리하고, 상층액을 새 튜브에 수집합니다. 이 단계의 상층액에는 조-바이러스 추출물이 포함되어 있으며, 이는 감염을 통한 rec PVS 생산을 위한 접종물로 사용될 수 있습니다. Power virus gain.

A 복제는 증식하는 세포에서 발현되는 세포 인자에 의존합니다. 따라서 재조합 power 바이러스 생산에 사용되는 세포가 최적의 상태여야 하며, 본 프로토콜에서 설명하는 바와 같이 적절한 밀도로 도말되는 것이 중요합니다. 감염 전날, 다음 날 60~80%의 세포 합류도(confluency)를 얻기 위해 T 1 75 플라스크에 10 million MB three 20 4K 세포를 도말하십시오.

대조군으로 사용할 동일한 수의 세포가 들어 있는 두 번째 플라스크를 준비합니다. 감염 당일 아침, 각 T 1 75 플라스크에는 5% FBS, L-glutamine, penicillin 및 streptomycin이 보충된 MEM 20 milliliters가 최종 부피로 들어가 있어야 합니다. 2 milliliters 플라스틱 튜브에 바이러스 혼합물을 준비합니다.

이 시약들을 추가합니다. VP helper를 추가합니다. MOI 0.5의 rec PVS를 감염 다중도 10으로 추가하고 MEM을 1.5 milliliters까지 추가합니다.

바이러스 혼합물 전체를 T 1 75 플라스크 중 하나에 접종합니다. 37 °C, 92% 습도, 5% carbon dioxide 조건에서 15분마다 가볍게 흔들어주며 2시간 동안 배양합니다. 이후 37 °C, 92% 습도, 5% carbon dioxide 조건에서 20~24시간 동안 추가로 배양합니다.

20~24시간 후에 배양액을 신선한 배지로 교체하고, 효율적인 바이러스 생산을 위해 동일한 조건에서 48시간 동안 플라스크를 배양합니다. 바이러스에 감염된 세포가 포함된 플라스크에서는 뚜렷한 세포독성 징후가 관찰되어야 합니다. 감염 후 36~48시간이 지난 시점부터 48시간 후에, 플라스크에서 배양 상층액을 흡입하여 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다.

세포를 1.5 mL PBS로 두 번 세척한 후, 트립신을 처리하여 3~5분간 방치하고, 세포 현탁액을 제거된 배지에 추가합니다. 세포와 상층액을 상온에서 5,000 G로 5분간 원심분리한 다음, 상층액을 버리고 세포 펠렛에 1 mL TE 버퍼를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 볼텍싱하여 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 액체 질소조에서 급속 냉동시킨 후 37 °C의 온수에서 해동합니다.

튜브를 15초 동안 강하게 볼텍싱합니다. 동결-해동 사이클을 3회 반복합니다. 다음으로, 게놈 세포 및 패키징되지 않은 바이러스 DNA를 분해하기 위해 37°C에서 30분 동안 Ben Nase nuclease로 세포 현탁액을 처리합니다.

30분 후, 튜브를 4°C에서 5,000 G로 20분 동안 원심분리합니다. 마지막으로 상층액을 새 튜브에 수집합니다. 이 단계의 상층액에는 조바이러스 추출물이 포함되어 있습니다.

본 프로토콜에 따라 생산된 rec PV GFP의 일반적인 수율은 1~10 × 10⁸ viral infectious units 범위여야 합니다. 여기에서는 아데노바이러스 기반 플라스미드에 의한 rec PV 생산 촉진 사례를 보여줍니다. GFP 유전자의 포함 여부에 따른 GFP 발현 rec PV가 포함된 PHH one GFP 조바이러스 추출물입니다.

아데노바이러스 기반 PXX 플라스미드를 NBK 지시 세포에 적용한 결과, 이 현미경 사진에서 관찰되는 바와 같이 PXX six가 존재할 때 GFP 양성 세포가 더 많이 나타났습니다. GFP 형질전환 분석을 수행했을 때, Pxx six가 존재함에 따라 rec PV 생성량이 명확하게 증가하였습니다. 생성량은 기존 프로토콜을 통해 얻은 세포당 0.3 GFP 형질전환 단위(TU)에서 본 프로토콜을 통해 얻은 약 5 TU per cell까지 증가하였습니다.

GFP 형질전환 분석 결과, PXX6에 포함된 아데노바이러스 E2a, E4 및 VA RNA 유전자가 파르보바이러스 생성을 촉진할 수 있음을 나타냅니다. 다음 그림은 감염을 통한 재조합 PV 생성의 대표적인 예시를 보여줍니다. NB320 4K 세포에 정제된 ADP 헬퍼 바이러스를 감염시킨 후, 두 종류의 재조합 파르보바이러스 중 하나를 추가로 감염시켰습니다.

조-전달 분석(transduction assay)을 통해 바이러스 역가를 측정하기 위해 조세포 추출물을 사용하였으며, 그 결과 AD VP 헬퍼가 rec PV 생산을 세포당 70 T 이상으로 더욱 증가시켰음을 확인하였습니다. 마지막으로, ADP의 존재 또는 부재 하에 생산된 바이러스 배치의 복제 가능 바이러스 입자 함량을 MB three 20 4K 지시 세포를 이용한 플라크 분석(plaque assay)으로 분석하였습니다. 결과적으로, ADP 헬퍼는 개발 후 원치 않는 복제 가능 바이러스 입자의 발생을 증가시키지 않으면서 rec PV 생산을 향상시켰음을 보여줍니다.

이 기술을 통해 암 및 유전자 치료 분야의 과학자들은 재조합 벡터 바이러스의 생산 규모를 더욱 확장할 수 있습니다. 바이오리액터를 사용하면 임상 환경에서 필요로 하는 대량의 변이체들을 생산할 수 있습니다.