Name: 를 사용하여 화합물 Bioactivity위한 이점 Nanoinjection 및 화면에 대한 전기 생리학 분석 Drosophila melanogaster 거대 섬유 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster 거대 섬유 시스템에서 나노주입과 전기생리학 기록을 활용한 화합물 생물활성 분석 방법입니다. 이 기법은 신경조절 화합물의 실시간 효과를 평가하여 신경회로 연구와 신약 개발에 활용됩니다.

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우리는 특히 일직선으로하다 요네자와에 마리 실험실과 Godenschwege 실험실의 구성원을 인정하고자, 의견 및이 프로토콜과 함께 도움이 될 것이다. 이 작품은 신경계 장애 진흥원과 FM 및 태그 스트로크 부여 R21NS06637 추진하는 사업, AB는 국립 과학 재단 보너스 번호 082925, URM 추진하는 사업 : 미래의 연구자를위한 통합 생물학.

1. 전기 생리학 조작 설정 - 업 <ol><li> 전기 생리학의 장비 설정을위한 필수 장비는 오거 스틴 외 의해 자세하게 설명되어 있습니다. 이 저널 14인치 필요한 electrophysiological apparatuses의 자세한 설명은이 문서를 참조하십시오. </li><li> nanoinjector을 보유하고 육분의 일 micromanipulator을 추가하여 이전에 설명한 전기 생리학 장비 설정 14 수정합니다. 그림 2에 표시된대로 그것은 두 개의 자극 전극 마이크로 사이에 위치해야 동물의 머리에 쉽게 액세스할 수. </li><li> 실험을 시작하기 전에, 당신은 모든 마이크로와 회전의 모든 축에 편안한 범위를 가지고 있는지 확인하고, 모든 전극뿐만 아니라 사출 micropipette은 (단계 2 참조) 동물에 도달할 수있다. </li></ol> 2. Nanoinjection 설정 <ol><li> nanoinjection는 설정 Nanoliter2000 (세계 Precisi 필요합니다계측기에, 사라소타, FL, 미국) 또는 nanoliter 수량에 제어된 주입을 허용 인젝터 비슷한 유형입니다. </li><li> 전극 풀러와 MΩ 80-100의 저항에 벗어서 주입기와 함께 제공된 유리 micropipettes를 사용하여 주사 바늘을 준비합니다. </li><li> 부드러운 주사의 경우 그것은 베벨 각도는 45도 이내에서 11-17 μm의 개구 (그림 3)에 micropipettes을해야합니다. </li><li> 천천히 Nanoliter2000 설명서의 지시에 따라 합성 오일은 기포가 존재하지 않는다는 보장, 해밀턴 주사기를 이용한 사출 micropipette를 backfill. </li><li> 조심스럽게 nanoinjector에 micropipette를 확보하고 Nanoliter2000 설명서의 지시에 따라 여분의 기름을 비우는하여 화합물을로드하기 위하여 그것을 준비합니다. </li><li> micromanipulator에 주입기를 삽입하고 Nanoliter2000 설명서에 지시에 따라 혼합물을로드합니다. micropipette의 일각이 도중에 침입하지 않도록절차. </li><li> Nanoliter2000 설명서의 지시에 따라 인젝터의 제어 상자에 주입되는 nanoliters의 원하는 금액을 설정합니다. 총 금액의 주입 100 NL을 초과하지 말아야합니다. 우리는 식염수 제어 솔루션의 큰 수량은 GFS 회로의 기능에 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다. </li><li> 그것은 nanoinjector의 전원 공급 장치가 배경 잡음 (그림 4)로 표시 음반, 방해 때문에 인젝터가 분사 자체의 예외로 녹화 수집하는 동안 컨트롤 박스에서 분리해야하는 것이 중요합니다. 그것을 다시 설정합니다 그러나 컨트롤 박스에 전원 공급 장치를 분리하지 않습니다. </li></ol> 3. Drosophila melanogaster 준비 <ol><li> 이전에 14,15을 설명한대로 CO 2와 함께 또는 얼음 2-6일 오래된 파리를 마취. </li><li> 일단 고정되어 있으며, 작은 접시 부로 동물을 전송하는 족집게 한 켤레를 사용그 다리에서 데리러하여 일 소프트 치과 왁스. 남성 과일 파리가 1.0에 대한 MG 무게와 암컷 과일 파리가 1.2 밀리그램에 대해 무게, 따라서 화합물 - 투 - 체중 비율은 남성 대 여성의 파리에서 다르다는 것을 유의하시기 바랍니다. 따라서, 그것은 실험을 위해 단 한 성별을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 이전에 14,15을 설명한 바와 같이, 신중 플라이 지느러미 측면을 탑재하고 흉부와 머리가 몸 주위에 배치 부드러운 치과용 왁스로 고정되어 있는지 확인하십시오. 조심스럽게 그들이 흉부 (그림 2, C)에 수직 누워 있도록 날개를 펼쳐. 파리는 가능한 한 작은 손상으로 함께 장착되어야합니다. </li></ol> 4. 이점 Nanoinjection / 전기 생리학 <ol><li> 자극 전극쪽으로 머리와 전기 생리학의 장비에 탑재된 파리를 놓습니다. </li><li> 이전에 14,15 (F를 설명하는 것처럼 해당 자극, 지상 및 녹음 전극과 동물을 찌르려고igure 2, C). TTM 근육에 DLM 및 기타에 달리 원하는 않는 한, 한 기록 전극. DLM 근육은 앞쪽에 Dorso - 중앙 머리카락과 파리의 중간선 사이의 흉부에 위치하고 있습니다. TTM 근육은 플라이 7의 뒷부분과 앞부분 위에 - 날개의 머리카락 사이에 날개 첨부 근처에 위치하고 있습니다. </li><li> 머리 중간 후부 부분에 위치하고 있지만 (그림 2, C) 아직 주입되지 않는 세 ocelli의 중심에있는 화합물을 포함하는 사출 micropipette을 맞춥니다. </li><li> 복합 주입 뇌 자극을 통한 거대 섬유 시스템 (GFS, 그림 1)의 경로를 DLM하는 TTM과 GF에 GF의 기준 녹음을 구하십시오. 전에 이렇게하려면, 10 자극의 10 열차 (40-50 MV) 열차 14,15 (그림 4) 사이에 일초 지연이 100 Hz에서에서 0.03 MS의 기간 동안 주어진 각각 자이언트 섬유 (GFS) 활성화합니다. 야생 유형 sh를 날아ould는 DLM 및 TTM 경로 모두에 자극이 비율로 일대일을 수행하실 수 있습니다. TTM 경로에 DLM과 GF에 GF가 1:1 비율에서 100 Hz에서의 자극을 수행하지 않을 경우 즉시 폐기하십시오. </li><li> 하나의 Hz에서에서 단일 펄스 (그림 4)와 GF의 지속적인 자극으로 전환합니다. </li><li> 신속하게 제어 상자에 주입기를 연결합니다. 배경 잡음은 1 Hz에서 자극의 녹음에 방해가됩니다하더라도, 그것을 중단하지 않습니다. </li><li> 단지 cuticule 아래 플라이의 머리 캡슐로 사출 micropipette를 신중을 삽입하고, 1 Hz로의 자극 (그림 4)을 유지하면서 플라이의 hemolymph으로 화합물의 원하는 금액을 투입. 파리의 개방 순환 시스템으로 인해, 전체 신경계는 초 이내에 화합물에 노출됩니다. 특정 분사 사이트 hemolymph로 화합물을 제공하는 중요한 아니지만, 우리가 집중되는 ocelli의 영역을 찾아D 화합물의 신속하고 심지어는 배포판에 이르게 쉽게 주사를 허용 편리한 사이트로 헤드 캡슐의 가장 지느러미 옆으로에서 중간. </li><li> 즉시 주사의 사이트에서 사출 micropipette를 제거하고 최대 주입 후 1 분 (그림 4)에 1 Hz에서 GF의 자극을 계속하는 동안 컨트롤 상자에서 인젝터를 뽑습니다. </li><li> GFS에 대한 화합물의 더 미묘한 효과를 공개하기 위해서는 열차 사이의 일초 지연이 100 Hz에서 10 자극의 10 열차와 자이언트 섬유 (GFS)을 강조. 최대 15 분 (그림 4)이 패러다임은 5 분 간격으로 GF 경로의 기능을 테스트하기 위해 계속합니다. 그러나, 짧은 간격 이상 모니터링 기간도 가능합니다. </li><li> 화합물 GFS의 신경근육학 분기점 (NMJs)에서 효과를 가지고 있으며, 가능한 화합물의 효과를 좁혀 여부를 테스트하기 위해서는 모터 뉴런 direc를 활성화하기 위해 진행tly 흉부 자극에 의​​해. 100 Hz에서 10 자극의 10 전차와 모터 뉴런을 자극하기 위해 이런 내용 눈에서 자극 전극을 제거하고 흉부의 앞부분 양쪽에 그들을 대체합니다. </li></ol> 참고 : 동영상에 표시되는 전기 생리학의 흔적은 순수한 염료 주입의 효과에 해당하지 않습니다. 5. 대표 결과 거대한 광섬유 시스템의 시냅스를 DLM하는 PSI에 대한 길항제의 영향 Methyllycaconitine 구연산 (행방이 묘연)는 α7 nAChR의 subtypes 특정입니다 nAChR 길항제이다. Dα7 nAChR의 나눠 봤는데요의 유전자 제거 GF-TTM 경로 5,6에 아무런 영향을 미치지 않습니다 동안 GF-DLM 경로에서 시냅스를 DLMn하는 PSI는 적절한 기능을 위해 Dα7 nAChR에 나눠 봤는데요에 따라 다릅니다. 우리의 분석의 특이성과 감도를 입증하기 위해 우리는 다양한 농도 (0, 0.02, 0.04, 0에서 행방이 묘연 주입.식염수 치료를 위해 N = 15); 08, 0.12 NG / MG 46 NL들은 동물의 머리 (N = 10 화합물 처리 당에) 주입. 오직 수컷 파리는 (야생 유형 유전자형 야생 10E의)이 사용되었으며, 화합물의 효과는 주사 후 15 분 총 감시되었다. 그림 5는 기준 주입하기 전에 얻은 녹음과 행방이 묘연하고 염분 제어 솔루션에 대한 응답으로 주입 후 얻은 이들의 차이를 묘사. 우리는 행방이 묘연의 주입은 GF-TTM 경로가 영향을받지 남아있는 동안 두뇌에 GFS의 stimulations 100 Hz에서에서 일대일을 따르도록 GF-DLM 경로의 무능력 결과 발견. (그림 5, 상위 및 중간 추적, 데이터가 아닌 파라메 트릭 [테스트 정상과 동등한 차이]가있는 경우를 제외 염분 조절 [0 NG / MG]과 각 시점에서 행방이 묘연의 서로 다른 농도 사이의 수행한 T-테스트, 그렇지 않으면 우리가 사용하는 맨 - 휘트니 순위 합 테스트. * P &lt;0.001). 그러나 일대일 R모터 뉴런은 (그림 5, 하단 트레이스)에 직접 자극을 때 DLM의 esponse은 DLM과 TTM의 NMJ 함수가 행방이 묘연의 영향을받지 않는 것을 보여주 관찰되었다. 행방이 묘연은 더 이상 큰 변화는 시험 기간 중 다음과 같은 십오분 동안 언급되지 않았습니다로서, 0.04, 0.08 및 0.12 NG / 주입 행방이 묘연의 MG에 대한 주입 후 최대 효과 1 분 도달하는 것처럼 보였다. 강한 반응은 0.12 NG / MG의 높은 복용량에 관찰되지 않은 이후 더욱이 화합물은 0.08 NG / MG에서 최대 효과에 도달했습니다. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. 거대 섬유 시스템 자이언트 섬유 시스템 (GFS)의 다이어그램. (녹색으로 표시 PSI) 자이언트 섬유 (빨간색으로 표시된 GFS) 전기적 시냅스 (갭 분기점)뿐만 아니라 화학적 (cholinergic)쪽으로 주변 Synapsing의 Interneuron과 Tergo Trochanteral 근육 신경 세포 (TTMn, 노란색으로 표시) 5. PS나는 DLMn (파란색으로 표시된 지느러미 세로 근육 신경 세포) 연결로 Dα7 nAChR의 나눠 봤는데요 6 달려 있습니다. 마지막 점프 (TTM, 자주색으로 표시)과 비행 근육쪽으로 TTMn 및 DLMn (DLM, 보라색에 표시된)의 신경근육학 접합 (NMJ)는 glutamatergic입니다. 참고 : PSI 연결에 GF는 전기 화학 모두이다. 그러나 shakB 뮤턴트 (갭 분기점이 결여되어있는)에 응답은 전기적 연결의 부재의 화학 구성 요소의 동작 가능성을 연상하기에 충분 아니라는 것을 보여주는, 두뇌에있는 GFS의 자극에 따라 DLM에서 녹화한 수 없습니다 PSI 5,16-18. PSI 연결에 GF가 갭 접합에 의존하기 때문에,이 그림은 단순상의 이유로 시냅스에서 유일한 갭 접합을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 마이크로의동부 표준시 - 업. <ol class="ualpha"><li> 이전에 다음 ID로 출판 프로토콜 14 수정된 설정은 동시 nanoinjections와 결합하여 GFS 녹음을위한 사출 micromanipulator에 맞도록 사용됩니다. 탑재 비행 준비는 실험자쪽으로 플라이의 머리를 지향하고 있습니다. 사출 micromanipulator은 (# 1) 텅스텐 자극 전극 (2 #와 # 3)에 대한 두 manipulators 사이 실험자 앞에 위치합니다. 유리 기록 전극 (# 4, # 5)에 대한 두 개의 마이크로는 각각 왼쪽과 오른쪽에 배치됩니다. 텅스텐 접지 전극 (# 6)에 대한 micromanipulator이 중 왼쪽 (여기서는 그림 참조) 또는 오른쪽 뒤로 멀리 배치됩니다. </li><li> 다양한 전극 및 사출 micropipette의 배열의 맨에서 가까이가 볼 수 있습니다. </li><li> 제대로 마운트 디 melanogaster은 전극과 주사 준비 사출 micropipette에 찔려 죽은. 주의 그 동물의 사체수평의 흉부 및 그 날개와 함께 장착되어 밖으로 퍼졌다. 왁스는 안전하게 이동에서 동물을 방해하고 그 몸을 감싸됩니다. 또한 접지 전극 (# 6, 복부), 유리 기록 전극 (짙은 윤곽선으로 강조 흉부의 # 4, # 5,,), 그리고 자극 전극 (# 2, # 3, 각각의 눈을 한 이전 14 설명된대로), 장소에 찔려 죽은됩니다. 사출 micropipette (# 1) 적절히 세 ocelli (동그라미)의 중앙에 정렬합니다. 사출 micropipette의 삽입이 지역에 배치해야합니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. Beveled 사출 micropipette가. 제대로 beveled micropipette의 그림이 여기에 표시됩니다. 전극 개막은 45도 각도로 beveled과 11-17 μm의 사이에 개통이되어야한다. 적절한 beveled 사출 micropipette 최소한의 D와 부드러운 분사 데 중요파리에 amage. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig4.jpg" alt="그림 4" /> 4 그림. nanoinjection / 전기 생리학 프로토콜의 전체 구조. nanoinjection / 전기 생리학 프로토콜에 대한 전반적인 계획의 대표적인 다이어그램. 열 자극에 각각 (한 기차가 여기에 표시)의 10 열차 100 Hz에서에서 자이언트 섬유 (GFS)을 자극하여베이스 라인 녹음을 얻어 시작합니다. 주입 전에 떨어져 1 Hz에서 제품 stimulations 잠깐만 시작합니다. 주입 시간 (인젝터는 컨트롤 박스에 연결하는 동안) 동안 중대한 배경 잡음을 관찰할 수 있지만, 레코딩을 중단하지 않습니다. 주입 후 (그리고 인젝터는 컨트롤 박스에서 분리), 약 1 분 정도 더를위한 1 Hz로의 자극을 계속합니다. 마지막으로, 100 Hz에서 10 자극의 10 열차와 GFS를 스트레스와 최대 15 분이 패러다임 5 분 간격으로 GF 경로의 기능을 테스트하기 위해 계속해서 진행합니다. 참고 : 녹음 w감수해야은 전반적인 구조를 만들 수 조작해서 얻은 구체적인 결과를 대변하지 않습니다. 아니라 스케일까지, 모든 트레이스가 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3597/3597fig4large.jpg">큰 이미지를 보시려면 여기를 클릭하세요</a> . <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. GFS의 행방이 묘연의 효과. <ol class="ualpha"><li> 다양한 농도 (0, 0.02, 0.04, 0.08,에서 과일 파리의 GF-DLM 경로에 α7 nAChR 길항제 Methyllycaconitine의 구연산 (행방이 묘연)의 효과의 그래픽 묘사 0.12 NG / MG N = 10 화합물 처리 당.; N 식염수 치료 = 15). 주사 후 딱 1 분이는 중요하고 즉각적인 효과가 행방이 묘연의 0.04 NG / MG로 보였다. 큰 영향은 또한 GFS의 100Hz 자극에 0.8ng/mg와 행방이 묘연의 0.12ng/mg 같이 있던 아이. 어떤 중요한 차이점은 식염수 컨트롤과 행방이 묘연의 0.02 NG / MG 사이에 언급되지 않았습니다. 또한, 전을 변경할 없습니다N 효과 (15 분) 테스트 기간 동안 일분 게시물 주입 후 보였다. T-테스트는 염분 조절 (0 NG / MG)와 각 시점에서 행방이 묘연의 서로 다른 농도 사이에 수행되었다. SEM * P &lt;0.001 - 레벨은 + / - 의미로보고됩니다. </li><li> 100 Hz에서의 자극에 DLM 응답 샘플 흔적. 톱 추적 뇌의 GF의 자극시 행방이 묘연 주입하기 전에 근육의 반응을 보여줍니다. 근육 각 자극 100 Hz에서에서 일대일로 대응할 수납니다. 중동 성분은 행방이 묘연 주사 (0.12 NG / MG) 이후 DLM의 응답을 표시합니다. 근육 각 자극 100 Hz에서에서 일대일로 대응할 수 없다는 것을 알 수 있습니다. (별표). 하단 추적 흉부의 모터 뉴런의 직접적인 자극시 동일한 준비 (0.12 NG / MG)의 DLM의 반응을 보여줍니다. DLM은 흉부 자극 100 Hz에서에서 일대일을 응답하기 때문에 뇌 stimulations과 응답의 실패는 cholinergic PSI-DLMn 연결에 의한 것이. </li><li> GF-TTM 경로에 따라 달라질 행​​방이 묘연의 농도 (0, 0.02, 0.04, 0.08, 0.12 NG / MG)와 효과의 그래픽 묘사. 더 중요한 효과는 언제든지 지점에서 염분 (0 NG / MG) 및 복합 주사 사이에 본 적이 있었다. T-테스트는 * P &lt;0.001, 각 시간 지점에서 염분 조절 (0 NG / MG)와 행방이 묘연의 서로 다른 농도 사이에 수행되었다. </li><li> 100 Hz에서의 자극에서 TTM 응답 샘플 흔적. 톱 추적 두뇌에 자극을 가진 GF 활성화시 행방이 묘연 주입하기 전에 근육의 반응을 보여줍니다. 근육은 100 Hz에서에서 모든 자극에 응답할 수 있는지 확인합니다. 중동 성분은 행방이 묘연 주사 (0.12 NG / MG) 후 DLM의 반응을 보여줍니다. TTM 근육에서 두뇌의 GF의 자극에 대한 응답은 일대일 남아 있습니다. 하단 추적 흉부의 모터 뉴런 (0.12 NG / MG) 100 Hz로의 자극에 동일한 준비 TTM의 반응을 보여줍니다. </li></ol>

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<li>Thomas, J. B., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+altering+synaptic+connectivity+between+identified+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila.</a> J. Neurosci. 4, 530-538 (1984).</li>
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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

여기서 제시 nanoinjection / 전기 생리학 bioassay은 과일 파리의 신경계에있는 화합물의 신속한 상영을 허용합니다. 이것은 잘 특성화의 연결 회로에서 분자 표적의 다양한 효과를 유도 화합물의 소량을 필요로 생체내 기법의 소설이다. 이 방법은 알 수없는 독소에서 상용 pharmacological 중개사에게 서로 다른 화합물의 bioactivity을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 여기 과일 파리의 거대한 섬유 시스템 (GFS) (그림 5)에 영향을 미쳤다 행방이 묘연 사용하여 우리의 분석의 기능을 보여주었다. 우리는 선택적으로 TTM 경로에 GF을 DLM 경로에 GF을 낫게 아닌 것으로 나타났습니다. DLM 경로로 GF에 결함이 신경근육학 접합 (NMJ)에서 장애로 인해 아니었지만 적대 effec와 일치하는 것을 보여주 흉부 자극을 통해 직접 모터 뉴런 활성화Dα7 nAChR의 subtypes의 행방이 묘연의 T...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 녹음 유리 전극 : borosilicate 유리 모세관 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 1B100F-4 </td><td> 1.0mm OD, 0.58mm ID </td></tr><tr><td> 자극기 </td><td> 잔디 인 스트 루먼트 </td><td> 모델 S48 </td><td></td></tr><tr><td> 증폭기 </td><td> 인스 트루먼 트의 주식을 얻는 </td><td> 모델 5A </td><td></td></tr><tr><td> 데이터 수집 소프트웨어 : Digidata </td><td> 분자 장치 </td><td> 모델 1440A </td><td></td></tr><tr><td> 데이터 수집 소프트웨어 : pCLAMP </td><td> 분자 장치 </td><td> 버전 10 </td><td></td></tr><tr><td> Stereomicroscope with 광섬유 현미경 링 조명기 </td><td> AmScope </td><td> SM-4T 모델명 HL250-AR </td><td></td></tr><tr><td> 장착에 대한 범위를 해부 </td><td> AmScope </td><td> SM-2TZ </td><td></td></tr><tr><td> 연 수동 Micromanipulator 및 기울이기 자료 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 모델 # M3301 연 : 모델 # 연을-M3-L </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila melanogaster 야생 10E의 유전자형 (야생 형 변종) </td><td> 블루밍턴 증권 센터 </td><td> 주식 # 3892 </td><td></td></tr><tr><td> 수직 피펫 풀러 </td><td> 데이비드 Kopf 인 스트 루먼트 </td><td> 700c 모델 </td><td></td></tr><tr><td> 사출 유리 micropipettes : Borosilicate 유리 모세관 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 카탈로그 # 4878 </tD&gt; <td> 1.14mm OD, 0.5mm ID </td></tr><tr><td> 실리콘 오일 </td><td> 어부 </td><td> 카탈로그 # S159-500 </td><td></td></tr><tr><td> Beveler </td><td> 셔터 악기 (주) </td><td> KT 브라운 유형 모델 # BV-10 </td><td></td></tr><tr><td> Nanoliter2000 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 카탈로그 # B203XVY </td><td></td></tr><tr><td> 파란색 식용 색소 </td><td> 맥코믹 </td><td> N / A </td><td> 성분 : 물, 프로필렌 글리콜, FD &amp; C 파랑 1, 0.1 % 항균제 (방부제). </td></tr><tr><td> Methyllycaconitine 구연산 (행방이 묘연) </td><td> Bioscience Tocris </td><td> 카탈로그 # 1029 </td><td></td></tr><tr><td> 플라스틱 왁스 스틱 </td><td> Hygenic 공사 (Akron 오하이오주 미국) </td><td></td><td></td></tr></tbo다이&gt; </table>

를 사용하여 화합물 bioactivity위한 이점 nanoinjection 및 화면에 대한 전기 생리학 분석 drosophila melanogaster 거대 섬유 시스템

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

생체내 활동에 대한 심사 화합물은 pharmacological 대리인의 1,2로 발전 수 있습니다 후보자를 식별하기위한 첫 단계로 사용할 수 있습니다. 우리는 mediates Drosophila melanogaster 3,4에서 탈출 반응의 연결 회로의 기능에 대한 화합물의 bioactive modulatory 효과의 검출을 허용 소설 nanoinjection / 전기 생리학 분석을 개발했습니다. 우리 Drosophila 자이언트 섬유 시스템 (GFS, 그림 1)과 같은 작은 분자 또는 펩티드와 같은 화합물, 여러 종류의 검사를 허용 사용하고, 오직 최소한의 수량이 효과를 이끌어내는 데 필요한 생체내 분석, 인치 또한, Drosophila GFS는 신경이나 근육에있는 잠재적인 분자 표적의 큰 다양성을 제공합니다. 주변 Synapsing Interneuron (PSI)과 Tergo Trochanteral 근육 신경 세포 (TTMn) 5 진입 화학적으로 거대 섬유 (GFS)은 전기 시냅스 (갭 분기점)뿐만 아니라 (cholinergic) </&gt;를 한모금. DLMn (지느러미 세로 근육 신경 세포) 연결에 대한 PSI는 Dα7 nicotinic 아세틸콜린 수용체 (nAChRs) 6에 따라 다릅니다. 마지막으로, 점프 (TTM)과 비행 근육 (DLM)와 TTMn과 DLMn의 신경근육학 분기점 (NMJ)는 7-12 glutamatergic 있습니다. 여기서는 자이언트 섬유 시스템 13 어떻게 회로의 기능에 대한 화합물의 효과를 모니터링하는 방법에서 electrophysiological 세포내 음반을 획득하면서, 화합물의 nanoliter 수량을 주입하는 방법을 보여줍니다. 우리는 연결을 DLMn 위해 PSI 있지만 연결 또는 점프 또는 비행 근육에 NMJ의 기능을 TTMn하는 GF을 방해 methyllycaconitine의 구연산 (행방이 묘연), nAChR 길항제와 분석의 특이성을 보여줍니다. 이 동영상을 시작하기 전에 당신이주의 깊게보고 D. melan의 거대한 섬유 통로에서 &quot;Electrophysiological 레코딩라는 주피터 비디오 친숙해지 것이 중요합니다동영상이 여기에 제시된대로 오거 스틴 외 7에서 ogaster는 &quot;이 기존의 기법에 대한 확장으로 만들어졌습니다. 여기서만 이점 nanoinjections 및 모니터링 기술의 추가에 상세히 electrophysiological 녹음 방법과 초점을 사용합니다.

급속한<em&gt; 생체내에서</em&gt; 검정의 거대한 섬유 시스템 (GFS)를 사용 neuromodulatory 화합물을위한 테스트<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;이 설명되어 있습니다. GFS의 electrophysiological 기록과 함께 동물의 머리에 Nanoinjections는 신경이나 근육에있는 화합물의 bioactivity를 공개하실 수 있습니다.

를 사용하여 화합물 Bioactivity위한 이점 Nanoinjection 및 화면에 대한 전기 생리학 분석 Drosophila melanogaster 거대 섬유 시스템

in vivo 활성을 위한 화합물 스크리닝은 약물로 개발될 가능성이 있는 후보 물질을 식별하는 첫 단계로 활용될 수 있습니다1,2. 우리는 ...

본 영상에서는 거대 섬유 시스템(giant fiber system)으로부터 전기생리학적 기록을 얻는 동시에 화합물을 리터 단위의 양으로 주입하는 방법과, 해당 화합물이 이 회로의 기능에 미치는 영향을 모니터링하는 방법을 보여드리겠습니다. 본 영상을 시작하기 전에, Augustine 등이 제작한 'Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of the Melanogaster'라는 제목의 JoVE 영상을 주의 깊게 시청하여 숙지하는 것이 매우 중요합니다. 본 영상은 기존 기술의 확장판으로 제작되었으므로, 전기생리학 장비 설치에 필요한 장비는 Augustine 등의 논문에 상세히 설명되어 있습니다. 본 저널에서는 기존에 설명된 전기생리학 장비 설치 구성에 아노-인젝터(ano injector)를 고정하는 여섯 번째 마이크로 매니퓰레이터를 추가하여 수정하였습니다.동물의 머리에 쉽게 접근할 수 있도록, 동물을 두 개의 자극 전극 마이크로 매니퓰레이터 사이에 배치해야 합니다. 나노 주입 설정에는 nanoliter 2000 또는 유사한 유형의 주입기가 필요하며, 주입기와 함께 제공된 유리 마이크로 피펫을 전극 풀러(electrode puller)로 80 to 100 megas의 저항값이 되도록 당겨서 주입 바늘을 준비합니다. 원활한 주입을 위해 마이크로 피펫의 끝을 45도 각도로 깎아 11 to 17 µm 크기의 개구부를 만들어야 합니다.Nanoliter 2000 매뉴얼의 지침에 따라 Hamilton 시린지를 사용하여 주입용 마이크로 피펫을 합성 오일로 천천히 역충전하고, 공기 방울이 없는지 확인하십시오. 마이크로 피펫을 나노 인젝터에 조심스럽게 고정하고, Nanoliter 2000 매뉴얼의 로드 지침에 따라 과잉 오일을 비워 화합물을 로드할 준비를 하십시오. Nanoliter 2000 매뉴얼의 지침에 따라 화합물을 준비하십시오.이 과정 중에 마이크로 피펫 팁이 파손되지 않도록 주의하십시오. NANOLITER 2000 매뉴얼의 지침에 따라 인젝터 제어 박스에 주입할 나노리터 양을 설정하십시오. 총 주입량은 100 nanoliters를 초과해서는 안 된다는 점에 유의하십시오.두 개의 자극 전극 마이크로 매니퓰레이터 사이에 Nanoliter 2000을 마이크로 매니퓰레이터에 장착합니다. 주입 과정 자체를 제외하고, 기록 데이터 수집 중에는 컨트롤 박스에서 인젝터를 분리하십시오. 단, 컨트롤 박스의 전원 공급 장치를 분리하면 설정이 초기화되므로 전원은 연결된 상태로 유지하십시오. 앞서 설명한 대로 CO2 또는 아이스로 2~6일 된 파리를 마취시킵니다.동물이 이동 가능한 상태가 되면, 앞서 설명한 대로 다리 부분을 집어 핀셋을 사용하여 부드러운 치과용 왁스가 놓인 작은 플레이트로 동물을 옮깁니다. 파리의 등 쪽이 위로 향하게 조심스럽게 고정하고, 몸 주변에 부드러운 치과용 왁스를 배치하여 흉부와 머리가 움직이지 않도록 합니다. 날개가 흉부에 수직이 되도록 조심스럽게 펼쳐 줍니다.마운트된 초파리를 전극이 머리 쪽을 향하도록 전기생리학 장치에 배치하고, 해당 자극 전극, 접지 전극 및 기록 전극으로 동물을 찌릅니다. 이전에 설명한 바와 같이, DLM 근육은 초파리의 전방 등쪽 중앙 털과 중앙선 사이의 흉부에 위치합니다. TTM 근육은 초파리의 후방 및 전방 내측 털과 내측 상익 털 사이의 날개 부착 부위 근처에 위치합니다. 화합물이 들어 있는 주입용 마이크로 피펫을 머리의 내측 후방 부위에 위치한 3개의 osli 중심에 맞추되, 아직 주입하지는 마십시오. 화합물을 주입하기 전, 100 Hz에서 10회 자극으로 구성된 10개의 트레인으로 거대 섬유를 활성화하여 뇌 자극을 통해 거대 섬유 시스템의 거대 섬유-TTM 및 거대 섬유-DLM 경로의 기선 기록을 얻습니다.열차 사이에 1초의 지연 시간을 둡니다. 야생형 초파리는 DLM 및 TTM 경로 모두에서 이 자극 속도로 일대일 추적을 할 수 있어야 합니다. 이후 초파리를 폐기하십시오.DLM으로 향하는 거대 섬유 및 TTM으로 향하는 거대 섬유 경로가 100 Hz 자극에 1:1 비율로 반응하지 않는 경우, 거대 섬유에 대해 1 Hz의 단일 펄스를 이용한 연속 자극으로 전환하십시오. 배경 소음이 1 Hz 자극 기록을 방해하더라도 제어 박스에 인젝터를 신속하게 연결하십시오.조심스럽게 중단하지 마십시오. 주사용 마이크로 피펫을 초파리 머리 캡슐의 표면 바로 아래에 삽입하십시오. 1 Hz 자극을 유지하면서 원하는 양의 화합물을 주입하십시오.주입 후 1분까지 1 Hz의 거대 섬유 자극을 계속 유지하면서, 주입 장치 세트에서 주입용 마이크로 피펫을 즉시 제거하고 컨트롤 박스에서 주입기를 분리하십시오. 화합물이 거대 섬유 시스템에 미치는 더 미세한 효과를 확인하기 위해, 100 Hz의 자극 10회로 구성된 트레인을 1초 간격으로 10회 반복하여 거대 섬유에 스트레스를 가하십시오. 15분이 될 때까지 5분마다 이 패러다임으로 거대 섬유 경로의 기능을 계속 테스트하십시오.여기에 제시된 예시에서, 화합물 주입 후 giant fiber에서 TTM으로 이어지는 경로는 영향을 받지 않은 반면, giant fiber에서 DLM으로 이어지는 경로는 영향을 받았습니다. 화합물이 giant fiber 시스템의 신경근 접합부(neuromuscular junctions)에 영향을 미치는지 테스트하고 화합물의 작용 범위를 좁히기 위해, 흉부 자극을 통해 운동 신경원을 직접 활성화하십시오. 자극 전극을 눈에서 제거하여 흉부 앞쪽에 다시 배치한 후, 100 hertz에서 10회 자극으로 구성된 10개 트레인(train)으로 운동 신경원을 자극합니다. 본 예시에서는 뇌를 통해 자극이 전달될 때 DLM 경로가 안정적으로 작동하지 않습니다.하지만 100 Hz의 흉부 자극에 대해 DLM 신경근 접합부 반응이 일대일로 나타난다면, 주입된 화합물의 특정 표적으로서 신경근 접합부는 제외되며, 화합물의 표적은 거대 섬유에서 PSI로 또는 PSI에서 DLM 운동 뉴런으로 이어지는 연결 부위로 좁혀질 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기 Drosophila의 유충의 신경근육학 교차점에서 시냅스 전송을 측정 electrophysiological 방법을 설명합니다. Evoked 릴리스는 모터 신경의 axons을 자극하여 인공적으로 시작되며, NMJ을 통해 전송은 근육에 evoked postsynaptic 반응에 의해 측정할 수 있습니다.

Drosophila의 애벌레의 NMJ에서 시냅틱 후보를 녹음 Electrophysiological 방법

고주파 전기 자극 압수와 같은 활동을 사용하는 것은에서 유도된 수...

의 간질 발작의 돌연변이에 대한 Neurocircuit의 Assays Drosophila</em

에 Electrophysiological 녹음 Drosophila 엠브료

거대한 섬유 시스템은 성인의 간단한 회로의...

의 거대한 섬유 패스에서 Electrophysiological 레코딩 D. melanogaster</em

이 프로토콜의 목표는 중형 규모 (0.5-1g)에서 초파리 ( Drosophila) 배아를 수집하고 친화도 정화 - 질량 분광 분석 (AP-MS)과 같은 하류의 단백질 응용 분야에서 사용할 수있는 단백질 추출물을 제조하는 간단하고 저렴한 접근법을 제공하는 것입니다 ).

중간 규모의<em&gt; Drosophila</em&gt; 프로테옴 실험을위한 배아 추출물

이 프로토콜 비용 효율적이 고 편리한 약리학 대리인, 신경 단백질의 유전자 돌연변이의 테스트를 가능 하 게 초파리 melanogaster 중앙 신경 시스템의 하강 전기 활동을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 또는 미개척된 생리 적인 통로의 역할입니다.

제 3-탈피 초파리 Melanogaster 의 중앙 신 경계 활동의 electrophysiological 녹음

우리는 Drosophila melanogaster에있는 신경 변성을 전시하는 돌연변이를 위한 스크린에 전방 유전 접근을 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 그것은 궁극적으로 신경 보호의 프로세스와 관련있는 새로운 유전자를 확인하기 위하여 등반 분석, 기관학 분석, 유전자 매핑 및 DNA 순서를 통합합니다.

소독멜라노가스터에서 새로운 신경보호 유전자를 식별하기 위한 생체 전방 유전자 스크린

현재 프로토콜은 속도, 거리 등의 매개변수를 계산하기 위해 고화질 비디오 녹화를 기반으로 각 프레임의 픽셀을 분할하는 플러그인과 호환되는 오픈 소스 소프트웨어 피지를 사용하여 손으로 만든 경기장에서 파리의 움직임을 추적 및 분석하여 초파리 의 운동 활동을 평가합니다.

초파리에서 운동 활동을 분석하는 간단한 기술

여기에서는 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합된 이 프로토콜은 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 유전자 스크리닝 및 미세소관 역학 분석을 크게 용이하게 합니다.

초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

이 프로토콜은 전통적인 포유류 모델에 대한 대안으로 운동 기능 장애의 정량화를 통해 초파리의 신경 독성을 평가하기 위한 고처리량, 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 민감하고 재현 가능하며 윤리적으로 유리한 모델을 사용하여 제약 화합물, 환경 제제 또는 유전자 변형의 신경독성 영향을 평가하는 것을 목표로 합니다.

신경독성에 대한 판독으로서의 Drosophila melanogaster 의 운동 기능 장애에 대한 행동 분석

학습하세요 Drosophila melanogaster 거대 섬유 시스템에서 나노주입과 전기생리학 기록을 활용한 화합물 생물활성 분석 방법입니다. 이 기법은 신경조절 화합물의 실시간 효과를 평가하여 신경회로 연구와 신약 개발에 활용됩니다.

를 사용하여 화합물 Bioactivity위한 이점 Nanoinjection 및 화면에 대한 전기 생리학 분석 Drosophila melanogaster 거대 섬유 시스템

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