RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

다음 실험의 전반적인 목표는 QPCR 또는 고처리량 시퀀싱을 이용하여 특정 비코딩 RNA와 연관된 DNA 영역을 결정하는 것입니다. 이는 세포를 교차 결합하여 생체 내(in vivo)에서 천연 D-N-A-R-N-A 상호작용을 포착함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로 세포를 용해하고 초음파 처리를 하여 세포 용해물을 가용화하고 크로마틴을 작은 조각으로 절단합니다.

다음으로, 관심 있는 RNA-DNA 복합체를 특이적으로 농축하기 위해 비오틴화된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 세포 용해물에 첨가하며, qPCR 또는 고처리량 시퀀싱을 통해 비코딩 RNA가 결합된 게놈 부위의 정체를 규명하는 결과를 얻습니다. RNA-DNA FISH와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, CHIRP를 통해 염기쌍 수준에 가까운 해상도로 비코딩 RNA 결합 부위의 게놈 전역 지도를 작성할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 roX RNA와 수컷 초파리가 어떻게 용량 보상을 달성하는지와 같은 비코딩 RNA 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

이 기술은 비코딩 RNA가 염색질 상태와 유전자 발현을 어떻게 조절하는지 더 잘 이해할 수 있게 해주므로, 비코딩 RNA 관련 질환의 치료법 개발에 기여할 수 있습니다. RNA 정제 또는 CHIRP 실험을 통한 염색질 분리를 위해, 원심분리 후 4,000만 개의 세포를 수확하고, PBS를 따라낸 뒤 남은 액체를 각도를 조절하여 조심스럽게 흡입해 제거합니다. 팰콘 튜브 바닥을 가볍게 두드려 세포 펠렛을 떼어냅니다. 새로 조제한 1% glutaraldehyde를 소량부터 첨가하여 세포 펠렛을 재현탁하고, 전체 부피까지 채운 후 뒤집어 섞습니다. 상온의 엔드-투-엔드 쉐이커 또는 로테이터에서 10분 동안 가교 결합시킵니다. 1.25 M glycine을 전체 부피의 1/10만큼 첨가하여 가교 반응을 중단시키고, 상온의 쉐이커에서 5분간 둡니다. 그러면 세포가 밝은 오렌지색으로 변합니다.

다음으로 2000 RCF에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 따라내고 흡입하여 제거하며, 냉각된 PBS 20 mL로 펠렛을 세척하며 다시 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고 세척된 교차결합 펠렛을 냉각된 PBS로 재현탁합니다. 세포 1 mL씩을 에펜도르프 튜브에 옮기고 4 °C에서 2000 RCF로 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 피펫 팁을 사용하여 PBS를 최대한 조심스럽게 제거합니다.

모든 세포 펠릿을 액체 질소로 급속 냉동시킨 후 -80°C에서 무기한 보관하십시오. ChIRP를 위한 세포 용해물을 준비하려면, 냉동된 가교 세포 펠릿을 상온에서 해동하십시오. 세포 펠릿이 떨어져 나오고 잘 섞이도록 강하게 두드리십시오.

펠렛을 원심 분리하고, 1 mg 단위까지 정확히 측정 가능한 전자저울 위에서 날카로운 10 µL 피펫 팁을 사용하여 남아 있는 PBS를 모두 제거하십시오. 빈 에이노(einor) 튜브의 질량을 측정하십시오. 각 펠렛의 무게를 측정하고 기록하십시오.

신선한 프로테아제 억제제 PMSF와 super ace가 첨가된 용해 버퍼를 부피의 10배만큼 각 튜브에 넣고 펠릿을 재현탁합니다. 세포 용해물은 준비 직후 즉시 사용해야 합니다. 용해물을 1.5 mL 이하로 각각의 15 mL 팰콘 튜브에 옮긴 후, 초음파 파쇄 프로브를 삽입하고 단단히 조입니다.

다음으로 튜브를 bio rupture에 넣고, 4 °C에서 최고 설정으로 30초 작동 및 45초 정지 펄스 간격으로 초음파 처리합니다. 30분마다 용해물을 확인하십시오. 세포 용해물이 더 이상 탁하지 않을 때까지 초음파 처리를 계속합니다.

이 과정은 튜브의 수, 샘플 부피, 배스 온도 및 초음파 처리 시간에 따라 30분에서 4시간 정도 소요될 수 있습니다. 용해물이 투명해지면 5 µL를 새 einor 튜브로 옮깁니다. DNA protease K buffer와 protease K를 첨가하고 vortex로 섞어준 뒤 짧게 원심분리하고, 50 °C에서 45분 동안 배양한 후 PCR 정제 키트로 DNA를 추출합니다.

1% agarose 젤에서 DNA 크기를 확인하십시오. DNA smear의 대부분이 100에서 500 base pairs 사이에 위치해야 하며, 이는 초음파 처리가 완전히 되었음을 나타냅니다. 초음파 처리된 샘플을 4°C에서 16,100 RCF로 10분 동안 원심분리하여 1 mL씩 분주하십시오. 상층액을 새로운 Eppendorf 튜브로 옮긴 후 액체 질소로 급속 냉동하여 ChIP-seq 절차를 시작하십시오. 일반적인 ChIP-seq 샘플의 경우, 크로마틴 튜브를 상온에서 해동하십시오.

1 mL의 용해물을 사용하여, RNA 투입용으로 10 µL와 DNA 투입용으로 10 µL를 분리하여 에펜도르프 튜브에 넣습니다. 이후 단계까지 얼음 위에 보관하십시오. 각 크로마틴 샘플 1 mL를 15 mL 팔콘 튜브로 옮깁니다.

각 튜브에 2 mL의 hybridization buffer를 넣습니다. 다음으로, 상온에서 프로브를 해동합니다. 이 biotinylated tiling oligos는 RNA를 따라 위치에 따라 표지되었으며 두 개의 풀(pool)로 나누어져 있습니다.

짝수 풀에는 짝수 번호의 모든 프로브가 포함되어 있으며, 홀수 풀에는 홀수 번호의 프로브가 포함되어 있습니다. 모든 실험은 서로의 내부 대조군 역할을 하는 두 풀을 모두 사용하여 수행됩니다.

실제 프로토콜에서 가장 까다로운 점 중 하나는 모든 하이브리다이제이션 및 세척 단계를 37°C에서 수행해야 한다는 것입니다. 일관된 실험 온도를 유지하기 위해 모든 단계는 인큐베이터 내부 또는 근처에서 수행하십시오. 적절한 부피의 프로브를 특정 튜브에 추가합니다. 잘 섞은 후 37°C에서 4시간 동안 흔들어주며 인큐베이션하며, 하이브리다이제이션이 완료되기 20분 전에 마칩니다.

C one 자기 비드를 준비합니다. 프로브 100 pico mole당 100 µL를 사용하십시오. Dyna mag two 스트립 자석을 사용하여 비드를 완충액과 분리하며, 1 mL의 무혈청 보충 용해 완충액으로 3회 세척합니다.

마지막 세척 후, 원래 부피의 용해 버퍼로 비드를 재현탁하고 신선한 PMSF와 프로테아제 억제제를 첨가합니다. 4시간의 하이브리드화 반응이 완료되면, 각 튜브 혼합물에 100 µL의 비드를 추가합니다. 37 °C에서 30분 동안 흔들어주며 배양한 후, 첫 번째 세척 시 37 °C로 예열된 1 mL의 세척 버퍼로 비드를 세척합니다.

DynaMag 15 자석 스트립을 사용하여 비드를 분리하고, 상층액을 제거한 뒤 1 mL 세척 완충액에 재현탁하여 1.5 mL EOR 튜브로 옮깁니다. 37 °C에서 5분간 흔들어주며 배양합니다. 이후의 세척 과정에서는 각 튜브를 미니 원심분리기로 스핀 다운하고, 샘플을 DynaMag 2 자석 스트립 위에 1분 동안 놓아 샘플의 상층액을 제거합니다. 킴와이프로 흘러내린 액체를 닦아내고 1 mL에 재현탁합니다.

세척 버퍼를 넣고 37°C에서 5분 동안 흔들어 섞으며 배양합니다. 이 과정을 총 5회 반복합니다. 마지막 세척 후 비드를 잘 재현탁하여 100 µL를 취해 RNA 분리를 위해 따로 보관하고, 나머지 900 µL는 DNA 분획을 위해 남겨둡니다.

모든 튜브를 dyna mag 튜브 자석 스트립 위에 놓으 고 세척 버퍼를 제거합니다. 짧게 원심 분리한 후, 10 µL 피펫 팁을 사용하여 튜브를 다시 자석 스트립에 놓습니다. 각 튜브에서 남은 세척 버퍼를 완전히 제거하십시오.

이후 정량 및 시퀀싱을 위해 chirp 샘플에서 RNA 및 DNA 분획을 분리합니다. 이 그림은 HELOC 세포에서 GA dh 대비 인간 텔로머레이스, RNA 또는 Turk의 농축도를 보여줍니다. 여기서 풍부한 세포 RNA는 음성 대조군으로 사용됩니다.

세포 내에 존재하는 Turk RNA의 대부분인 약 88%가 chirp 수행을 통해 침전된 반면, GA DH RNA는 0.46%만이 회수되어 약 200배의 농축 배수를 보여주었습니다. 포유류 세포에서 일반적으로 발현되지 않는 LAC Z RNA를 표적으로 하는 프로브와 같은 비특이적 프로브를 추가적인 음성 대조군으로 사용할 수 있습니다. 표적과 결합할 것으로 예상되는 DNA 영역들입니다. QPCR로 측정했을 때, 긴 비코딩 RNA는 일반적으로 음성 영역보다 더 많이 농축됩니다.

이 그림은 동일한 세포주에서 chirp SSE를 수행하여 결정한 일차 인간 포피 섬유아세포 내 4개 hot air 결합 부위의 QPCR 검증 결과를 보여주며, Turk 및 GA DH DNA 부위는 음성 대조군 영역으로 사용되었습니다. 짝수 및 홀수 프로브 세트 모두 음성 영역에 비해 예상되는 hot air 결합 부위에서 유사한 농축도를 나타냈습니다. 이는 진정한 롱 논코딩 RNA 결합 부위의 특징입니다.

이 데이터는 dosage compensation(용량 보정)에 필수적인 방식으로 X 염색체와 상호작용하는 것으로 알려진 trla long non-coding RNA인 rocks two의 데이터를 통해 알 수 있듯이, chirp로 농축된 DNA의 고처리량 시퀀싱을 통해 long non-coding RNA 결합 부위의 글로벌 맵을 얻을 수 있습니다. 짝수 및 홀수 샘플을 모두 별도로 시퀀싱하고 고유한 노이즈를 제거하여 중첩된 신호 트랙을 생성했으며, 여기서 각 피크는 rocks two 결합의 강력한 부위를 나타냅니다. 이 절차를 수행하는 동안 올바른 RNase-free 기술을 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따르십시오.

개발 이후, 관심 있는 비임상 DRNA와 상호작용하는 단백질이 무엇인지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 단백질 도트 블로팅(protein dot blotting)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. CHI는 RNA 생물학 분야의 연구자들이 배양 세포 및 고정 조직에서 RNA 활성을 매핑할 수 있는 길을 열어주었습니다.