Name: RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 배우세요 ChIRP 기법을 활용하여 긴 비암호화 RNA(lncRNA)의 게놈 결합 부위를 고해상도로 매핑하는 방법을. 생물학적 과정에서 RNA-DNA 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 T. 숙취, MC 감사합니다. 영, O. 매너 E. Segal, M. 구로다, T. Swigut 및 토론을위한 나 Shestopalov. 과학, 기술, 싱가포르 (CC), NIH R01-CA118750 및 R01-HG004361 (HYC) 및 재생 의료 (HYC)의 캘리포니아 공과 대학 연​​구 기관 지원. HYC는 하워드 휴즈 의학 연구소의 조기 채용 과학자이다.

1. 프로브 디자인 디자인 안티 센스 DNA는 짹짹에 의해 RNA 대상의 선별 검색을 위해 프로브를 기와. <ol><li> 에서 온라인 프로브 디자이너를 사용하여 설계 안티 - 감각의 oligo 프로브 <a href="http://singlemoleculefish.com">singlemoleculefish.com</a> 18. </li><li> 이러한 매개 변수를 사용하여 프로브 RNA의 길이 = 1 프로브 / 100 BP의 수 2) 대상의 GC % = 45; 3) Oligonucleotide 길이 = 20; 4) 간격의 길이 = 60-80을. 너무 오래 경우 디자이너에 대한 세그먼트로 RNA 봐라. 반복이나 다양한 상동 지역이 생략하십시오. </li><li> 3 소수 끝에 BiotinTEG과 주문 안티 - 감각의 DNA 프로브. </li><li> RNA를 따라 자신의 위치에 따라 라벨 프로브. &quot;심지어는&quot;수영장이 모든 프로브에게 번호 2, 4, 6, 등등을 포함하고 &quot;이상한&quot;수영장 1 번호 프로브, 3, 5를 포함 있도록하는 두 개의 수영장으로 그들을 분리 등 100 μm의 농도에 탐사선의 수영장을 희석하고 -20 ° C.에 저장 </li><li> 모든 실험 사용하여 수행할 수 있습니다서로에 대한 내부 통제의 역할을 둘 다 풀. 프로브 특정 소음 각 풀에 고유 될하면서 리얼 RNA-의존 신호는 두 개의 수영장 선물이 될 것입니다. 이것은 짹짹-qPCR와 짹짹-seq 모두에 적용됩니다. </li></ol> 2. 수확 셀 짹짹 실험에 사용됩니다 세포를 수집합니다. <ol><li> 조직 배양 플레이트 또는 confluency에 flasks에서 세포를 성장. 인산염과 헹굼 한번 식염수 (PBS)을 버퍼링하고 trypsinize. 세포를 이동시키다 및 단일 세포 현탁액으로 resuspend 아래로, 미디어&gt; 2X 볼륨과 피펫을 트립신을 끄다합니다. 50 ML 팔콘 튜브로 모든 미디어 및 resuspended 세포를 전송합니다. 20,000,000 세포는 일반적으로 한 짹짹 샘플 충분합니다. </li><li> 4 분 동안 800RCF에서 세포를 봐. 필요한 경우 PBS 40 ML에서 대기음 매체와 resuspend 40,000,000 세포는 튜브를 결합. 4 분 동안 800RCF에서 세포를 봐. 가만히 따르다 PBS는 조심스럽게 각도 남은 액체에 기음. </li></마셨다&gt; 3. 크로스 링크 셀 및 셀 펠릿를 수집 Crosslink는 RNA-염색질 상호 작용을 유지하고 세포 펠렛을 준비하는 글루 타 알데히드와 세포를 수집했습니다. <ol><li> 실온에서 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 방 온도를 PBS에 1 % 글루 타 알데히드를 준비합니다. 10000000 전지 (0.4 ML 25 % 글루 타 알데히드 주식 + 9.6 ML PBS) 당 10 ML을 준비합니다. 글루 타 알데히드는 신선한 사용해야합니다. </li><li> 알약을 꺼내려 팔콘 튜브의 바닥을 누릅니다. Resuspend 세포 펠렛은 1 % 글루 타 알데히드에 청크를 피하기 위해 작은 볼륨으로 시작, 그때 전체 볼륨까지 맨. 믹스하는 반전. 엔드 - 투 - 엔드 흔드는 또는 회전에 실온에서 10 분 대한 Crosslink. </li><li> 5 분을위한 상온에서 1.25 M 글리신의 1/10th 볼륨 가교 반응을 끄다. </li><li> 5 분 동안 2000RCF에서 봐. 20 ML은 5 분 동안 2000RCF에서 방적 한번 PBS를 차게로 뜨는 및 세차 펠렛을 기음. </li><li> W를 기음과 resuspend재를 떨어서, 교차 연결된 펠릿 20,000,000 셀 당 한 ML 냉장 PBS로. 주의 깊게 피펫 팁으로 가능한 한 많은 PBS를 제거 4 C.에서 3 분 동안 2000RCF에 Eppendorf 튜브와 스핀 각 ML을 전송합니다. </li><li> -80에서 액체 질소와 저장소에있는 세포 알약을 플래시 동결 ° C 무기한. </li></ol> 4. 세포 용해 세포 lysate를 준비하는 가교 세포를 Lyse. <ol><li> 실온에서 냉동 세포 알약을 녹여. 세포 펠렛을 이동시키다하고 혼합하기 위해 최선을 누릅니다. 4에 3 분 ° C.에 대해 2000RCF에 펠렛을 던가 모든 남아있는 PBS를 제거하는 샤프 10 μl 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 전자 잔액 (1mg까지 정확하게) 비어있는 Eppendorf 튜브의 살갈퀴 질량에서 (우리의 튜브는 매우 일관되게 1.060 그램 무게). 각 펠렛를 저울질하고 체중을 기록합니다. 가교 HELA 세포의 전체 15cm 요리는 일반적으로 100 MG 무겁죠. </li><li> fres와 보충의 용해 완충액 (펠렛의 10X 질량, 100mg에 대한 예 : 1 ML)H 단백 분해 효소 억제제, PMSF와 Superase 인은 (첨부된 버퍼 목록을 참조). 잘 섞는다. </li><li> 각각의 튜브로 10X 볼륨 보충 용해 완충액을 넣고 펠렛을 resuspend. 작은 알약 들어 &lt;250 μl 보충 용해 완충액에 resuspend 25 밀리그램. 서스펜션은 부드럽게해야합니다. 그렇지 않다면, 500 μl aliquots으로 정학을 분할하고 대단히 짧은 시간을 깨고 동력 펠렛 믹서를 사용합니다. sonication 즉시 진행합니다. </li></ol> 5. Sonication 가교 세포 lysates를 sonicating에 의한 전단의 DNA. <ol><li> 15 ML 팔콘 튜브에 Bioruptor의 세포 lysate를 Sonicate. 각 튜브에 &lt;1.5 ML의 lysate를 사용하여 빠른 sonication을 위해, 시간에 더 이상 둘을 제외 튜브 sonicate. </li><li> 펄스 간격에서 45 초 30 초 최고 설정에서 4 ° C의 물을 욕조에 Sonicate. 매 30 분 lysate 확인합니다. 세포 lysate가 더 이상 흐린되지 않습니다 때까지 sonicating 계속합니다. 이것은 빠르면 30 분, 많은 4와 같은 시간이 걸릴 수 있습니다. 번호튜브, 샘플 볼륨, 목욕 온도 및 sonication 시간의 기간은 프로세스가 걸리는 시간에 영향을줍니다. 튜브 가능성이 서로 다른 속도로 sonicate 때문에 함께 균등을 보장하기 위해 원래의 튜브에 매 30 분 및 재배포 그들을 풀 것이다. 참고 : 글루 타 알데히드 - 가교 세포가 포름 알데히드 등가물보다 sonicate 데 시간이 더 크게 가져가라. </li><li> lysate 분명 켜면, 새로운 Eppendorf 튜브에 5 μL lysate를 전송합니다. 90 μL의 DNA 프로 테아제 K (PK) 버퍼 (버퍼리스트 참조) 5 μL PK를 추가합니다. 와동은 믹스 앤 간단히 다운 스핀합니다. 50 45 분 동안 품어 ° C. </li><li> Qiagen PCR 정화 키트에 DNA를 추출합니다. Elute의 30 μL Qiagen의 용출 버퍼 (EB)의 DNA와 1 % 아가로 오스 겔에 DNA의 크기를 확인합니다. DNA의 비방의 일괄 100-500 BP 경우, sonication이 완료됩니다. 그렇지 않을 경우 sonicate로 진행합니다. </li><li> 4에서 10 분 동안 16100RCF에서 sonicated 샘플을 원심 ° C. 액체 nitroge에 1 ML 샘플 및 플래시 동결로 supernatants, 나누어지는을 결합N. -80시 스토어 ° C. </li></ol> 6. 짹짹 바운드 염색질을 RNA와 분리 biotinylated DNA 프로브를 잡종. <ol><li> 상온에서 염색질의 해동 튜브. </li><li> (염색질의 ML 당 2 ML 준비, 버퍼리스트 참조) 하이브리드화 버퍼를 준비합니다. 혼합할 수있는 와동. </li><li> lysate 1 ML을 사용하여 일반적인 짹짹 샘플의 경우 Eppendorf 튜브에있는 DNA의 입력과 장소에 대한 RNA의 입력과 10 μL 10 μL를 제거합니다. 추가 사용까지 얼음에 보관. </li><li> 15 ML 팔콘 튜브 1 ML의 염색질을 전송합니다. 각 튜브에 두 ML의 하이브리드화 버퍼를 추가합니다. 총 볼륨의 &lt;1.5 ML는 Eppendorf 튜브를 사용합니다. </li><li> 실온에서 프로브를 녹여. 당신은 오랫동안 그것을 사용하지 않은 경우에는 금액을 확인 Nanodrop 프로브 (100 μm의 프로브해야 사양 ~ 단일 스트랜드의 DNA 설정을 사용 500-600 NG / μl). 특정 튜브 (1 ML 염색질 당 100 pmol 프로브, 1 ML 염색질 당 100 μL / pmol 프로브 1 μL)에 탐사선의 적절한 볼륨을 추가합니다.잘 섞는다. 떨고있는 4 시간 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 20 분이 하이브 리다이 제이션을 위해 남아있는 상태에서 C-1 자석 구슬 (4 ° C에 저장) 준비합니다. 프로브의 100 pmol 당 100 μL를 사용하십시오. 한 ML unsupplemented 용해 버퍼와 버퍼에서 별도의 구슬로 DynaMag-2 자석 스트립을 사용하여 세 번 .. 내사랑. </li><li> 용해 완충액의 원래 볼륨에서 Resuspend 구슬, 신선한 PMSF, PI 및 Superase 인과 보충. 4 시간의 하이브 리다이 제이션 반응이 완료되면 각각의 튜브에 100 μL 구슬을 추가합니다. 잘 섞는다. 떨고있는 30 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> (샘플 당 5 ML) 버퍼 씻어 준비합니다. 혼합할 수있는 와동. 37까지 사전 따뜻한 ° C. 사용하기 전에 PMSF를 추가합니다. </li><li> 한 ML 세척 버퍼 다섯 번으로 구슬을 씻는다. 첫 번째 세척에서 1, ML 세척 버퍼에 별도의 구슬, 가만히 따르다, 그리고 resuspend에 DynaMag-15 마그네틱 스트립을 사용합니다. 1.5 ML Eppendorf 튜브에 볼륨을 전송합니다. 5 분 동안 흔들어으로 37 ° C에서 품어. </li><li> 이후 세차장에서 minicentrifuge 각 튜브를 돌려서, 1 분 DynaMag-2 마그네틱 스트립에 샘플을 설정합니다. 가만히 따르다 예제 1 ML 세척 버퍼에 resuspend Kimwipe로 모든 drips 닦아냅니다. 5 분 동안 흔들어으로 37 ° C에서 품어. 다섯 총 세차장에 대해 반복합니다. </li><li> 마지막으로 세척 장에서 잘 구슬 resuspend. 100 μL를 제거하고 RNA 격리를 위해 별도로 설정합니다. DNA 분획을위한 준비 900 μL. DynaMag-2 마그네틱 스트립에있는 모든 튜브를 삽입하고 세차 버퍼를 제거합니다. 간단히 아래 모든 튜브 던가, 자석 스트립에 넣어. 날카로운 10 μl 피펫 팁으로 완전히 세척 버퍼의 마지막 비트를 제거합니다. </li></ol> 7. RNA 격리 qRT-PCR에 의해 quantitate하는 처프 샘플에서 RNA 분획을 추출합니다. <ol><li> 100 μL 비드 샘플과 10 μL RNA 입력 샘플을 가져가라. 입력 RNA 85 μL RNA PK 버퍼 산도 7.0을 추가합니다. 95 μL RNA PK 버퍼 산도 7.0의 Resuspend 구슬. 엔드 - 투 - 엔드 떨고있는 45 분 동안 50 ° C에서 5 μL Proteine​​ase의 K 및 부화를 추가합니다. </li><li> 간단히 모든 튜브를 돌려서95에서 열 블록에 10 분 동안 샘플을 끓여서 ° C. </li><li> 얼음에 샘플을 풀어, 10 초 동안 적극적으로 500 μL TRIzol, 와동을 추가합니다. 10 분 동안 상온에서 품어. -80시 쇼핑몰 ° C 또는 4 단계로 진행합니다. </li><li> TRIzol 처리 샘플에 100 μL의 클로로포름을 추가합니다. 10 초에 대한 노골적인 소용돌이. 4 ° C.에 15 분 benchtop 원심 분리기에 16100RCF에 스핀 </li><li> 유기 및 인터페이스를 피하 ~ 400 μL 수성 표면에 뜨는을 제거합니다. </li><li> 600 μL (1.5 볼륨) 100 % 에탄올을 넣고 잘 섞는다. MIRNeasy 미니 칼럼을 통해 샘플을 봐. RWT (MIRNeasy 미니 키트), 제조 업체의 프로토콜마다 RPE와 2X와 함께 1X 씻으십시오. 30 μL nuclease없는 H 2 O (nfH 2 O)로 Elute. </li><li> RNA의 eluate 제조 업체의 프로토콜마다 DNA를 무료로 드셔보세요. 반응이 완료되면, 65에서 15 분 동안 시료를 가열 ° C가 완전히 남아있는 DNase를 inactivate 수 있습니다. </li><li> 1 μL RNA를 사용 lncRNA을 확인 qRT-PCR 분석에 당 잘 격리검색. GAPDH는 종종 부정적인 컨트롤로 사용됩니다. </li></ol> 8. DNA의 격리 시퀀싱에 의해 식별하거나 qPCR에 의해 quantitate하는 처프 샘플에서 DNA 분획을 추출합니다. <ol><li> DNA를 용출 버퍼 (버퍼리스트 참조), DNA의 입력을 포함한 샘플 당 150 μl를 준비합니다. </li><li> 섞어 한 0μL RNase (10 밀리그램 / ML)와 10 μL RNase H (10 U / μl)의 DNA 용리 버퍼의 ML 당, 그리고 소용돌이를 추가합니다. </li><li> RNases있는 DNA를 용출 버퍼 150 μL의 구슬 각각의 샘플을 Resuspend. (140 μL의 Resuspend의 DNA 입력) 떨고있는 30 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 별도의 구슬과 DynaMag-2 마그네틱 스트립에 뜨는. 뜨는을 제거하고 레이블 튜브에 추가합니다. </li><li> 10 μL RNase (10 밀리그램 / ML)와 RNaseH (10 U / μL) 그대로 8.2에서 수행)와 함께 DNA의 용출 버퍼의 두 번째 나누어지는을 준비합니다. 각 샘플 (DNA 입력 포함), 알을 품다 150 μL를 추가하고 뜨는 제거합니다. 모든 뜨는 (shoul를 수집D) ~ 300 μL 수 있습니다. </li><li> 각 시료 15 μL PK를 추가합니다. 떨고있는 45 분 동안 50 ° C에서 품어. </li><li> 노란색 위상 잠금 젤 튜브 (5PRIME)를 다운 사전 돌리다. 위상 잠금 젤 튜브에의 DNA 샘플을 전송, 300 μL PhOH 추가 샘플 당 Isoamyl : 클로로포름합니다. 10 분 동안 적극적으로 흔들, 4 ° C.에 5 분 대한 16100RCF에서 benchtop 원심 분리기에 다운 스핀 상단 (~ 300 μL)에서 수성을 가져가라. 3 μL GlycoBlue, 30 μL NaOAc, 900 μL 100 % EtOH를 추가합니다. 하룻밤 -20 ° C에서 잘하고 매장 섞는다. </li><li> 4에서 30 분 동안 16100RCF에서 샘플을 던가 ° C. </li><li> 신중하게 가만히 따르다 뜨는. 한 ML 70 % EtOH와 섞어 소용돌이를 추가합니다. 5 분 동안 16100RCF에서 봐. 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 공기 1min 동안 건조. 30 μL EB에 Resuspend. </li><li> DNA 샘플은 qPCR 또는 Illumina 프로토콜 당 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리의 준비에 의한 분석을 위해 준비가되어 있습니다. </li></ol> 10. 대표 결과 그림 1 </stroNG&gt; 짹짹의 흐름을 묘사. 성공 짹짹 실험은 일반적으로 상당히 아닌 특정 RNAs를 통해 대상 RNA를 enriches. 그림 2 GAPDH 이상 HELA 세포로부터 인간 telomerase RNA (TERC), 부정적인 제어 역할을 풍부한 세포 RNA의 농축을 보여줍니다. GAPDH RNA의 단지 0.46 %가 검색되었습니다 반면 세포에 존재 TERC RNAs (~ 88%)의 대부분은 ~ 200 배로 농축 계수를 보여주 처프를 수행 타고 내려오게되었다. 같은 포유 동물 세포 (그림 2)로 표현되지 않습니다 LacZ RNA를 타겟팅 프로브와 같은 특이 현상이 프로브가 추가로 부정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 대상 lncRNA를 바인딩 것으로 예상의 DNA 영역은 일반적으로 qPCR로 측정 부정적인 영역 통해 풍부합니다. 그림 3은 우리가 같은 세포 라인에서 짹짹-seq를 수행하여 결정하는 주요 인간 포피의 섬유아 세포에서 네번 HOTAIR 바인딩된 사이트 qPCR 검증을 보여줍니다, 반면 TERC와 GAPDH 유전자 사이트 SE부정적인 통제 지역으로 rve. 모두 &quot;도&quot;와 &quot;이상한&quot;탐사선은 부정적인 지역, 진정한 lncRNA 바인딩 사이트의 특징 이상 예상 HOTAIR 바인딩된 사이트 굴복 비교 농축을 설정합니다. 짹짹 강화 DNA의 높은 처리량 시퀀싱은 lncRNA 바인딩 사이트의 글로벌지도를 얻을. Drosophila lncRNA roX2은 복용량 보상에 필요한 방식으로 X-염색체와 상호 작용하는 것으로 알려져 있습니다. 그림 4는 X의 염색체의 일부분 이상 roX2 바인딩 프로필을 보여줍니다. 모두 &quot;도&quot;와 &quot;이상&quot;샘플은 순서가되어 그들의 독특한 소리가 중복되는 신호의 추적을 생산하기 위해 제거되었습니다. 각각의 &quot;피크&quot;는 여기 roX2 바인딩의 강력한 사이트를 나타냅니다. 전체 트랙과 roX2 대상 유전자의 목록은 추 외에 설명되어있다. 2,011 17가. <img alt="1 그림." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig1.jpg" /> 짹짹 proce의 그림 1. 흐름 차트dure. Biotinylated 기와 프로브는 lncRNA을 대상으로 hybridized되는 생체내에 단백질 부가물을하고, 염색질의 단지는 엄격한 세차장 뒤에는, 자기 streptavidin 비즈를 사용하여 정화됩니다. 염색질은 lncRNA에 가교됩니다. 우리는 putative lncRNA 바인딩 순서가 오렌지색으로 schematized되고 Rnase와 헤의 칵테일과 함께 lncRNA 바운드의 DNA 또는 단백질을 elute. 이전 추 외 년에 출판된. 2,011. 17 <img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig2.jpg" /> 인간 TERC RNA 그림 2. 짹짹의 enriches. TERC-asDNA 프로브 세포 TERC RNA 및 탐지 GAPDH의 ~ 88 % 검색할 수 있습니다. LacZ-asDNA 프로브는 부정적인 컨트롤로 사용도 RNAs를 검색할 수 있습니다. 민 + SD가 표시됩니다. 이전 추 외 년에 출판된. 2,011. 17 <img alt="그림 3." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig3.jpg" /> 그림 3. 기본 인간의 HOTAIR 짹짹-qPCR을위한eskin의 섬유아 세포. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 및 ABCA2가 HOTAIR와 상호 작용하는 지역입니다. TERC와 GAPDH는 부정적인 컨트롤을 역임했습니다. 민 + SD가 표시됩니다. 이전 추 외 년에 출판된. 2,011. 17 <img alt="4 그림." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig4.jpg" /> 그림 4. Sl2 Drosophila 세포의 roX2 RNA의 짹짹-seq 데이터입니다. &quot;비록&quot;과 &quot;이상한&quot;가 별도로 순서가 있었던 것은 그들의 데이터는 모두 전용 일반 봉우리를 반영하도록 병합합니다. 병합된 트랙이 나타납니다. 이전 추 외 년에 출판된. 2,011. 17

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</ol>

C. 추와 HY 장은이 방법을 바탕으로 특허 출원의 발명가로 지정됩니다.

여기 짹짹-seq, 생체내 lncRNA 구속력이 사이트는 게놈 전체에 매핑하는 방법을 설명했다. 성공을위한 주요 파라미터는 oligonucleotide 프로브 및 글루 타 알데히드 crosslinking을 기와의 분할 수영장입니다. 친화력 - 프로브의 설계는 RNA 시퀀스 주어진 간단하고 RNA의 구조 또는 기능적 도메인에 대한 사전 지식이 필요하지 않습니다. 두 종족에 세보다는 다른 RNAs - - roX2, TERC 및 HOTAIR와의 성공 짹짹-seq 많은 lncRNAs 대한 가능성 generalizable 것을 제안합니다. 모든 실험과 마찬가지로, 관리 및 적절한 컨트롤이 결과를 해석해야합니다. 다른 lncRNA는 조건 적정과 같은 서로 다른 선호도 프로브 또는 crosslinkers의 선택과 같은 조건의 의식 변화를 요구할 수 있습니다, RNA-염색질 상호 작용의 다양한 측면을 강조할 수 있습니다. 칩 seq 마찬가지로, 모든 바인딩 이벤트가 반드시 기능적 있으며, 추가적인 연구는 RNA O의 생물 학적 결과를 확인하는 데 필요한염색질에 ccupancy. 그럼에도 불구하고, 우리는 수천 8,9의 현재 번호를 다른 염색질 - 관련 lncRNAs의 연구자들은이 기술의 많은 흥미로운 애플 리케이션을 예견한다. 칩 seq는 DNA-단백질 상호 작용의 게놈 차원의 탐험을 위해 문을 열었습니다 것처럼, &quot;RNA interactome&quot;의 짹짹-seq 연구는 생물학의 많은 새로운 길을 보여줄 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">버퍼 목록:</td></tr><tr><td colspan="4">complete protease inhibitor 펠렛을 1 ml 증류수에 녹여 50x 스톡으로 제조한다. 이소프로판올을 사용하여 100 mM PMSF(100x 스톡)를 제조한다. Superase-in은 200x 스톡으로 사용한다. 모두 -20 &amp;deg;C에 보관한다.</td></tr><tr><td colspan="4">용해 버퍼(Lysis Buffer):</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM Tris-Cl pH 7.0&lt;br/&gt;10 mM EDTA&lt;br/&gt;1% SDS&lt;br/&gt;비드 세척 시를 제외하고, 사용 직전에 항상 신선한 PMSF, P.I. 및 Superase-in을 첨가한다</td></tr><tr><td colspan="4">Proteinase K 버퍼 (DNA용)</td></tr><tr><td colspan="4">100 mM NaCl&lt;br/&gt;10 mM TrisCl pH 8.0 (RNA의 경우 pH 7.0 사용)&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;0.5% SDS&lt;br/&gt;사용 직전에 부피 대비 5%의 Proteinase K (Ambion AM2546 20 mg/ml)를 신선하게 첨가한다</td></tr><tr><td colspan="4">하이브리다이제이션 버퍼(Hybridization Buffer)</td></tr><tr><td colspan="4">750 mM NaCl&lt;br/&gt;1% SDS&lt;br/&gt;50 mM Tris-Cl pH 7.0&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;15% formamide (4 &amp;deg;C 암소 보관)&lt;br/&gt;사용 직전에 항상 신선한 PMSF, P.I. 및 Superase-in을 첨가한다</td></tr><tr><td colspan="4">세척 버퍼(Wash Buffer)</td></tr><tr><td colspan="4">2x NaCl 및 Sodium citrate (SSC) (Invitrogen 20x SSC 스톡에서 희석)&lt;br/&gt;0.5% SDS&lt;br/&gt;사용 직전에 항상 신선한 PMSF를 첨가한다</td></tr><tr><td colspan="4">DNA 용출 버퍼(DNA elution Buffer)</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM NaHCO3&lt;br/&gt;1% SDS</td></tr><tr><td colspan="4">특정 시약 및 장비 표:</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde (EM 등급)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-10x10ml</td><td></td></tr><tr><td>전동 펠렛 믹서(Motorized pellet mixer)</td><td>VWR international</td><td>V8185-904</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor</td><td>Roche Group</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Superase-in</td><td>Ambion</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM2696">AM2696&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 튜브 (초음파 처리용)</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>PCR 정제 키트(PCR purification kit)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>C-1 자기 비드(C-1 magnetic beads)</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-15 자석</td><td>Invitrogen</td><td>123-01D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 자석</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>MIRNeasy 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>R0601K</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy</td><td>5 PRIME</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:Isoamyl</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Ricca</td><td>RSOC0020-1C</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>JT Baker</td><td>4057-06</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>용출 버퍼 (EB)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-027</td><td></td></tr><tr><td>DNA-&lt;em&gt;free&lt;/em&gt;</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>버퍼 키트(Buffer kit)</td><td>Ambion</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Invitrogen</td><td>15515-026</td><td></td></tr></tbody></table>

rna 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

긴 noncoding의 RNAs에는 투여 보상, 각인, 그리고 발달 유전자 발현 1,2,3,4,5,6,7 같은 중요한 생물 학적 과정 동안 염색질 상태 중 핵심 규제입니다. mediates 히스톤 H3 라이신 27 trimethylation (H3K27me3)가 유전자에 특정한에서 염색질 상태를 관리하는 수많은 lncRNAs에 대한 광범위한 역할을 제시하는 등 Polycomb 억압 단지 2 (PRC2)와 같은 특정 염색질의 수정 단지와 협회의 lncRNAs 수천명의 최근 발견 패션 8,9. 일부 lncRNAs은 인근의 유전자에있는 CIS에서 일할 것으로 생각되고 있지만, 다른 lncRNAs가 먼에 위치한 유전자를 조절하는 트랜스으로 작동합니다. 예를 들어, Drosophila lncRNAs roX1과 남성 세포 X의 염색체에 roX2 구속 수많은 지역 및이 복용량 보상 10,11 위해 중요합니다. 그러나 그들의 구속력이 사이트의 정확한 위치는 높은 해상도로 알려져 있지 않습니다. 마찬가지로, 인간 lncRNA HOTAIR은 H에 PRC2 인 영향을 미칠 수유전자 게놈 차원 3,12,13,하지만 어떻게 특이성이 이루어지면의 undreds가 불분명합니다. LncRNAs 또한 여러 단백질 단지의 어셈블리를 채용한 모듈형 공사장 공중 발판이 될 수 있습니다. 클래식 트랜스 연기 RNA 비계 14 복잡한 telomerase를위한 템플릿 및 발판 역할 TERC RNA이며 HOTAIR도 PRC2위한 발판와 13 단지 H3K4 demethylase로 검색할 수 있습니다. 염색질에서 RNA의 인지도를 선행 연구는 상당한 통찰력에게 15,16을 보여주지만, 한 번에 하나의 유전자 현장에있다. 대부분의 lncRNAs의 인 사이트는 알려져 있지되며, 염색질 조절에 lncRNAs의 역할은 주로 lncRNA의 섭동의 간접적인 영향으로부터 유추되었습니다. 염색질의 immunoprecipitation는 microarray 또는 깊은 시퀀싱 (각각 칩 칩 또는 칩 seq) 뒤에 것처럼 크게 게놈 규모의 단백질-DNA 상호 작용에 대한 우리의 이해를 개선하고있다, 우리가 recen을 보여주는tly 고해상도 17 살의 긴 RNA의 인 게놈 전체를 매핑하기위한 전략을 발표했다. 다음과 함께 수백 개의 기지의 해상도 게놈 바인딩 사이트의지도를 생성하는 안티 센스-oligos을 기와로 염색질 복합 : RNA의 정제 (처프) (그림 1)에 의해이 메소드는, 염색질 격리는 대상 lncRNA의 친화 캡쳐를 기반으로 고감도와 배경 쌉니다. 친화력 - 프로브의 설계는 RNA 시퀀스 주어진 간단하고 RNA의 구조 또는 기능적 도메인에 대한 지식을 필요로하지 않기 때문에 처프 다수 lncRNAs에 적용됩니다.

처프 긴 noncoding RNAs의 게놈에 바인딩 사이트 (lncRNAs)를 매핑하는 소설 및 신속한 기술입니다. 방법은 lncRNA 바인딩된 게놈 사이트의 열거를 허용하는 안티 센스가 원래의 oligonucleotides의 특이성을 이용합니다.

RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

긴 비부호화 RNA(Long noncoding RNAs)는 용량 보정, 각인 및 발달과 같은 중요한 생물학적 과정에 필수적인 염색질 상태의 핵심 조절자입니다...

다음 실험의 전반적인 목표는 QPCR 또는 고처리량 시퀀싱을 이용하여 특정 비코딩 RNA와 연관된 DNA 영역을 결정하는 것입니다. 이는 세포를 교차 결합하여 생체 내(in vivo)에서 천연 D-N-A-R-N-A 상호작용을 포착함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로 세포를 용해하고 초음파 처리를 하여 세포 용해물을 가용화하고 크로마틴을 작은 조각으로 절단합니다.다음으로, 관심 있는 RNA-DNA 복합체를 특이적으로 농축하기 위해 비오틴화된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 세포 용해물에 첨가하며, qPCR 또는 고처리량 시퀀싱을 통해 비코딩 RNA가 결합된 게놈 부위의 정체를 규명하는 결과를 얻습니다. RNA-DNA FISH와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, CHIRP를 통해 염기쌍 수준에 가까운 해상도로 비코딩 RNA 결합 부위의 게놈 전역 지도를 작성할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 roX RNA와 수컷 초파리가 어떻게 용량 보상을 달성하는지와 같은 비코딩 RNA 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술은 비코딩 RNA가 염색질 상태와 유전자 발현을 어떻게 조절하는지 더 잘 이해할 수 있게 해주므로, 비코딩 RNA 관련 질환의 치료법 개발에 기여할 수 있습니다. RNA 정제 또는 CHIRP 실험을 통한 염색질 분리를 위해, 원심분리 후 4,000만 개의 세포를 수확하고, PBS를 따라낸 뒤 남은 액체를 각도를 조절하여 조심스럽게 흡입해 제거합니다. 팰콘 튜브 바닥을 가볍게 두드려 세포 펠렛을 떼어냅니다. 새로 조제한 1% glutaraldehyde를 소량부터 첨가하여 세포 펠렛을 재현탁하고, 전체 부피까지 채운 후 뒤집어 섞습니다. 상온의 엔드-투-엔드 쉐이커 또는 로테이터에서 10분 동안 가교 결합시킵니다. 1.25 M glycine을 전체 부피의 1/10만큼 첨가하여 가교 반응을 중단시키고, 상온의 쉐이커에서 5분간 둡니다. 그러면 세포가 밝은 오렌지색으로 변합니다.다음으로 2000 RCF에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 따라내고 흡입하여 제거하며, 냉각된 PBS 20 mL로 펠렛을 세척하며 다시 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고 세척된 교차결합 펠렛을 냉각된 PBS로 재현탁합니다. 세포 1 mL씩을 에펜도르프 튜브에 옮기고 4 °C에서 2000 RCF로 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 피펫 팁을 사용하여 PBS를 최대한 조심스럽게 제거합니다.모든 세포 펠릿을 액체 질소로 급속 냉동시킨 후 -80°C에서 무기한 보관하십시오. ChIRP를 위한 세포 용해물을 준비하려면, 냉동된 가교 세포 펠릿을 상온에서 해동하십시오. 세포 펠릿이 떨어져 나오고 잘 섞이도록 강하게 두드리십시오.펠렛을 원심 분리하고, 1 mg 단위까지 정확히 측정 가능한 전자저울 위에서 날카로운 10 µL 피펫 팁을 사용하여 남아 있는 PBS를 모두 제거하십시오. 빈 에이노(einor) 튜브의 질량을 측정하십시오. 각 펠렛의 무게를 측정하고 기록하십시오.신선한 프로테아제 억제제 PMSF와 super ace가 첨가된 용해 버퍼를 부피의 10배만큼 각 튜브에 넣고 펠릿을 재현탁합니다. 세포 용해물은 준비 직후 즉시 사용해야 합니다. 용해물을 1.5 mL 이하로 각각의 15 mL 팰콘 튜브에 옮긴 후, 초음파 파쇄 프로브를 삽입하고 단단히 조입니다.다음으로 튜브를 bio rupture에 넣고, 4 °C에서 최고 설정으로 30초 작동 및 45초 정지 펄스 간격으로 초음파 처리합니다. 30분마다 용해물을 확인하십시오. 세포 용해물이 더 이상 탁하지 않을 때까지 초음파 처리를 계속합니다.이 과정은 튜브의 수, 샘플 부피, 배스 온도 및 초음파 처리 시간에 따라 30분에서 4시간 정도 소요될 수 있습니다. 용해물이 투명해지면 5 µL를 새 einor 튜브로 옮깁니다. DNA protease K buffer와 protease K를 첨가하고 vortex로 섞어준 뒤 짧게 원심분리하고, 50 °C에서 45분 동안 배양한 후 PCR 정제 키트로 DNA를 추출합니다.1% agarose 젤에서 DNA 크기를 확인하십시오. DNA smear의 대부분이 100에서 500 base pairs 사이에 위치해야 하며, 이는 초음파 처리가 완전히 되었음을 나타냅니다. 초음파 처리된 샘플을 4°C에서 16,100 RCF로 10분 동안 원심분리하여 1 mL씩 분주하십시오. 상층액을 새로운 Eppendorf 튜브로 옮긴 후 액체 질소로 급속 냉동하여 ChIP-seq 절차를 시작하십시오. 일반적인 ChIP-seq 샘플의 경우, 크로마틴 튜브를 상온에서 해동하십시오.1 mL의 용해물을 사용하여, RNA 투입용으로 10 µL와 DNA 투입용으로 10 µL를 분리하여 에펜도르프 튜브에 넣습니다. 이후 단계까지 얼음 위에 보관하십시오. 각 크로마틴 샘플 1 mL를 15 mL 팔콘 튜브로 옮깁니다.각 튜브에 2 mL의 hybridization buffer를 넣습니다. 다음으로, 상온에서 프로브를 해동합니다. 이 biotinylated tiling oligos는 RNA를 따라 위치에 따라 표지되었으며 두 개의 풀(pool)로 나누어져 있습니다.짝수 풀에는 짝수 번호의 모든 프로브가 포함되어 있으며, 홀수 풀에는 홀수 번호의 프로브가 포함되어 있습니다. 모든 실험은 서로의 내부 대조군 역할을 하는 두 풀을 모두 사용하여 수행됩니다.실제 프로토콜에서 가장 까다로운 점 중 하나는 모든 하이브리다이제이션 및 세척 단계를 37°C에서 수행해야 한다는 것입니다. 일관된 실험 온도를 유지하기 위해 모든 단계는 인큐베이터 내부 또는 근처에서 수행하십시오. 적절한 부피의 프로브를 특정 튜브에 추가합니다. 잘 섞은 후 37°C에서 4시간 동안 흔들어주며 인큐베이션하며, 하이브리다이제이션이 완료되기 20분 전에 마칩니다.C one 자기 비드를 준비합니다. 프로브 100 pico mole당 100 µL를 사용하십시오. Dyna mag two 스트립 자석을 사용하여 비드를 완충액과 분리하며, 1 mL의 무혈청 보충 용해 완충액으로 3회 세척합니다.마지막 세척 후, 원래 부피의 용해 버퍼로 비드를 재현탁하고 신선한 PMSF와 프로테아제 억제제를 첨가합니다. 4시간의 하이브리드화 반응이 완료되면, 각 튜브 혼합물에 100 µL의 비드를 추가합니다. 37 °C에서 30분 동안 흔들어주며 배양한 후, 첫 번째 세척 시 37 °C로 예열된 1 mL의 세척 버퍼로 비드를 세척합니다.DynaMag 15 자석 스트립을 사용하여 비드를 분리하고, 상층액을 제거한 뒤 1 mL 세척 완충액에 재현탁하여 1.5 mL EOR 튜브로 옮깁니다. 37 °C에서 5분간 흔들어주며 배양합니다. 이후의 세척 과정에서는 각 튜브를 미니 원심분리기로 스핀 다운하고, 샘플을 DynaMag 2 자석 스트립 위에 1분 동안 놓아 샘플의 상층액을 제거합니다. 킴와이프로 흘러내린 액체를 닦아내고 1 mL에 재현탁합니다.세척 버퍼를 넣고 37°C에서 5분 동안 흔들어 섞으며 배양합니다. 이 과정을 총 5회 반복합니다. 마지막 세척 후 비드를 잘 재현탁하여 100 µL를 취해 RNA 분리를 위해 따로 보관하고, 나머지 900 µL는 DNA 분획을 위해 남겨둡니다.모든 튜브를 dyna mag 튜브 자석 스트립 위에 놓으 고 세척 버퍼를 제거합니다. 짧게 원심 분리한 후, 10 µL 피펫 팁을 사용하여 튜브를 다시 자석 스트립에 놓습니다. 각 튜브에서 남은 세척 버퍼를 완전히 제거하십시오.이후 정량 및 시퀀싱을 위해 chirp 샘플에서 RNA 및 DNA 분획을 분리합니다. 이 그림은 HELOC 세포에서 GA dh 대비 인간 텔로머레이스, RNA 또는 Turk의 농축도를 보여줍니다. 여기서 풍부한 세포 RNA는 음성 대조군으로 사용됩니다.세포 내에 존재하는 Turk RNA의 대부분인 약 88%가 chirp 수행을 통해 침전된 반면, GA DH RNA는 0.46%만이 회수되어 약 200배의 농축 배수를 보여주었습니다. 포유류 세포에서 일반적으로 발현되지 않는 LAC Z RNA를 표적으로 하는 프로브와 같은 비특이적 프로브를 추가적인 음성 대조군으로 사용할 수 있습니다. 표적과 결합할 것으로 예상되는 DNA 영역들입니다. QPCR로 측정했을 때, 긴 비코딩 RNA는 일반적으로 음성 영역보다 더 많이 농축됩니다.이 그림은 동일한 세포주에서 chirp SSE를 수행하여 결정한 일차 인간 포피 섬유아세포 내 4개 hot air 결합 부위의 QPCR 검증 결과를 보여주며, Turk 및 GA DH DNA 부위는 음성 대조군 영역으로 사용되었습니다. 짝수 및 홀수 프로브 세트 모두 음성 영역에 비해 예상되는 hot air 결합 부위에서 유사한 농축도를 나타냈습니다. 이는 진정한 롱 논코딩 RNA 결합 부위의 특징입니다.이 데이터는 dosage compensation(용량 보정)에 필수적인 방식으로 X 염색체와 상호작용하는 것으로 알려진 trla long non-coding RNA인 rocks two의 데이터를 통해 알 수 있듯이, chirp로 농축된 DNA의 고처리량 시퀀싱을 통해 long non-coding RNA 결합 부위의 글로벌 맵을 얻을 수 있습니다. 짝수 및 홀수 샘플을 모두 별도로 시퀀싱하고 고유한 노이즈를 제거하여 중첩된 신호 트랙을 생성했으며, 여기서 각 피크는 rocks two 결합의 강력한 부위를 나타냅니다. 이 절차를 수행하는 동안 올바른 RNase-free 기술을 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따르십시오.개발 이후, 관심 있는 비임상 DRNA와 상호작용하는 단백질이 무엇인지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 단백질 도트 블로팅(protein dot blotting)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. CHI는 RNA 생물학 분야의 연구자들이 배양 세포 및 고정 조직에서 RNA 활성을 매핑할 수 있는 길을 열어주었습니다.

chromatin-isolation-by-rna-purification-chirp

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기서 우리는 히스톤 바인딩 도메인에 차이가 단백질 isoforms의 게놈 차원 위치 분석을 위해 염색질의 immunoprecipitation (칩) 프로 시저를 발표하고 있습니다. 우리는 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 demethylase의 목표물을 식별 칩 Seq 분석에 적용됩니다.

이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)에 의한 염색질 상호 작용 분석을위한...

염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석

우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

염색질의 immunoprecipitation과 매우 높은 처리량 시퀀싱 (칩 SEQ)의 조합은 특정 조직이나 세포주에서 단백질 DNA 상호 작용을 파악하고 매핑 할 수 있습니다. 설명은 예를 들어 전사 인자 TCF7L2 경험을 사용하여 다음 순서를위한 고품질 칩 템플릿을 생성하는 방법이다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

관심 있는 특정 게놈 영역과 관련된 분자의 식별은 이러한 영역의 기능 조절 메커니즘을 이해하는 데 필요합니다. 이 프로토콜은 특정 게놈 영역과 관련된 단백질 및 RNA를 식별하기 위해 엔지니어링된 DNA 결합 분자 매개 염색질 면역침전(enChIP)을 수행하는 절차를 설명합니다.

특정 게놈 지역과 enChIP으로 관련 분자의 식별의 분리

여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

탠덤 chromatin 위한 단계별 프로토콜 설명 immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 셀 형식 관련 게놈 넓은 히스톤 수정의 분석을 가능 하 게.

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

여기서는 RNA 관련 염색질-DNA 상호작용을 포착하여 RNA 관련 3차원 게놈 조직을 매핑하는 프로토콜을 제시합니다.

RNA 연관 염색질 DNA-DNA 상호작용법

배우세요 ChIRP 기법을 활용하여 긴 비암호화 RNA(lncRNA)의 게놈 결합 부위를 고해상도로 매핑하는 방법을. 생물학적 과정에서 RNA-DNA 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

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