RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

다음 실험의 전반적인 목표는 QPCR 또는 고처리량 염기서열분석을 사용하여 특정 비암호화 RNA와 관련된 DNA 영역을 결정하는 것입니다. 이는 세포를 가교하여 생체 내에서 네이티브 D-N-A-R-N-A 상호 작용을 포착함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 세포를 용해시키고 초음파 처리를 거쳐 세포 용해물과 순전한 염색질을 작은 조각으로 용해시킵니다.

다음으로, R-N-A-D-N-A 복합체를 특이적으로 농축하기 위해 세포 용해물에 비오틴화된 안티센스 올리고를 첨가하고, QPCR 또는 고처리량 염기서열분석을 기반으로 비코딩 RNA 결합 게놈 부위의 정체를 밝히는 결과를 얻습니다. R-N-A-D-N-A FISH와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 chirp를 통해 염기쌍 해상도에 가까운 비암호화 RNA 결합 부위의 게놈 와이드 맵을 사용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 암석, RNA 및 수파리가 투여량 보상을 달성하는 방법과 같은 비코딩 RNA 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 의미는 비코딩 RNA가 염색질 상태와 유전자 발현을 조절하는 방법을 더 잘 이해할 수 있기 때문에 비코딩 NA 관련 질병의 치료에 대한 정도입니다. RNA 정제 또는 처프 실험에 의한 이러한 염색질 분리를 위해 원심분리 후 4,000만 개의 세포를 수확하고 PBS를 디캔팅한 후 매관의 바닥을 두드려 세포 펠릿을 비스듬히 조심스럽게 흡인하여 남은 액체를 제거합니다. 새로 준비된 1%글루타르알데히드를 소량으로 시작하여 추가하고 세포 펠릿을 최대 부피까지 재현탁시킨 다음 반전하여 종단 간 쉐이커 또는 회전체에서 실온에서 10분 동안 가교 반응을 1.25몰 글리신의 10분의 1로 가교 반응을 소멸하고 실온에서 5분 동안 셰이커에 방치합니다. 세포가 밝은 주황색으로 바뀝니다.

다음으로 2000 RCF에서 5분 동안 회전하고, 상층액을 디캔팅 및 흡인하고, 20ml의 냉각된 PBS 스핀으로 펠릿을 다시 세척하고, 상등액을 흡인하고, 세척된 가교 입천장을 냉각된 PBS로 다시 현탁시킵니다. 각 1밀리리터의 세포를 einor 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 3분 동안 2000RCF로 회전합니다. 원심분리 후 피펫 팁을 사용하여 가능한 한 많은 PBS를 조심스럽게 제거합니다.

모든 세포 펠릿을 액체 질소로 플래시하고 동결하고 섭씨 영하 80도에서 무기한 보관하십시오. 처프를 위한 세포 용해물을 준비하려면 실온에서 동결된 가교 세포 펠릿을 해동합니다. 세포 펠릿을 분리하고 혼합하려면 세게 두드립니다.

펠릿을 회전시키고 날카로운 10마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 1밀리그램 단위의 전자 저울에 남아 있는 PBS를 제거합니다. 빈 einor 튜브의 덩어리를 찢습니다. 각 펠릿의 무게를 측정하고 무게를 기록합니다.

신선한 프로테아제 억제제인 PMSF와 슈퍼 에이스가 보충된 용해 완충액 10 x 부피를 각 튜브에 추가하고 펠릿을 재현탁합니다. 세포 용해물은 준비 직후에 주입되어야 합니다. 각 15 밀리리터 팔콘 튜브에 1.5 밀리리터 이하의 용해물을 옮기고 초음파 처리 프로브를 단단히 조입니다.

다음으로 튜브를 바이오 파열에 넣고 섭씨 4도에서 가장 높은 설정에서 30초 동안 펄스 간격을 45초 동안 끕니다. 30분마다 용해물을 확인하십시오. 세포 용해물이 더 이상 탁하지 않을 때까지 초음파 처리를 계속하십시오.

이 작업은 튜브 수, 시료 부피, 수조 온도 및 초음파 처리 시간에 따라 30분에서 4시간까지 걸릴 수 있습니다. 용해물이 투명해지면 5마이크로리터를 새 einor 튜브로 옮깁니다. DNA 프로테아제 K buffer와 protease K vortex를 첨가하여 PCR 정제 키트로 DNA를 추출한 후 섭씨 50도에서 45분 동안 잠시 배양하고 스핀 다운합니다.

1%aros 젤의 DNA 크기를 확인하십시오. DNA 도말의 대부분은 완전한 초음파 처리 원심분리기를 나타내는 100-500 염기쌍이어야 합니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 16, 100 RCF에서 초음파 처리된 샘플의 1밀리리터 분취액을 상등액을 새로운 einor 튜브로 옮기고 액체 질소에서 급속 동결하여 일반적인 처프 샘플에 대해 실온에서 염색질의 처프 해동 튜브를 위한 절차를 시작합니다.

1ml의 용해물을 사용하여 RNA 입력용 10마이크로리터, DNA 입력용 10마이크로리터를 제거하고 einor 튜브에 넣습니다. 더 멀리 갈 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 각 염색질 샘플 1ml를 15ml 팔콘 튜브로 옮깁니다.

각 튜브에 2밀리리터 혼성화 완충액을 추가합니다. 그런 다음 프로브를 실온에서 해동합니다. 이러한 비오틴화 타일링 올리고는 RNA를 따른 위치에 따라 표지되고 두 개의 풀로 분리됩니다.

짝수 풀에는 짝수의 모든 프로브가 포함됩니다. 그리고 홀수 풀에는 홀수의 프로브가 포함되어 있습니다. 모든 실험은 서로에 대한 내부 통제 역할을 하는 두 풀을 사용하여 수행됩니다.

진정한 프로토콜의 가장 어려운 측면 중 하나는 모든 하이브리드화 및 세척 단계를 37도에서 수행해야 한다는 것입니다. 일관된 실험 온도를 보장하려면 습관화 오븐 내부 또는 근처에서 모든 단계를 수행하고 특정 튜브에 적절한 양의 프로브를 추가합니다. 잘 혼합: 교잡이 완료되기 20분 전에 흔들면서 37도에서 4시간 동안 배양합니다.

C one 마그네틱 비드를 준비합니다. 프로브 100피코 몰당 100마이크로리터를 사용합니다. 1ml의 unsu 보충 용해 버퍼로 Dyna mag 2 스트립 자석을 사용하여 버퍼에서 비드를 분리하여 세 번 세척합니다.

최종 세척 후, resus는 용해 완충액의 원래 부피에 비드를 현탁시키고 superin fresh PMSF 및 프로테아제 억제제를 보충합니다. 4시간 혼성화 반응이 완료되면 각 튜브 혼합물에 100마이크로리터의 비드를 추가합니다. 글쎄, 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하고, 첫 번째 세척 시 섭씨 37도로 예열된 1ml의 세척 버퍼로 흔들리는 세척 비드

dyna mag 15 마그네틱 스트립을 사용하여 비드를 분리하고, 디캔팅을 하고, 1밀리리터 세척 버퍼에서 재현탁한 다음 1.5ml EOR 튜브로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 흔들면서 배양한 후 세척한 다음 미니 원심분리기에서 각 튜브를 회전시키고 dyna mag two 마그네틱 스트립에 샘플을 올려 1분 디캔트 샘플을 만듭니다. Kim 물티슈로 물방울을 닦아내고 1밀리리터에 다시 매달아 놓습니다.

완충액을 세척하고 섭씨 37도에서 5분 동안 흔들면서 배양합니다. 마지막 세척 Resus에서 총 5회 세척을 반복합니다. 비드를 잘 현탁시키고 100마이크로리터를 제거한 다음 RNA 분리를 위해 DNA 분획을 위해 900마이크로리터를 예약합니다.

모든 튜브를 dyna mag tube 마그네틱 스트립에 놓고 세척 버퍼를 제거합니다. 잠시 회전한 후 날카로운 10마이크로리터 피펫 팁으로 자석 스트립에 튜브를 다시 놓습니다. 각 튜브에서 남아 있는 세척 버퍼를 완전히 제거합니다.

RNA 및 DNA 분획은 정량 분석 및 염기서열분석을 위해 처프 샘플에서 연속적으로 분리됩니다. 이 그림은 GA dh에 걸쳐 HELOC 세포에서 인간 텔로머라아제, RNA 또는 Turk의 농축을 보여줍니다. 음성 대조군 역할을 하는 풍부한 세포 RNA입니다.

세포에 존재하는 Turk RNA의 대다수는 약 88%가 처프(chirp)를 수행하여 끌어내린 반면, GA DH RNA의 0.46%만이 약 200배의 농축 인자를 입증하여 회수되었습니다. 포유류 세포에서 일반적으로 발현되지 않는 LAC ZRNA를 표적으로 하는 프로브와 같은 비특이적 프로브를 추가 음성 대조군으로 사용할 수 있습니다. 표적에 결합할 것으로 예상되는 DNA 영역. 긴 non-coding RNA는 QPCR로 측정할 때 일반적으로 negative region에 걸쳐 농축됩니다.

이 그림은 Turk 및 GA DH DNA 부위가 음성 대조군 영역 역할을 하는 동안 동일한 세포주에서 chirp SSE를 수행하여 결정된 1차 인간 포피 섬유아세포에서 4개의 열풍 결합 부위에 대한 QPCR 검증을 보여줍니다. 짝수 및 홀수 프로브 세트 모두 음의 영역에서 예상되는 열풍 결합 부위의 유사한 농축을 산출했습니다. 진정한 long non-coding RNA 결합 부위의 특징입니다.

긴 non-coding RNA 결합 부위의 글로벌 맵은 투여량 보상에 필요한 방식으로 X 염색체와 상호 작용하는 것으로 알려진 trla long non-coating RNA Rocks two의 이 데이터에 의해 설명되는 바와 같이 처프가 풍부한 DNA의 고처리량 시퀀싱에 의해 얻을 수 있습니다. 짝수 샘플과 홀수 샘플은 모두 별도로 시퀀싱되었으며 고유한 노이즈를 제거하여 각 피크가 이 절차를 시도하는 동안 두 개의 바인딩된 암석의 강한 광경을 나타내는 중첩 신호 트랙을 생성했습니다. 이 절차를 따라 올바른 RNA 무료 기술을 사용하는 것이 중요합니다.

단백질 수행 블로팅(protein do blotting)과 같은 다른 방법은 개발 후 관심 있는 비임상 DRNA와 어떤 단백질이 상호 작용하는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다. CHI는 RNA 생물학 분야의 연구자들이 배양 세포 및 고정 조직에서 RN aact를 매핑할 수 있는 길을 열었습니다.