효소 고정 및 안정화를위한 소수성 소금으로 바뀌었 Nafion

이 실험 절차의 전반적인 목적은 세포 내 효소 고정화 및 안정화를 위한 폴리머를 합성하는 것입니다. 이를 위해 먼저, nafion 현탁액과 화학적 ammonium bromide 염을 혼합하고, 혼합물을 볼텍싱하여 nafion의 단백질화 형태를 ammonium 염으로 교체합니다. 두 번째 단계는 혼합물을 weigh boat에 붓고 용매를 증발시켜 결과물인 폴리머를 건조하는 것입니다.

다음으로, 과잉 염을 제거하기 위해 폴리머를 탈이온수에 12~24시간 동안 담가 둡니다. 염 추출 후 폴리머를 물로 헹군 다음, 증발을 통해 폴리머를 완전히 건조시킵니다. 마지막 단계로 폴리머를 깨끗한 바이알로 옮기고 효소 고정화에 사용할 용매에 재현탁합니다. 최종적으로, 이 마이셀러 효소 고정화 폴리머는 활성 분석에서 효소의 안정성을 향상시키는 데 사용됩니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 절차가 매우 단순해 보이기 때문에 어려움을 겪을 수 있으나, 건조 과정은 기능성 고분자 제작에 있어 매우 결정적입니다. 이 절차의 시연은 본 연구실의 대학원생이 담당할 것입니다. Nafion을 Nerium 암모늄 염으로 수정하는 절차를 시작하십시오. Nafion 고분자의 술폰산 그룹 대비 3배 몰 과량의 알킬 암모늄 브로마이드 염을 측정하십시오.

alk 암모늄 브로마이드 염을 유리 바이알에 넣고 격렬하게 섞습니다. 5% w/v 나피온(nafion) 현탁액 병을 약 30초 동안 흔들어 나피온이 용액 내에 균일하게 분산되도록 합니다. 재분산된 나피온 2 mL를 피펫으로 취하여 AGU 암모늄 브로마이드 염이 들어 있는 유리 바이알에 첨가합니다.

바이알을 900 RPM에서 10~15분 동안 볼텍싱합니다. 그다음, 점성이 있는 용액을 플라스틱 칭량 트레이에 붓고, 파이펫을 사용하여 바이알에 남은 잔여 용액을 칭량 트레이로 옮깁니다. 본 예시에서는 웨잉 보트를 부분적으로 덮어 실험대 위에 두고, 6시간 이상 걸리는 증발 속도로 칭량 트레이에서 용매가 완전히 증발하도록 합니다.

적절한 증발 속도로 모든 용매를 완전히 증발시키면 여기 보이는 것처럼 칭량 트레이 바닥에 노란색 또는 갈색의 투명한 막이 남아야 합니다. 용매가 너무 빨리 증발하면 투명한 막 대신 딱딱하거나 결정질의 물질이 형성되며, 이는 폴리머의 마이셀 구조가 파괴되었음을 나타냅니다. 용매 증발이 너무 느리거나 암모늄염이 너무 오래 반응하여 과도한 수증기를 흡수하면, 끈적이는 오렌지색 젤 또는 흰색 결정질 물질이 형성됩니다.

어떤 경우든 절차를 다시 시작해야 합니다. 적절한 증발 속도로 모든 용매가 증발한 후, 칭량 트레이에 18 mega ohm centimeter 탈이온수를 10~20 milliliters 채워 덮고, 과잉의 알킬 암모늄 브롬화물 염과 HBR을 제거하기 위해 12~24시간 동안 담가 둡니다. 12~24시간 후, 물을 피펫으로 제거하고 트레이를 채울 만큼의 탈이온수를 다시 추가합니다. 이때 폴리머 필름의 일부를 소실하지 않도록 항상 필름에서 떨어진 곳에서 피펫팅하십시오.

헹굼 과정을 마친 후 총 3회 더 헹굽니다. 폴리머가 완전히 마를 때까지 칭량 트레이를 덮지 않은 상태로 둡니다. 완전히 마르면 폴리머는 투명하고 다소 잘 부러지는 플라스틱 필름 형태가 되어야 합니다.

반면, 제대로 건조되지 않은 폴리머는 여기에서 보는 바와 같이 염 추출 후 매우 다른 외관을 나타냅니다. 스패튤라를 사용하여 무게 측정 트레이에서 건조된 필름을 조심스럽게 제거한 후 깨끗한 유리 바이알로 옮깁니다. 에탄올 2 mL와 세라믹 혼합 비드 3개를 넣고, 폴리머 필름이 완전히 재현탁될 때까지 또는 4시간 동안 볼텍싱합니다.

이제 알킬 암모늄 변형 나노입자 용액을 효소 고정화에 사용할 준비가 되었습니다. 고정화할 효소가 건조 상태인 경우, 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 효소 1 mg을 정밀히 측정하여 넣고, 100 mM pH 7 인산염 완충액 1 mL를 첨가하여 1 mg/mL 효소 용액을 제조합니다. 이 1 mg/mL 효소 용액 120 µL를 새 튜브로 옮깁니다.

ALK 암모늄 변형 나피온 용액 60 µL를 첨가하고 10초 동안 볼텍싱합니다. 다수의 반복 실험을 위해 이 혼합물을 대량으로 준비해야 하는 경우, 효소와 폴리머 용액의 비율을 2:1로 유지해야 합니다. 마지막으로 효소 폴리머 용액 60 µL를 1 cm² 크기의 개별 큐벳 3개의 바닥에 각각 피펫으로 넣고 하룻밤 동안 건조시킵니다.

그 후, 시연된 바와 같이 효소 활성 분석을 통해 폴리머 필름 내 효소의 안정성을 평가할 수 있습니다. 다음으로 이 분석을 시작하기 위해, 변형된 nafion 폴리머와 NAD 의존성 탈수소효소가 공동 캐스팅된 큐벳에 다음 시약들을 첨가합니다: 50 millimolar로 조제된 sodium pyrophosphate 1.3 milliliters, 새로 조제한 15 millimolar nicotinamide adenine dinucleotide(NAD) 1.5 milliliters, 그리고 물 0.1 milliliters.

큐벳을 340 nm 파장으로 설정된 UV-Vis 분광광도계에 넣고 영점을 조절합니다. 분광광도계 큐벳에 0.1 mL의 에탄올을 첨가하고, 용액을 피펫으로 부드럽게 다섯 번 상하로 섞어 시약을 혼합합니다. 블랭크(blank)의 경우, 0.1 mL의 에탄올 대신 0.1 mL의 증류수를 사용합니다. 시약을 큐벳에 첨가한 5분 후에 340 nm에서의 흡광도를 기록합니다.

시약들을 qve에 첨가하고 20분 후에 흡광도를 다시 측정하십시오. 이 두 데이터 포인트는 그래프로 표시되어 고정화된 pq의 효소 특이 활성을 분석하기 위한 활성 계산에 사용될 기울기를 구하는 데 쓰입니다. Dependent dehydrogenase의 경우, 변형된 nafion 폴리머와 PQQ dependent dehydrogenase가 공동 캐스팅된 qve에 이러한 시약들을 피펫으로 분주합니다. 1.5 milliliters의 인산나트륨과 200 microliters의 600 micromolar pH methyls sulfate 또는 PMS를 사용합니다.

vete를 600nm 파장으로 설정된 UV-Vis 분광광도계에 넣고 영점을 조절합니다. 분광광도계에 700µL의 6-chloro-endemol 또는 DCIP와 200µL의 관심 기질을 혼합한 용액 100µL를 첨가합니다. 블랭크(blank)를 위해 피펫으로 용액을 5회 천천히 빨아들였다가 내뱉어 시약을 혼합합니다.

관심 기질 대신 200 µL의 물을 사용하십시오. 시약을 첨가한 5분 후에 600 nm에서 흡광도를 측정하십시오.

이 분석을 시작하기 위해 시약을 첨가한 20분 후에 흡광도를 다시 측정하십시오. 변형된 nafion 폴리머 및 glucose oxidase와 함께 공중합된 Q VET에 다음 성분을 포함하는 용액 2mL를 첨가합니다: 0.2 M para hydroxy benzoic acid, 0.02% Sodium azide, 128 units의 peroxidase, 0.3 mM 4-aminoantipyrine, 1 M potassium phosphate, 그리고 50 mM glucose.

피펫팅을 5회 반복하여 용액을 혼합합니다. 파장을 510 nanometers로 설정한 UV-visible 분광광도계에 Q vet을 넣습니다. qve에 시약을 첨가한 후 5분이 지났을 때 측정합니다.

510 nanometers에서 흡광도를 측정하십시오. 그 다음 시약 첨가 20분 후에 흡광도를 다시 측정하십시오. 이 표는 고정화된 NAD 의존성 포도당 탈수소효소 활성 및 선택된 변형 nafion 폴리머의 분석 결과를 보여줍니다.

고정화된 NAD 의존성 포도당 탈수소효소가 효소 및 완충액 용액보다 낮은 비활성을 나타내는 것이 관찰되었습니다. 이는 고분자 막이 거대 분자의 수송을 감소시키기 때문이며, 분석의 기질인 포도당은 크기가 작지만 보조효소인 NAD는 막 내부와 외부로 확산되어야 하기 때문입니다. NAD 의존성 탈수소효소의 경우, 고분자 내 고정화로 인한 수송 제한이 관찰되는 효소 활성을 감소시킵니다.

다음 표는 고정화된 PQQ 의존성 포도당 탈수소효소의 활성과 선택된 변형 나피온(nafion) 폴리머의 분석 결과를 보여줍니다. 여기서 대부분의 나피온 필름에 고정화된 효소가 완충 용액 내의 효소보다 더 높은 활성을 보인다는 점에 주목하는 것이 중요합니다. PQQ 의존성 포도당 탈수소효소는 막 결합 단백질이므로, 소수성으로 변형된 마이셀러 나피온은 완충액보다 활성 PQQ 의존성 포도당 탈수소효소를 안정화하는 데 더 막과 유사한 환경을 제공하며, 이에 따라 효소의 활성을 향상시킵니다.

마지막으로, glucose oxidase의 비활성 대표 분석 결과입니다. 고정화 및 선택된 변형 nafion 폴리머들이 이 표에 제시되어 있습니다. 세 가지 효소 각각에 대해 각 폴리머를 대상으로 실시한 효소 분석 결과, 효소 및 용액 대비 상대적 비활성의 경향은 효소 시스템의 함수임을 알 수 있습니다.

결과적으로, 각 효소에 필요한 정확한 폴리머를 최적화해야 합니다. 이 절차를 수행할 때, 건조 단계가 이 특정 과정에서 매우 중요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.