Name: 효소 고정 및 안정화를위한 소수성 소금으로 바뀌었 Nafion (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 배우세요 소수성 소금으로 변형된 Nafion을 이용한 효소 고정 및 안정화 방법입니다. 이 기술은 효소 활성 분석에서 효소 안정성을 향상시켜 생화학 연구에 활용됩니다.

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저자는 해군 연구소, 유나이티드 콩 보드, 그리고 자금 지원을위한 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 사무실을 인정합니다.

1. 제사기 암모늄 소금과 Nafion의 변경 <ol><li> 약 강력 5퍼센트 W / V Nafion 서스펜션의 병을 흔들어. 그 Nafion를 보장 30 초간 용액에 균일하게 정지됩니다. </li><li> 유리관 (유리병 볼륨 2.5 ML에서 10 ML에 포함할 수있는)으로 지금은 다시 정지 Nafion 2 ML을 피펫. </li><li> 3 배 어금니 초과 (Nafion 폴리머에 sulfonic 산 그룹에 상대적인) 알킬 암모늄 브로마이드 소금 (적절한 질량은 표 1에 표시된)의 측정과 Nafion의 2 ML이 들어있는 유리병에 이것을 추가합니다. </li><li> 10-15분위한 1,500 RPM의 소용돌이 병을. </li><li> 약 측정 플라스틱 무게 트레이에 점성 용액을 부어. 3인치 X 3, 무게 트레이에 약병에서 잔여 솔루션을 전송하는 피펫을 사용합니다. </li><li> 용매는 무게 트레이의 하단 (FI에 노란색 / 갈색, 투명 필름을두고, 무게는 배 밖으로 증발하도록 허용gure 2). 용매 증발의 비율은 증발하여 모든 용매에 대한 더 이상의 6 시간 소요 있도록해야합니다. 용매 증발 너무 빠른 경우, 흰색, 피각질의 재료는 폴리머의 micellar 구조가 파괴되었음을 나타내는 투명 필름 대신에 형성되며,이 절차를 다시 시작해야합니다. 용매 증발이 너무 느린 경우에는 증발의 너무 느린 일반적으로 볼품없는, 오렌지 젤로 연결하고 절차를 다시 시작해야하기 때문에, 드 가습기가 필요할 수 있습니다. 37 ° C. - 용매 증발에 대한 일반적인 온도 범위는 20입니다 건조를위한 실제 조건 방에 상대 습도와 온도의 함수지만, 그것은 중요 겔 형성하도록하기 위해서 건조 마이셀 구조를 유지할 느리게되고,하지만 너무 느려니다. </li><li> 채우기 18M Ωcm 드 이온화된 물 (물 10-20 ML), 커버와 함께 보트를 저울질하고, 초과 알킬 암모늄 브로마이드 소금과 HBR를 제거하는 12~24시간 동안 약물 사용하실 수 있습니다. </li><li&gt;는 물속으로 (혹은 피펫) 붓고 트레이 때마다 채우기 위해 충분한 DI 워터로 3 회 씻어. 이 단계 동안 폴리머 필름 중 하나를 잃게하지 않도록주의하십시오. </li><li> 폴리머는이 시점에서 완전히 건조까지 밝혀낸 앉을 수있는 무게 트레이를 허용, 폴리머는 분명하고 다소 부서지기 쉬운 플라스틱 필름이어야합니다. 공기가 매우 습기가있다면 다시, 드 가습기는 적시에 증발을 완료하는 데 필요할 수 있습니다. </li><li> 주걱을 사용하여 조심스럽게 무게 트레이에서 말린 필름을 제거하고 깨끗한 유리관에 그 파일을 전송합니다. </li><li> 에탄올 2 ML 그리고 3 세라믹 혼합 비즈, 4 시간 동안 와동을 추가 또는 폴리머 필름이 완전히 다시 정지 때까지. </li></ol> 2. 활동 Assays위한 TBAB-수정된 Nafion에 효소의 고정 <ol><li> 건조 효소의 경우 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 효소 중 1-10 밀리그램을 무게, 그리고 1-10 MG / ML 효소 솔루션을 만드는 데 100 밀리미터 산도 7 인산염 완충액 1 ML을 추가합니다. 정R 용액에 효소는 단백질의 양을 결정하는 bicinchoninic 산성 (BCA) 검정 13 사용하고 1-10 밀리그램 / ML로 단백질 농도를 가지고 100 MM 인산 버퍼의 적절한 금액을 추가합니다. 1-10 MG / ML은 일반적으로 1-50 nanomoles / ML에 해당합니다. </li><li> 1 MG / ML 효소 용액 120 μL, 10 초 동안 60 알킬 암모늄 - 수정된 Nafion 솔루션 μL, 그리고 소용돌이를 추가합니다. (이 혼합물은 복제 다수에 확장할 수 있습니다. 2시 1분에서 효소 - 투 - 폴리머 용액 비율을 유지.) </li><li> 피펫 60 세 별도 1cm 2 cuvettes의 하단에 효소 / 폴리머 솔루션의 μL, 그리고 하룻밤 건조하실 수 있습니다. </li></ol> 3. 고정화 NAD 의존 탈수소 효소의 분석 <ol><li> cuvette에 50 밀리미터 나트륨 pyrophosphate (산도 8.8) 1.3 ML, 15 MM NAD (신선한)의 1.5 ML, 그리고 0.1 ML 물을 추가합니다. </li><li> UV / VIS 분광 광도계 (예 : ThermoScientific Evolut에 cuvette를 배치이온 260 바이오 및 써모 Spectronic Genesys 20) 340 nm의 파장의 설정. </li><li> 분광계를 제로, 그리고 0.1 ML의 에탄올을 추가합니다. 부드럽게 5 번 아래로 솔루션을 pipetting 및하여 시약을 섞는다. 빈 경우, 별도의 물을 0.1 ML 대신 에탄올의 0.1 ML을 사용합니다. </li><li> 시약이 후 cuvette 20 분에 추가된 후 5 분 340 nm의 흡광도에서를 기록합니다. 활동 계산에 사용할 수 경사면을 얻기 위해 두 개의 데이터 포인트를 잡아. </li></ol> 4. 고정화 PQQ 종속 Dehydrogenases의 분석 <ol><li> cuvette로 인산 나트륨 1.5 ML (산도 7.3), 600 μm의 PMS 200 μL를 추가합니다. </li><li> 600 nm의 파장의 설정 UV / VIS 분광 광도계의 cuvette를 삽입 후 분광계를 제로. </li><li> 700 μL DCIP의 100 μL와 관심 기판 (에탄올, 아세트 알데히드, 글리세린, 포도당, 또는 glyceraldehyde) 200 μL를 추가하고 부드럽게 solut를 pipetting하여 시약을 섞어이온 위 아래로 5 번. 빈 들어, 200 물의 μL 대신 관심 기판을 사용합니다. </li><li> 시약이 후 cuvette 20 분에 추가된 후 5 분 600 nm의 흡광도에서를 기록합니다. </li></ol> 5. 고정화 포도당 산화 효소의 분석 <ol><li> cuvette에 0.2 M P-hydroxybenzoic 산, 0.02 % (W / V) 나트륨 azide, 128 U 퍼옥시데이즈, 4 aminoantipyrine 0.3 MM, 1 M 인산 칼륨, 50 MM 포도당을 포함하는 솔루션의 2.0 ML을 추가합니다. 5 번 아래로 pipetting 및하여 솔루션을 섞는다. </li><li> 510 nm의 파장의에 VIS / UV 분광 광도계 세트에 cuvette를 놓습니다. </li><li> 시약은시 20 분 cuvette하고 다시에 추가된 후 5 분 510 nm의 흡광도에서를 기록합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 수정된 Nafion 중합체의 micellar 구조는 원래 소금 / 고분자 공동 casted 필름도 FAS 건조에 의해 중단될 수 있습니다티. 그림 2 제대로 투명하게, 밝은 갈색 필름으로 인한 건조되었습니다 소금 / 폴리머 혼합물을 보여줍니다. 마르면 너무 빨리 건조 과정 micellar 구조를 파괴할 수있다는 사실에 의한 고분자의 불투명, 백색 박편을 초래할 수있는 영화. 수정된 Nafion 고분자와 효소가 혼합 및 cuvette의 하단에 공동 캐스팅되고 나면 효소 활동 assays는 폴리머 필름 내에서 효소의 안정성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 테이블 두 탈수소 효소의 2-4 쇼 분석 결과 그리고 포도당 산화 효소는 각각 다양한 바뀌었 Nafion 필름으로 고정. 수정된 Nafion의 폴리머가 실제로 특정 효소 (superactivity 불리는)의 활동을 향상시킬 수 있다고 보여주는, 버퍼 용액에 효소 수와 고정화되는 효소의 높은 활동을합니다. 다른 효소는 고분자에 그들을 고정했을 때 그들의 구체적인 활동을 감소 전송 제한이 있습니다 (그의 기판) 상당히 큰 macromolecules 있습니다 즉 cellulases 및 amylases. <table border="1"><tbody><tr><td> 사용 제사기 암모늄 염 </td><td> 3 배 초과 </td></tr><tr><td> T3A (tetrapropylammonium 브로마이드) </td><td> 32.37 MG / ML </td></tr><tr><td> TBAB (tetrabutylammonium 브로마이드) </td><td> 39.19 MG / ML </td></tr><tr><td> TPAB (tetrapentylammonium 브로마이드) </td><td> 46.​​01 MG / ML </td></tr><tr><td> TEHA (triethylhexylammonium 브로마이드) </td><td> 32.37 MG / ML </td></tr><tr><td> TMHA (trimethylhexylammonium 브로마이드) </td><td> 27.25 MG / ML </td></tr><tr><td> TMOA (trimethyloctylammonium 브로마이드) </td><td> 30.66 MG / ML </td></tr><tr><td> TMDA (trimethyldecylammonium 브로마이드) </td><td> 34.07 MG / ML </td></tr><tr><td> TMDDA (trimethyldodecylammonium 브로마이드) </td><td> 37.48 MG / ML </td></tr><tr><td> TMTDA (trimethyltetradecylammonium 브로마이드) </td><tD&gt; 40.89 밀리그램 / ML </td></tr><tr><td> TMHDA (trimethylhexadecylammonium 브로마이드) </td><td> 44.31 MG / ML </td></tr><tr><td> TMODA (trimethyloctadecylammonium 브로마이드) </td><td> 47.71 MG / ML </td></tr></tbody></table> 표 1. tetra-알킬 암모늄의 염분의 금액은 Nafion 폴리머 변형에 사용할. <table border="1"><tbody><tr><td> Nafion의 종류 </td><td> 효소 활동 (U / G) </td></tr><tr><td> 버퍼 (없음 폴리머) </td><td> 16.63 ± 8.11 </td></tr><tr><td> Nafion (un-mod.) </td><td> 9.25 ± 2.21 </td></tr><tr><td> TMTDA </td><td> 3.23 ± 2.92 </td></tr><tr><td> TBAB </td><td> 3.93 ± 3.33 </td></tr><tr><td> TMDDA </td><td> 4.19 ± 1.04 </td></tr><tr><td> TMOA </td><td> 3.51 ± 1.11 </td></tr><tr><td> TMDA </td><td> 8.00 ± 4.53 </td></tr><tr><td> TMHA </td><td> 1.68 ± 1.39 </td></tr><tr><td> TMHDA </td><td> 4.83 ± 0.99 </td></tr><tr><td> TMODA </td><td> 10.45 ± 3.20 </td></tr></tbody></table> 표 2 선택한 수정된 Nafion의 폴리머 (참고 : 고정화 활동이 효소의 초기 구체적인 활동의 기능입니다)에 고정화 NAD 의존 포도당 탈수소 효소 활동.. <table border="1"><tbody><tr><td> Nafion의 종류 </td><td> 효소 활동 (MU / g) </td></tr><tr><td> 버퍼 (없음 폴리머) </td><td> 7.18 ± 0.51 </td></tr><tr><td> Nafion (un-mod.) </td><td> 70.1 ± 0.5 </td></tr><tr><td> TMTDA </td><td> 133 ± 6 </td></tr><tr><td> TBAB </td><td> 244 ± 4 </td></tr><tr><td> TMDDA </td><td> 221 ± 6 </td></tr><tr><td> TMOA </td><td> 1.78 ± 0.63 </td></tr><tr><td> TMDA </td><td> 206 ±5 </td></tr><tr><td> TEHA </td><td> 40.1 ± 50.6 </td></tr><tr><td> TMHDA </td><td> 0 </td></tr><tr><td> TMODA </td><td> 1.45 ± 0.06 </td></tr></tbody></table> 표 3 PQQ 종속 포도당 탈수소 효소 활동 선택한 수정된 Nafion의 폴리머 (참고 : 고정화 활동이 효소의 초기 구체적인 활동의 기능입니다)에 고정화.. <table border="1"><tbody><tr><td> Nafion의 종류 </td><td> 효소 활동 (U / G) </td></tr><tr><td> 버퍼 (없음 폴리머) </td><td> 103.61 ± 3.15 </td></tr><tr><td> Nafion (un-mod.) </td><td> 19.93 ± 10.10 </td></tr><tr><td> TMTDA </td><td> 247.25 ± 12.49 </td></tr><tr><td> TBAB </td><td> 152.27 ± 5.29 </td></tr><tr><td> TMDDA </td><td> 262.05 ± 6.26 </td></tr><tr><td> TMOA </td><td> 129.18 ± 2.31 </td></TR&gt; <tr><td> TMDA </td><td> 141.23 ± 1.97 </td></tr><tr><td> TMHA </td><td> 131.75 ± 2.89 </td></tr><tr><td> TMHDA </td><td> 132.50 ± 1.18 </td></tr><tr><td> TMODA </td><td> 136.50 ± 0.96 </td></tr></tbody></table> . 표 4 대표 포도당 산화 효소 구체적인 활동 선택한 수정된 Nafion의 폴리머 (고정화 활동이 효소의 초기 구체적인 활동의 기능이다 메모)에 고정. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3949/3949fig1.jpg" /> 그림 1. Nafion 폴리머 및 효소 고정의 후속 사용에 TBAB의 정관의 도식. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3949/3949fig2.jpg" /> 그림 2. Nafion과 TBAB의 초기 공동 캐스트 필름의 광학 사진. 수확량에게 보를 덮고있는 투명한 밝은 갈색 필름을 건조 속도를무게 트레이의 ttom.

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

설명한 절차에 tetra-알킬의 암모늄 염은 효소를 고정하고 안정화하는 데 사용할 수 micellar 폴리머를 만드는 상용 Nafion을 수정하는 데 사용됩니다. assays는 폴리머는 활동의 높은 보존과 효소의 다양한 고정하는 데 사용할 수있는 절차 쇼에 설명되어. 관심 효소가 매우 낮은 활동이 아니면 불순한 경우, 높은 집중력이 필요할 수 있습니다 10 밀리그램 / ML 이상의 농도에서 효소를 immobilizing 않는 한 부동화 과정에 영향을 미치지 않습니다. 절차의 단순화는 더 합성 단계 (예 : 고분자 합성 또는 교차 연결하는 등) 필요하지 않습니다 점에서 다른 효소 고정 기법에서 분리시킵니다. 또한 이러한 합성 단계는 자주 단백질 변성 또는 극적으로 자신의 활동을 감소. 1mg/mL의 단백질 농도는 단순히 높은 효소를로드하기위한 제안 농도이다. 낮은 효소 농도는 항상 고용 수하지만 적은 용적 촉매 활동집니다. 효소는 디졸브로 이론적으로 높은 효소 농도는 오랫동안 사용할 수 있습니다. <p class="jov...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Nafion </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 70,160 </td></tr><tr><td> Tetra의 alkylammonium의 브로마이드 소금 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 알코올 탈수소 효소 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A3263 </td></tr><tr><td> 니코틴 아데닌 dinucleotide (NAD) </td><td> Simga - 올드 리치 </td><td> N7004 </td></tr><tr><td> 나트륨 pyrophosphate </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P8010 </td></tr><tr><td> Phenazine의 methosulfate (PMS) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P9625 </td></tr><tr><td> 2,6-Dichloroindophenol (DCIP) </td><td> 시그mA - 올드 리치 </td><td> D1878 </td></tr><tr><td> 포도당 산화 효소 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G7141 </td></tr><tr><td> 4 Hydroxybenzoic 산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 240,141 </td></tr><tr><td> 나트륨 azide </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S8032 </td></tr><tr><td> 퍼옥시데이즈 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P8375 </td></tr><tr><td> 4 aminoantipyrine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 06,800 </td></tr><tr><td> VIS / UV 분광 </td><td> 써모 </td><td> 진화 260 생물이나 Spectronic Genesys 20 </td></tr><tr><td> 와동 지니 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 분석 균형 </td><td></td><td></td></tr></tbody></ta경&gt;

효소 고정 및 안정화를위한 소수성 소금으로 바뀌었 nafion

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

지난 10 년 동안, biocatalysis, biosensors, 그리고 생물 연료 전지를 포함하여 고정화 및 안정화 효소에 대한 응용 프로그램의 풍부한이있었습니다. 가장 bioelectrochemical 애플 리케이션에서 1-3, 효소 또는 organelles은 어떤 유형의를 이용하여 전극 표면에 고정화되어 폴리머 매트릭스. 이 폴리머 비계는 효소 안정 유지하고와 모체의 밖으로 분자 및 이온의 손쉬운 보급을 위해 허용해야합니다. 고정 이러한 유형에 사용되는 대부분의 고분자는 polyamines 또는 polyalcohols을 기반으로하는 - 그들이 수소 또는 이온 결합을 통해 효소를 캡슐하고 안정화하는 효소의 자연 환경을 모방 고분자. 효소를 안정화하는 또 다른 방법은 효소를 캡슐과 안정 수있는 소수성 영역을 포함하는 micelles의 사용을 포함한다. 특히 4,5, Minteer 그룹은 상용 Nafion에 근거 micellar 폴리머를 개발하였습니다. 6,7 Nafion은자체는 양자와 기타 작은 양이온의 채널을 이용한 확산을 허용 micellar 고분자이지만, micelles 및 채널은 매우 소규모이며 폴리머 효소 고정을위한 불리 술폰산 사이드 체인으로 인해 매우 산성이다. 그러나, Nafion은 같은 tetrabutylammonium의 브로마이드 (TBAB)와 같은 소수성 알킬 암모늄 소금의 과잉과 함께 혼합되면 제사기 암모늄 양이온은 양자를 교체하고 폴리머 사이드 체인 (그림 1)에서 산염 그룹 카운터 이온이된다. 이러한 니코틴 아데닌 dinucleotide (NAD)와 같은 효소 기능을 위해 필요한 대형 기판과 이온의 확산을 허용 고분자 내에서 큰 micelles 및 채널에있는이 발생합니다. 이 수정된 Nafion 폴리머는 biosensors과 생물 연료 전지에 사용하기 위해 여러 효소의 종류뿐만 아니라, mitochondria를 고정하는 데 사용되었습니다. 8-12 본 논문이 마이크를 만들기위한 새로운 절차를 설명합니다효소의 안정화 수 ellar 폴리머 효소 고정 막. micellar 효소 고정 막, 멤브레인 내에 효소를 immobilizing 절차 및 고정화 효소의 효소 구체적인 활동을 유학 assays의 합성은 아래 자세히 설명되어 있습니다.

이 문서 hydrophobically 수정된 Nafion의 효소 고정 막 방법과 멤브레인 내에 단백질 및 / 또는 효소를 고정하고 구체적인 활동을 테스트하는 방법을 합성을위한 절차를 설명합니다.

효소 고정 및 안정화를위한 소수성 소금으로 바뀌었 Nafion

지난 10년 동안 생촉매, 바이오센서 및 바이오 연료를 포함하여 고정화 및 안정화된 효소의 활용 분야가 매우 다양해졌습니다...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 세포 내 효소 고정화 및 안정화를 위한 폴리머를 합성하는 것입니다. 이를 위해 먼저, nafion 현탁액과 화학적 ammonium bromide 염을 혼합하고, 혼합물을 볼텍싱하여 nafion의 단백질화 형태를 ammonium 염으로 교체합니다. 두 번째 단계는 혼합물을 weigh boat에 붓고 용매를 증발시켜 결과물인 폴리머를 건조하는 것입니다.다음으로, 과잉 염을 제거하기 위해 폴리머를 탈이온수에 12~24시간 동안 담가 둡니다. 염 추출 후 폴리머를 물로 헹군 다음, 증발을 통해 폴리머를 완전히 건조시킵니다. 마지막 단계로 폴리머를 깨끗한 바이알로 옮기고 효소 고정화에 사용할 용매에 재현탁합니다. 최종적으로, 이 마이셀러 효소 고정화 폴리머는 활성 분석에서 효소의 안정성을 향상시키는 데 사용됩니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 절차가 매우 단순해 보이기 때문에 어려움을 겪을 수 있으나, 건조 과정은 기능성 고분자 제작에 있어 매우 결정적입니다. 이 절차의 시연은 본 연구실의 대학원생이 담당할 것입니다. Nafion을 Nerium 암모늄 염으로 수정하는 절차를 시작하십시오. Nafion 고분자의 술폰산 그룹 대비 3배 몰 과량의 알킬 암모늄 브로마이드 염을 측정하십시오.alk 암모늄 브로마이드 염을 유리 바이알에 넣고 격렬하게 섞습니다. 5% w/v 나피온(nafion) 현탁액 병을 약 30초 동안 흔들어 나피온이 용액 내에 균일하게 분산되도록 합니다. 재분산된 나피온 2 mL를 피펫으로 취하여 AGU 암모늄 브로마이드 염이 들어 있는 유리 바이알에 첨가합니다.바이알을 900 RPM에서 10~15분 동안 볼텍싱합니다. 그다음, 점성이 있는 용액을 플라스틱 칭량 트레이에 붓고, 파이펫을 사용하여 바이알에 남은 잔여 용액을 칭량 트레이로 옮깁니다. 본 예시에서는 웨잉 보트를 부분적으로 덮어 실험대 위에 두고, 6시간 이상 걸리는 증발 속도로 칭량 트레이에서 용매가 완전히 증발하도록 합니다.적절한 증발 속도로 모든 용매를 완전히 증발시키면 여기 보이는 것처럼 칭량 트레이 바닥에 노란색 또는 갈색의 투명한 막이 남아야 합니다. 용매가 너무 빨리 증발하면 투명한 막 대신 딱딱하거나 결정질의 물질이 형성되며, 이는 폴리머의 마이셀 구조가 파괴되었음을 나타냅니다. 용매 증발이 너무 느리거나 암모늄염이 너무 오래 반응하여 과도한 수증기를 흡수하면, 끈적이는 오렌지색 젤 또는 흰색 결정질 물질이 형성됩니다.어떤 경우든 절차를 다시 시작해야 합니다. 적절한 증발 속도로 모든 용매가 증발한 후, 칭량 트레이에 18 mega ohm centimeter 탈이온수를 10~20 milliliters 채워 덮고, 과잉의 알킬 암모늄 브롬화물 염과 HBR을 제거하기 위해 12~24시간 동안 담가 둡니다. 12~24시간 후, 물을 피펫으로 제거하고 트레이를 채울 만큼의 탈이온수를 다시 추가합니다. 이때 폴리머 필름의 일부를 소실하지 않도록 항상 필름에서 떨어진 곳에서 피펫팅하십시오.헹굼 과정을 마친 후 총 3회 더 헹굽니다. 폴리머가 완전히 마를 때까지 칭량 트레이를 덮지 않은 상태로 둡니다. 완전히 마르면 폴리머는 투명하고 다소 잘 부러지는 플라스틱 필름 형태가 되어야 합니다.반면, 제대로 건조되지 않은 폴리머는 여기에서 보는 바와 같이 염 추출 후 매우 다른 외관을 나타냅니다. 스패튤라를 사용하여 무게 측정 트레이에서 건조된 필름을 조심스럽게 제거한 후 깨끗한 유리 바이알로 옮깁니다. 에탄올 2 mL와 세라믹 혼합 비드 3개를 넣고, 폴리머 필름이 완전히 재현탁될 때까지 또는 4시간 동안 볼텍싱합니다.이제 알킬 암모늄 변형 나노입자 용액을 효소 고정화에 사용할 준비가 되었습니다. 고정화할 효소가 건조 상태인 경우, 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 효소 1 mg을 정밀히 측정하여 넣고, 100 mM pH 7 인산염 완충액 1 mL를 첨가하여 1 mg/mL 효소 용액을 제조합니다. 이 1 mg/mL 효소 용액 120 µL를 새 튜브로 옮깁니다.ALK 암모늄 변형 나피온 용액 60 µL를 첨가하고 10초 동안 볼텍싱합니다. 다수의 반복 실험을 위해 이 혼합물을 대량으로 준비해야 하는 경우, 효소와 폴리머 용액의 비율을 2:1로 유지해야 합니다. 마지막으로 효소 폴리머 용액 60 µL를 1 cm² 크기의 개별 큐벳 3개의 바닥에 각각 피펫으로 넣고 하룻밤 동안 건조시킵니다.그 후, 시연된 바와 같이 효소 활성 분석을 통해 폴리머 필름 내 효소의 안정성을 평가할 수 있습니다. 다음으로 이 분석을 시작하기 위해, 변형된 nafion 폴리머와 NAD 의존성 탈수소효소가 공동 캐스팅된 큐벳에 다음 시약들을 첨가합니다: 50 millimolar로 조제된 sodium pyrophosphate 1.3 milliliters, 새로 조제한 15 millimolar nicotinamide adenine dinucleotide(NAD) 1.5 milliliters, 그리고 물 0.1 milliliters.큐벳을 340 nm 파장으로 설정된 UV-Vis 분광광도계에 넣고 영점을 조절합니다. 분광광도계 큐벳에 0.1 mL의 에탄올을 첨가하고, 용액을 피펫으로 부드럽게 다섯 번 상하로 섞어 시약을 혼합합니다. 블랭크(blank)의 경우, 0.1 mL의 에탄올 대신 0.1 mL의 증류수를 사용합니다. 시약을 큐벳에 첨가한 5분 후에 340 nm에서의 흡광도를 기록합니다.시약들을 qve에 첨가하고 20분 후에 흡광도를 다시 측정하십시오. 이 두 데이터 포인트는 그래프로 표시되어 고정화된 pq의 효소 특이 활성을 분석하기 위한 활성 계산에 사용될 기울기를 구하는 데 쓰입니다. Dependent dehydrogenase의 경우, 변형된 nafion 폴리머와 PQQ dependent dehydrogenase가 공동 캐스팅된 qve에 이러한 시약들을 피펫으로 분주합니다. 1.5 milliliters의 인산나트륨과 200 microliters의 600 micromolar pH methyls sulfate 또는 PMS를 사용합니다.vete를 600nm 파장으로 설정된 UV-Vis 분광광도계에 넣고 영점을 조절합니다. 분광광도계에 700µL의 6-chloro-endemol 또는 DCIP와 200µL의 관심 기질을 혼합한 용액 100µL를 첨가합니다. 블랭크(blank)를 위해 피펫으로 용액을 5회 천천히 빨아들였다가 내뱉어 시약을 혼합합니다.관심 기질 대신 200 µL의 물을 사용하십시오. 시약을 첨가한 5분 후에 600 nm에서 흡광도를 측정하십시오.이 분석을 시작하기 위해 시약을 첨가한 20분 후에 흡광도를 다시 측정하십시오. 변형된 nafion 폴리머 및 glucose oxidase와 함께 공중합된 Q VET에 다음 성분을 포함하는 용액 2mL를 첨가합니다: 0.2 M para hydroxy benzoic acid, 0.02% Sodium azide, 128 units의 peroxidase, 0.3 mM 4-aminoantipyrine, 1 M potassium phosphate, 그리고 50 mM glucose.피펫팅을 5회 반복하여 용액을 혼합합니다. 파장을 510 nanometers로 설정한 UV-visible 분광광도계에 Q vet을 넣습니다. qve에 시약을 첨가한 후 5분이 지났을 때 측정합니다.510 nanometers에서 흡광도를 측정하십시오. 그 다음 시약 첨가 20분 후에 흡광도를 다시 측정하십시오. 이 표는 고정화된 NAD 의존성 포도당 탈수소효소 활성 및 선택된 변형 nafion 폴리머의 분석 결과를 보여줍니다.고정화된 NAD 의존성 포도당 탈수소효소가 효소 및 완충액 용액보다 낮은 비활성을 나타내는 것이 관찰되었습니다. 이는 고분자 막이 거대 분자의 수송을 감소시키기 때문이며, 분석의 기질인 포도당은 크기가 작지만 보조효소인 NAD는 막 내부와 외부로 확산되어야 하기 때문입니다. NAD 의존성 탈수소효소의 경우, 고분자 내 고정화로 인한 수송 제한이 관찰되는 효소 활성을 감소시킵니다.다음 표는 고정화된 PQQ 의존성 포도당 탈수소효소의 활성과 선택된 변형 나피온(nafion) 폴리머의 분석 결과를 보여줍니다. 여기서 대부분의 나피온 필름에 고정화된 효소가 완충 용액 내의 효소보다 더 높은 활성을 보인다는 점에 주목하는 것이 중요합니다. PQQ 의존성 포도당 탈수소효소는 막 결합 단백질이므로, 소수성으로 변형된 마이셀러 나피온은 완충액보다 활성 PQQ 의존성 포도당 탈수소효소를 안정화하는 데 더 막과 유사한 환경을 제공하며, 이에 따라 효소의 활성을 향상시킵니다.마지막으로, glucose oxidase의 비활성 대표 분석 결과입니다. 고정화 및 선택된 변형 nafion 폴리머들이 이 표에 제시되어 있습니다. 세 가지 효소 각각에 대해 각 폴리머를 대상으로 실시한 효소 분석 결과, 효소 및 용액 대비 상대적 비활성의 경향은 효소 시스템의 함수임을 알 수 있습니다.결과적으로, 각 효소에 필요한 정확한 폴리머를 최적화해야 합니다. 이 절차를 수행할 때, 건조 단계가 이 특정 과정에서 매우 중요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

hydrophobic-salt-modified-nafion-for-enzyme-immobilization

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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