דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק עכברים בוגרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושראים, או iPSCs, באמצעות השלמה של עוברים טטראפלואידיים. דבר זה מושג תחילה על ידי השגת iPSCs מפיברובלסטים עובריים של עכבר באמצעות לנטי-וירוסים, הנושאים את OCT four, SOX two, KLF four ו-c-Myc, והוספת חומצה ואלפרואיים או VPA למצע הגידול.

לאחר יצירת ה-IPCs, הם מאופיינים באמצעות צביעה אימונולוגית, ספירת כרומוזומים ובדיקת יצירת גוף עוברי. השלב הבא הוא יצירת בלאסטוציסטות טטראפלואידיות מקבלות באמצעות היתוך ותרבית in vitro. לאחר מכן, ה-IPSC מוזרקים לבלאסטוציסטות טטראפלואידיות, והבלאסטוציסטות המשלימות מושתלות לנקבות מקבלות לצורך הריון.

בשלב הסופי, בעלי חיים במועד מלא מולדים בניתוח קיסרי ומועברים לאמהות surrogate. זאת כדי שניתן יהיה לעקוב אחר ההתפתחות postnatal. ובסופו של דבר, לבדוק אם נוצרו בעלי חיים בני חיים במועד מלא.

קו תאי ה-IPSC של הבדיקה נחשב לפלוריפוטנטי באופן מלא. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות להפקת תאי iPSC הוא ששיטתנו מייצרת באופן רב-חזרתי קווי תאי IPS פלוריפוטנטיים באופן מלא. קווי תאי IPS שהופקו בשיטות אלה עשויים להועיל לחוקרים אחרים המעוניינים להשוות את הפלוריפוטנטיות של תאי ה-IPS שלהם או לבסס את השקילות של שיטות תכנות מחדש אחרות. שיטות אלו יהיו מועילות לחוקרים המעוניינים לייצר קווי תאי IPS פלוריפוטנטיים באופן מלא עבור יישומים המשכיים ספציפיים, כגון בדיקות דיפרנציאציה in vitro.

בנוסף, יצירת עכברי iPSC. שימוש בהשלמה טלומרית עשוי לשמש כאמצעי יעיל לקביעת היציבות הגנטית והאפיגנטית של קווי תאים שונים. המניפולציות המיקרוסקופיות הכרוכות בהשלמת עובר טטרהפלואידי הן מאתגרות מבחינה טכנית.

עשויים להידרש מספר חודשים עד שמישהו יהיה מיומן בטכניקות שפותחו עבור iPSC. טכניקה זו דורשת תנאי תרביית דומים לאלו המשמשים בניסויי תכנון גנים (gene targeting) מסורתיים של ESC. 24 שעות לאחר התעתוק של תאי HEC 2 9 3 T באמצעות לנטיווירוס, יש להסיר את מצע הגידול ולהחליפו ב-25 milliliters של מצע טרי וחומם מראש.

החזירו את התאים שעברו טרנספקציה למדגרה למשך 24 שעות. 48 שעות לאחר טרנספקציה של תאי HEC 2 9 3 T באמצעות לנטי-וירוס, אספו את מצע הגידול המכיל חלקיקים לנטי-וירוס מהתאים שעברו טרנספקציה. הסירו שקיעים חלקיקיים ממצע ההגידול המכיל את הוירוס על ידי סרימרגציה במהירות של 3000 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, רכזו את הוירוס באמצעות אולטרסנטריפוגציה דרך כרית סוכרוז 20% למשך שעתיים במהירות של 112, 000 Gs בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

שפכו בזהירות את הנוזל למכל פסולת לצורך דה-קונטמינציה, מבלי להפריע למשקע הוויראלי. השביו את המשקע הוויראלי ב-0.4 milliliters של מצע גידול לפיברובלאסטים עובריים של עכבר ואטמו את המבחנה. לאחר מכן, נערו אותה בעדינות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך 15 עד 30 דקות.

יש לאחסן חלקיקים ויראליים ואליקווטים לשימוש חד-פעמי בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. קווי IPSC הופקו מפיברובלסטים עובריים של עכבר, או מתאי meth. ברגע שמושבות IPSC מציגות גבול ברור ובוהק עם מקריעות גבוהה ומכילות 30 עד 50 תאים, הן מוכנות לברירה ידנית ולהרחבה כקווי IPSC עצמאיים.

בחרו מושבות בודדות באמצעות טיפ של פיפט להעמסת ג'ל והעבירו כל מושבה ישירות לבאר בודדת בלוחית 96 בארות בעלת תחתית בצורת U המכילה 20 µL של trypsin EDTA בריכוז 0.25%. דגרו את המושבות שנבחרו ואת ה-trypsin למשך כשמונה דקות בטמפרטורה של 37 °C או עד שהמושבות יתפרקו לתאים בודדים. עקבו אחר התקדמות הפירוק באמצעות מיקרוסקופיית אור. ייתכן שיהיה צורך בניעור עדין.

העבירו את תרחיף התאים המופרדים לפלטת 96 בארות המכילה שכבת תאי מאכלס (feeder layer) ו-150 µL של מצע ESC מועשיר ב-doxycycline ו-VPA. כאשר מושבות IPSC יופיעו שוב בכל באר, פצלו אותן לבארים גדולות יותר לצורך ניתוח ובנקאות תאים, תוך שימוש בנהלי גזירה וטיפוח תאים סטנדרטיים של ESC, כדי להתחיל את ההליך ליצירת tetraploid blast assist. עוברים בשלב תא אחד שנאספו מעכברים נקבה תורגדו למשך לילה לעוברים בשלב שני תאים ב-KSOM בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. ביום למחרת, הניחו BTX micro slide בתוך צלחת פטרי בקוטר 10 cm.

שפכו כמות מספקת של מדיום אלקטרו-פיוזיה בטמפרטורת החדר כדי להטביע את השקופית בתמיסה, אך לא בכמות שתטביע לחלוטין את קטב האלקטרודה. הפעילו את ה-BTX electro cell manipulator ECM 2001 ואת ה-BTX enhancer 400. חברו את כבלי ה-ECM לאלקטרודה של השקופיות המיקרוסקופיות וקבעו את הכבלים לדופן של פטרי dish כדי למנוע תזוזה לא רצויה של השקופית.

בצעו פעימה ידנית אחת כדי לקבל קריאה במגביר ה-BTX ורשמו את המתח של זרמי ה-DC המופעלים. זרם ה-AC ישלוט במהירות שבה העוברים יסתדרו בין האלקטרודות. זרם ה-DC ימזג את הבלסטומרים וזמן הפעימה יקבע את אורך פעימת ה-DC.

נקודת התחלה טובה היא AC של 3 volts, DC של 100 volts וזמן של 0.05 milliseconds. ה-DC האופטימלי משתנה בטווח של 90 עד 150 volts. השתמש בפ pipette פה.

קחו 30 עד 42 עוברי תאים מתרבית KSOM והעבירו אותם לטיפה של מדיום electro fusion. בצעו שטיפה של המדיום דרך מספר טיפות של מדיום electro fusion. לאחר מכן, שאבו מדיום electro fusion טרי מהצלחת המיקרו-סלייד לתוך הפפיטה (mouth pipette).

קחו את העוברים השטופים והניחו אותם במרווח של מילימטר אחד בין האלקטרודות על השקופית המיקרוסקופית. הקפידו שהעוברים יהיו מיושרים במרכז המרווח ושלא יהיו במגע זה עם זה. הפעילו זרם AC על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה הידני.

העוברים יסתובבו בשדה ה-AC עד שמישור מגע הבלסטומרים יהיה מקביל לאלקטרודות. אם העוברים אינם מיושרים תוך מספר שניות, הגבירו את הגדרת ה-AC. לאחר שהעוברים ייושרו, לחצו שוב על כפתור ההפעלה הידני כדי להחיל את פולס ה-DC עם מדיום למיזוג חשמלי בתוך הפפית.

אספו את העוברים מהשקופית המיקרוסקופית, שטפו אותם באמצעות מספר טיפות של תוך KSOM ולאחר מכן תרבתו את העוברים ב-KSOM תחת שמן מינרלי בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. איחוי הבלסטומרים צריך להסתיים תוך פחות מ-30 דקות. במהלך התרבית, עקבו ובחרו עוברים שבהם בוצע איחוי מוצלח של הבלסטומרים.

עוברי מיזוג ייראו כנמצאים בשלב תא אחד; יש להשליך עוברי ליזיס ועוברי שני תאים לאחר 30 דקות בתרבית, ולהמשיך בגידול של עוברי המיזוג בטיפות מיקרו של KSOM תחת שמן מינרלי בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. כדי להכין IPCs להזרקה לבלסטוציסטים, יש להפשיר IPCs שהוקפאו מראש ולזרוע אותם על תאי מאכלה (feeders) במצע ESC; יש לבצע מעבר (passage) לתאים לפחות פעם אחת על תאי המאכלה לאחר ההפשרה ולפני השימוש להזרקה.

באר אחת בלוחית בעלת שש בארות המכילה IPCs בfluence של 70% עד 80% תספק מספר תאים מספיק ומעבר לכך עבור ההזרקה. שאבו את מצע הצמיחה ושטפו את התאים באמצעות 3 milliliters של PBS ללא סידן או מגנזיום. הוסיפו 0.5 milliliters של 0.05%tripsin EDTA שחומם מראש לתאים והדגרימו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 10 דקות, תוך ניעור מזדמן. הוסיפו 3.0 milliliters של מצע ESC וערבבו עד לקבלת ת сусפנזיה של תאים בודדים. בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שנוצרה סספנזיה של תאים בודדים; מושבות או צבירי תאים יסתימו את פיפטת ההזרקה. לאחר שהושגה סספנזיה של תאים בודדים, הוסיפו מיליליטר אחד של מצע ESC לבאר והחזירו את הלוחית למדגרה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

דגרו למשך כ-15 דקות או עד שמרבית תאי המזינה (feeder cells) יחלו להיצמד, והסירו בעדינות את המצע המכיל את ה-IPCs. יש להיזהר כדי לא לנתק את תאי המזינה שנצמדו. העבירו את ה-IPCs למבחנה קונית של 15 milliliter המכילה חמישה milliliter של מצע ESC, וסבבו בצנטריפוגה ב-200 Gs למשך חמש דקות.

שאבו את הנוזל העליון והסירו את שארית מצע ה-ESC באמצעות מיקרופיפטה. הקישו על המבחנה כדי לשחרר את המשקע והשביו בעדינות את התאים ב-0.2 עד 0.5 milliliters של מצע FHM שקולקל מראש. אחסנו את התאים על קרח עד להזרקה ולמהלכה לתוך בלאסטוציסטות טטראפלואידיות. לקבלת הפרוטוקול להזרקה לבלאסטוציסטות, עיינו במאמר המלווה את סרטון זה ובמאמר JoVE שפורסם בעבר, שקטע ממנו מוצג כאן על המסך.

בתמונות הללו מוצגות דוגמאות להתקדמות המורפולוגית מפיברובלסטים ועד למושבות IPSC במהלך ניסוי תכנות מחדש. יש לצפות להיווצרות הגנתיות מורפולוגיות ומושבות IPSC שתוכננו מחדש באופן חלקי החל מארבעה עד חמישה ימים לאחר הוספת doxycycline VPA, כפי שמוצג בלוחות B עד EESC. מושבות דמויות IPSC צפויות להופיע בין שבעה ל-10 ימים, כפי שמוצג בלוח F. ייצורו של עובר בעל תא אחד (telo embryo) באמצעות היתוך חשמלי של עוברים דיפלואידיים בעלי שני תאים הוא יעיל ביותר.

נהוג להבחין עד 95% מעוברי שני תאים שעברו טיפול התמזגו בהצלחה כדי להפיק עוברי תא אחד טטרהפלואידיים. הפרוטוקול ששימש בניסוי זה להזרקת IPSC לתוך בלאסטוציסט טטרהפלואידי דומה לפרוטוקול להזרקת ES cells לתוך בלאסטוציסט דיפלואידי ליצירת עכברי כימרה. כדי לשלול בקלות יצירה של כימרה דיפלואידית, נבחרים בזהירות, במידת האפשר, פיגמנטים של זני עכברים שונים ליצירת ה-iPS cells והעוברים הטטרהפלואידיים. בדוגמה זו, עוברים טטרהפלואידיים הופקו מזן לבנוני (albino) ו-iPSC הופקו מזן בעל פיגמנטציה.

לפיכך, עכברי IPSC שנולדו מציגים עיניים עם פיגמנט וצבע פרווה אחיד בבגרותם, בעוד שעכברי kyras דיפלואיד יציגו גווני צבע מעורבים של אלביניזם ופיגמנטציה. מספר הגורים החיים שנולדים תלוי בשורת התאים, כפי שמוצג בטבלה זו. עבור שורת IPSC ממוצעת ואיכותית, על החוקרים לצפות שבין 1% ל-10% מהבלאסטוציסטים המוזרקים יניבו גורים חיים שנולדו.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק תאי IPS פלוריפוטנטיים לחלוטין וכן כיצד לתקף את הפוטנציאל ההתפתחותי שלהם. באמצעות שימוש במבחן השלמה טטרפלואידי, לאחר שליטה בטכניקה זו – מהפקת MES ועד לעכבר IPSC ניבול – ניתן להשלים את התהליך תוך חודשיים עד שלושה חודשים. פיתוח ותחזוקה של תאי IPS דורשים רמה גבוהה של טכניקת תרביות תאים.

ניסיון קודם עם תרביות ESL הוא חיוני. זכרו כי עבודה עם לנטיווירס, ובמיוחד עם לנטיווירס רכז, עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש להשתמש תמיד בציוד המגן האישי הנדרש על ידי המוסד שלכם, ולהקפיד לטפל בכל חומר שהיה במגע עם הנגיף באמצעות 10% bleach למשך 20 דקות לפחות לאחר ביצוע הליך זה.

ניתן לנתח את כל עכברי ה-IPSC ואת רקמותיהם עבור פנוטיפים פיזיולוגיים, פתולוגיים והתנהגותיים.