Name: 세포에 붙어 Antileishmanial 검사에 대한 기생충 구조 및 변화 분석 Leishmania donovani Amastigotes (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 학습하세요 THP1 세포를 이용한 Leishmania donovani 아마스티고트의 항리슈만증 약물 스크리닝 방법을. 이 기술은 살아있는 세포내 기생충만 정량하여 신약 개발에 필수적인 정확한 결과를 제공합니다.

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NCNPR-USDA-ARS 과학 계약 번호 58-6408-2-0009, 미 육군 의료 연구 및 Materiel 명령에 의해 CDMRP 부여 수상 # W81XWH-09-2-0093.

1. THP1 세포 배양을 유지하고 하위 문화 <ol><li> 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 RPMI-1640 배지에 THP1 세포를 (10 % FBS와 산도 7.4 포함) 유지합니다. </li><li> 하위 문화 셀 1x10 6 세포 / ML을 초과 세포 수를 방지하기 위해 일주일에 두 번. 이 자신의 변환 능력을 유지하는 것이 중요합니다. </li></ol> 2. 유지 하위 문화 Leishmania donovani Promastigotes 문화 <ol><li> L.을 유지 RPMI-1640에 donovani promastigotes (S1, 수단 변형) 26 10 % FBS와 매체 (나트륨 탄산 수소 나트륨 Pyruvate 없음) ° C. </li><li> 하위 문화 L. donovani 20-25x10 6 promastigotes / ml.Caution의 범위에서 높은 세포 농도와 함께 일주일에 두 번 promastigotes : 모든 미디어 솔루션은 사용하기 전에 실내 온도에 가져해야합니다. </li></ol> 3. 9 심는 및 THP1 세포의 차별화6 잘 Microplate 및 16 실의 유리 문화 슬라이드. <ol><li> 10% 열 inactivated FBS와 RPMI-1640에 4 일짜리 세포 배양에서 2.5x10 5 세포 / ML (셀 카운트가 10 6 세포 / ML을 초과하지 않아야 함)의 세포 수와 희석 THP1 문화를 준비합니다. 각 16도 챔버 슬라이드 각 96 - 웰 플레이트와 문화 4 ML을위한 문화의 20 ML을 준비했습니다. </li><li> phorbol 12-myristate 희석 세포 배양 정지 13 - 아세테이트 (PMA) (THP1의 차별화를위한) (50 μg / DMSO의 ML의 주식에서 10 μl/20 ML의 문화) (희석 셀 문화에 최종 PMA 농도이어야을 추가 25 NG / ML). </li><li> 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 기생충 - 구조 - 변환 - 검정을 비교하려면 분명 평면 바닥, 96 - 웰 플레이트 및 16 실, 유리, 미세 문화 슬라이드에 동시에 assays을 설정합니다. </li><li> 각도 또는 챔버에 THP1-PMA-처리 셀 200 μl을 투여. </li><li> 96 - 웰 P를 품다세포의 거의 완전한 차별화를 허용 5 % CO 2 인큐베이터 밤 37 ° C에서 lates 및 16도 챔버 슬라이드. </li></ol> 참고 : 일반적으로 정지 성장 THP1 세포, 점착성의 대 식세포로 구별됩니다. 4. Leishmania donovani Promastigotes로 변형 THP1 세포의 감염 <ol><li> Leishmania donovani promastigotes과 차별화 된 THP1 세포 배양의 감염, 기생충의 대부분은 infective의 metacyclic 단계 (긴 원통형 양식, ~ 5~6일 옛 문화)에 있어야합니다. </li><li> 기생충 비율 1시 10분 THP1 셀은 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 검정과 Promastigote - 구조 - 변환 - 검정 모두에서 감염 최적입니다. </li><li> L.의 희석 문화를 준비 에서 : donovani는 2.5x10 6 기생충 / ML의 기생충 카운트 (기생충의 비율 = 1시 10분 THP1 전지)로 promastigotes2퍼센트 FBS와 RPMI-1640 배지에서 5-6 일짜리 문화. </li><li> 단계 3.5 (THP1 세포 문화의 밤 차별화 후)에서 접시와 챔버 슬라이드를 꺼내 매체를 제거하고 혈청이없는 RPMI-1640 배지로 한 번 셀 문화를 씻는다. </li><li> 주의 세척 후 PMA-치료 혈청 무료, 따뜻한 RPMI-1640 (~ 37 ° C), 중간, L.의 희석 문화 200 μl와 혈청이없는 미디어를 대체와 THP1 세포를 donovani promastigotes (2.5x10 6 기생충 / ML) 단계 4.3에서. 각 판 및 16도 챔버 슬라이드에 THP1 세포없이 THP1 기생충이없는 세포와 기생충의 제어 우물을 설정합니다. </li><li> THP1 세포 배양에 기생충을 추가 한 후, 37시 플레이트와 슬라이드를 길러 ° C, 5 % 기생충은 차별화 된 THP1 세포를 감염 할 수 있도록 24 시간에 대한 CO 2. </li></ol> 5. 시험 의약품 / ​​화합물에 감염된 대 식세포의 치료 <ol><li> 테스트Amphotericin B, Pentamidine 및 심사에 대한 표준 안티 leishmanial 의약품 등 Miltefosine. 물이나 DMSO는 등의 시약 테이블에서 언급에서 의약품 / ​​테스트 화합물의 주식 솔루션을 준비합니다. 6 농도에서 각 약물 화합물을 테스트합니다. </li><li> 순차적으로 2% FBS와 RPMI-1640 배지와 신선한 96 - 웰 플레이트 또는 2 ML 튜브 (챔버 슬라이드에 대한)에 (1:5) 표준 의약품 및 테스트 화합물을 희석. 이 판의 의약품 / ​​테스트 화합물 농도는 최종 농도의 2 배입니다. </li><li> L.에 감염 문화 판과 챔버 슬라이드를 씻으십시오 donovani의 promastigotes (단계 4.5) 혈청 무료, RPMI-1640 배지로 5 배 이상. 각도 / 챔버에 100 μl 배양액 (2 % FBS와 RPMI-1640)를 추가합니다. 여러 washings은 비 internalized promastigotes의 완전한 제거를 보장 할 필요가 있습니다. </li><li> 각도 또는 챔버에 순차적으로 희석 된 표준 안티 leishmanial 의약품 또는 시험 화합물에서 100 μl 매체를 추가 할 수 있습니다. infec 설정테드 THP1 세포는 각 판 / 챔버 슬라이드에 동시에 약물없이 제어합니다. </li><li> 37 플레이트와 챔버 슬라이드를 길러 ° C, 48 시간에 대한 5% CO 2. </li></ol> 6. 챔버 슬라이드 염색, 형광 현미경 이미징 및 이미지 분석 감염의 정량화 및 약물 치료의 효과 <ol><li> 48 시간의 배양 후 혈청이없는 RPMI-1640 배지와 챔버 슬라이드에게 3 번 씻는다. 슬라이드에서 플라스틱 챔버 보지 30 초에 메탄올에서 슬라이드를 immersing하여 세포를 해결할 수 있습니다. 건조 공기 흐름에 따라 바이오 후드에 슬라이드를 둡니다. </li><li> (1:2,000), 주식 (10,000 X) 물을 diluting하여 SYBR 그린 I 착색 솔루션을 (5 배) 준비합니다. </li><li> 전 실온에서 15 분을위한 솔루션을 얼룩 희석 SYBR 녹색과 어두운 상황에서 슬라이드를 얼룩, 물 한 번 씻고 건조 공기 흐름에 따라 슬라이드를 두십시오. </li><li> 왠을 통해 전체 유리 coverslip를 삽입설치 매체의 도움으로 네드 슬라이드. </li><li> THP1 세포의 디지털 이미지를 캡처 : 감염 (빈)없이 감염 (제어), 감염된 세포는 함께 니콘 이클립스 90i 형광 현미경을 사용하여 다른 dilutions에서 다른 표준 의약품이나 시험 화합물 (그림 3, 5, 6))로 치료 NIS 요소 AR 3.2 소프트웨어를 사용하여. </li><li> 대 식세포의 핵 (큰) 및 기생충 핵 (kinetoplast과 작은) 국립 보건원 (에서 개발 공개적으로 - 가능한 자바 기반의 이미지 처리 프로그램입니다 ImageJ (그림 7)를 사용하여 카운트 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsb합니다. info.nih.gov / 엘 제이 / download.html</a> ). 100 당 amastigotes의 수는 THP1 세포를 변형으로 데이터를 표현한다. </li></ol> 7. 기생충 - 구조 - 변환 - 검정 : L.의 제어 용해 donovani Amastigotes에 감염된 대 식세포<ol><li> 단계에서 96 잘 microplate을 씻으 5.5 세 혈청이없는 RPMI-1640 배지와 시간. </li><li> 다른 농도, 30에 0.05 % SDS 처리에서 시험 다른 세제 중 sec는 제어 용해 (구출 기생충 &#39;생존의 최소 손실과 최대 세포 용해)에 대한 최적입니다. </li><li> 마지막 세척 후 각 우물에서 혈청 무료 미디어를 제거하고 각 잘에 RPMI-1640의 20 μl를 (0.05 % SDS로)를 추가합니다. 30 초에 판을 흔들어서 각 우물 (10 % FBS 포함) RPMI-1640 180 μl 전체를 추가합니다. </li><li> promastigotes에 구조 amastigotes의 변화에​​ 대한 48 시간에 26 ° C에서 접시를 품다. </li></ol> 8. 변형 Promastigote의 정량 분석​​ (alamarBlue 분석) <ol><li> 26 48 시간의 배양 후 ° C가 모두 구출 라이브 amastigotes이 promastigotes (그림 1D)로 변환됩니다. 96 - 웰 P의 각도에 alamarBlue의 10 μl를 추가합니다lates. </li><li> 26 ° C 하룻밤에 번호판을 품다. </li><li> 박 부화 후 544 나노 미터 여기, 590nm 방출에 Fluostar 갤럭시 fluorimeter (BMG 연구소 기술)에 표준 형광의 접시를 참조하십시오. </li><li> ExcelFit (그림 7-9)와 컴퓨팅 IC 이러한 곡선에서 50 / IC 90 값 (표 1)과 함께 복용 응답 곡선 (약물 또는 시험 화합물의 %의 성장 대 농도) 준비합니다. </li></ol> 9. 기생충 비율에 THP1 셀의 표준화 <ol><li> 분석의 감도를 결정하는 기생충의 비율로 THP1 세포를 표준화. 참고 : 낮은 / 기생충 번호 고 / 감염이 감도 및 심사의 선택성을 손상시킬 수 있습니다. </li><li> 프로토콜을 사용 비교를 제외하고 (제 3, 4) THP1 셀 시딩하고 Leishmania promastigote 감염 위에서 설명한 따라 기생충 비율 THP1 셀을 표준화1:1.25, 1:2.5, 1시 5분 및 1시 10분과 같은 기생충에 THP1 세포의 erent 비율. </li><li> 16 챔버 슬라이드 (이미지 분석을위한)와 96 - 웰 플레이트 (기생충 - 구조 분석 용) 기생충 구조 및 이미지 분석 assays를 비교하는 형식으로 모두 실험을 설정합니다. </li></ol> 10. 제어 세포 용해에 대해 서로 다른 세제의 표준화 <ol><li> 이 실험의 주요 목적은 크게 구출 amastigote의 기생충의 생존에 영향을주지 않고 전체 / 최대 THP1 셀 용해를 달성 할 수있는 THP1 세포의 제어 용해에 대한 프로토콜을 최적화하는 것입니다. </li><li> 다른 농도 및 치료의 다른 기간 (그림 2)에서 이러한 십대 초반 20 대 초반 80, 트리톤 X-100, NP-40와 SDS 등 다양한 세제를 테스트합니다. </li><li> 기생충 비율 THP1 전지는 1시 10분하고 다른 조건은 위의 섹션 1-8으로 비슷합니다. </li><li> 다른 치료 시간의 0.05 % SDS 치료 더 테스트S는 추가로 제어 세포 용해를 최적화합니다. </li></ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Control+of+the+leishmaniasis%3A+report+of+a+meeting+of+the+WHO+Expert+Committee+on+the+Control+of+Leishmaniasis%22">Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis</a>. Xii, Geneva. 22-26 (2010).</li>
<li>Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+scenario+of+drug+development+for+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Current scenario of drug development for leishmaniasis.</a> Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).</li>
<li>Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Resistance+in+Leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Drug Resistance in Leishmaniasis.</a> Clinical Microbiology reviews. 19 (1), 111-126 (2006).</li>
<li>Mikus, J., Steverding, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+colorimetric+method+to+screen+drug+cytotoxicity+against+Leishmania+using+the+dye+AlamarBlue%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+International%22%5BJournal%5D)">A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue.</a> Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).</li>
<li>Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Axenic+Amastigote+System+for+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">An Axenic Amastigote System for Drug Screening.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).</li>
<li>Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activity+of+anti-leishmanial+drugs+against+Leishmania+donovani+is+host+cell+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent.</a> J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).</li>
<li>Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antileishmanial+activity+and+immune+modulatory+effects+of+tannins+and+related+compounds+on+Leishmania+parasitized+RAW+264.7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells.</a> Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).</li>
<li>Maia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+five+different+types+of+macrophages+by+Leishmania+infantum%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum.</a> Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).</li>
<li>Neal, R. A., Croft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+system+for+determining+the+activity+of+compounds+against+the+intracellular+amastigote+form+of+Leishmania+donovani%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani.</a> J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).</li>
<li>Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+staining+procedures+for+the+flow+cytometric+analysis+of+U-937+cells+infected+with+different+Leishmania-species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species.</a> J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).</li>
<li>Giorgio, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Detection+of+Leishmania+Parasites+in+Human+Monocyte-Derived+Macrophages%3A+Application+to+Antileishmanial-Drug+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).</li>
<li>Mandal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+of+Leishmania+donovani+clinical+isolates+against+drug+using+a+colorimetric+%CE%B2+Lactamase+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric β Lactamase assay.</a> Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).</li>
<li>Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+assay+for+Leishmania+amazonensis+promastigotes+expressing+multimeric+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein.</a> Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).</li>
<li>Buckner, F. S., Wilson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+assay+for+screening+compounds+against+Leishmania+Amastigote+Grown+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med%22%5BJournal%5D)">Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages.</a> Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).</li>
<li>Sereno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+perspectives+in+Leishmania+cell+based+drug-screening+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Int%22%5BJournal%5D)">Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures.</a> Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).</li>
<li>Gupta, S., Nishi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visceral+leishmaniasis%3A+experimental+models+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery.</a> Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).</li>
<li>Roy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episomal+and+stable+expression+of+the+luciferase+reporter+gene+for+quantifying+Leishmania+spp.+Infections+in+macrophages+and+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).</li>
</ol>

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대 식세포 - amastigote 모델을 기반으로 안티 leishmanial 약물 검사에 사용할 수 방법은 여러 가지가 있습니다. Assays는 호스트 동물로부터 즉 복막 exudate 전지 (PEC), 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 수집 식세포를 수행 할 수 있습니다 6 골수 유래 대 식세포 (BMM) 또는 마우스와 같은 monocytic 세포 라인에 (J774 및 RAW264.7 ) 7과 인간 (THP1, U937, HL-60) 8 monocytic 세포. 호스트 세포를 나누어 사용하는 assays는 기생충 및 호스트 셀 번호 모두에 마약 활동의 혼란 효과가 고려되어 있는지 확인해야합니다. 이러한 마우스 및 쥐 등 다양한 소스에서 수집 한 차별화 된 주요 대 식세포는 자연에 비 분리하지만, 이러한 세포 준비가 균일 한 세포 집단이 없을​​ 수 있습니다. Monocytic 세포 - 파생 셀 라인은 자연에서 균일하며 대 식세포-amastigote 기반 진단을위한 더 나은 모델입니다. 다른 monocytic 세포 라인 아웃, differentiated THP1 전지는 (인간의 급성 monocytic 백혈병 세포 라인) 비 분리 monolayer를 형성와 기본 절연 식세포에 대한 매력적인 대안을 제공 할 수 있습니다. 대 식세포-amastigote 기반 검사는 여러 가지 방법으로 수행 할 수 있습니다. 9 세기 직접 셀 및 기생충에 따라 클래식 미세 평가는 노동 집약적이다. 자동화의 부재는이 분석의 유틸리티를 제한합니다. 셀의 계산하는 것은 많은 시간이 소요되며, 착색 절차를 통해 기생충의 생존 결정 이후 IC 50 값의 부정확 한 결정을 줄 수 있습니다하는 것은 어렵습니다. 많은 형광 염료와 단클론 항체는 흐름 cytometric assays 10, 11 고용 될 수 있지만, 이러한 assays은 인해 하루 만에 약물 치료의 시간 간격의 적은 감도와 제한으로 제한됩니다. 세포 amastigotes 12,13,14의 성장을 정량화를위한 ​​몇 가지 리포터 유전자의 assays가 있습니다. 자동 판매기에드 검사는 기자 유전자를 사용하여 수도 있지만 이러한 assays는 특정 단점을 가지고있다. 첫째, 이러한 assays의 대부분은 약물 검사 실험에 적합하지 않을 수 있습니다 기자 유전자의 episomal 표현을 유지하기위한 약물 선택이 필요합니다. 리포터 유전자가 도입되는이 방법은 또한 기생충의 생리 특성에 영향을하고 심사에 영향을 미칠 수 있습니다. 리포터 유전자가 episomal 플라스미드의 일부 경우, 기자의 상대적인 출력은 오히려 약물 (14)의 활동에보다 transfected 플라스미드의 사본 번호 (휴대폰에서 휴대폰에 따라 다릅니다)을에 따라 달라질 수 있습니다. 그러나, 어느 게놈 구조를 방해하여 또는 외국 기자 단백질 15의 존재에 의해 생물 결과가있을 수 있습니다, 기생충은 리포터 유전자를 유지하는 선택적 압력을 필요하지 않습니다 변환 일부 기자 기생충. 일부 기자 유전자 기반 assays에 있습니다감성과 배경 활동을 16 문제를 해결합니다. 가장 중요한 것은, 기자의 유전자 표현 assays, GFP 기자 gene15과 특별히 한 많은 라이브와 죽은 세포 amastigotes를 구별하지 않을 수 있습니다. 루시 페라 제 리포터 유전자를 기반으로 Assays는 생활과 죽은 세포 amastigotes 사이에 분별 수 있지만, 이러한 assays를위한 기판 및 셀 용해 버퍼는 대규모 검사 17 비쌉니다. 이러한 단점 및 대 식세포-amastigote 기반의 이전 심사 assays의 한계를 극복하기 위해, 우리는이 기생충 - 구조 및 전환 분석을 개발하고 최적화되었습니다. 이 분석은 좋은 동질성을 가지고 호스트 세포로, 자연에 비 분산하고 THP1 세포에 기반을두고 있습니다. 여기에 설명 된 기생충 - 구조 - 변환 - 검정 분석은 세포 내 amastigotes의 디지털 이미지 분석 - 직접 세기에 따라 분석과 비교합니다. 형광 및 DIC 현미경, 디지털 imag대 식세포의 핵 및 기생충의 핵의 계산 차이에 대한 ImageJ가 전자 분석은 더욱 미세 계수 분석을 수정했습니다. 형광등 필터 및 차동 간섭 대비 (DIC) 필터에서 이미지를 캡처하면 세포 내 기생충보다 정확한 계산을 위해 디지털 이미지의 품질을 개선하였습니다. 형광 및 DIC 두 이미지는 명확 대 식세포 전지 개요 및 형광 세포 핵으로 디지털 이미지를 얻기 위해 병합 할 수 있습니다. 대 식세포의 핵 및 기생충의 핵은 differentially ImageJ으로 인식 할 수 있습니다. 따라서, 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 기생충 - 구조 - 변환 - 검정 모두 자동화 및 대규모 심사 신청의 가능성이 있습니다. 기생충 - 구조 - 변환 - 분석의 중요한 방법은 다음과 같습니다 (A) Leishmania의 promastigotes에 노출 후 THP1 세포 문화의 반복 washings은 비 인턴의 거의 완전한 제거를 위해alized promastigotes와 SDS와 감염된 THP1 세포 (B) 제어 용해. 단계 모두는 자동화 제어 할 수 있으며, 분석의 처리량과 타협해서는 안됩니다. 어떤 경우 시험 약물 / 화합물에 Leishmania 감염 THP1 세포의 노출 후 washings의 두 번째 단계는, 나머지 비 internalized 기생충을 제거합니다. 기생충 - 구조 - 변환 - 검정은 기존 현미경, 리포터 유전자 및 이미지 분석 assays에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 검정은 간단 강력한, 그리고 재현이 대규모 검사를 위해 자동화 할 수 있으며, 따라서 새로운 안티 - leishmanial 약물 발견을위한 대형 화합물 라이브러리의 심사에서 중요한 응용 프로그램이 있어야합니다. 또한, 분석은 체외에서 Leishmania의 실험실 분리는뿐만 아니라, 임상의 감염을 평가 적용 할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Phorbol 12 Myristate의 13-아세테이트 (PMA) </td><td> 시그마 - 알드리치 USA </td><td> P1585 </td><td> THP1 세포의 분화에 필요합니다. </td></tr><tr><td> RPMI-1640 중 </td><td> Invitrogen </td><td> 23400021 </td><td></td></tr><tr><td> 랩 - 테크 상공 회의소 슬라이드 시스템 (16 상공 회의소) </td><td> 열 과학 Nunc </td><td> 178599 </td><td></td></tr><tr><td> 지우기, 평면 아래, 96 - 음 플레이트 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 353075 </td><td> 접시는 96 - 웰 플레이트 분석을 수행하는 </td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> 시그마 - 알드리치 USA </td><td> A4888 </td><td> 표준 안티 leishmanial 약물 (2 MG / ML) DMSO에 용해 </td></tr><tr><td> Pentamidine Isothionate 사그건 </td><td> 시그마 - 알드리치 USA </td><td> P 0547 </td><td> 표준 안티 leishmanial 약물 (2 MG / ML) DMSO에 용해 </td></tr><tr><td> Miltefosine </td><td> EMD Biosciences USA </td><td> 475841 </td><td> 표준 안티 leishmanial 약물은 혈청이없는 RPMI-1640 배지 (신선한 준비) (2 밀리그램 / ML)에 용해 </td></tr><tr><td> 나트륨 Stibogluconate </td><td> EMD Biosciences USA </td><td> 567565 </td><td> 표준 안티 leishmanial 약 4 % FBS와 RPMI-1640에 준비합니다. (1 MG / ML) </td></tr><tr><td> 나트륨 Dodecyl의 황산 </td><td> 시그마 - 알드리치 USA </td><td> L 5750 </td><td></td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> ECLIPSE 90i </td><td></td></tr><tr><td> 형광 Microplate 리더 </td><td> BMG </td><td> 북극성 갤럭시 </td><td></td></tr><tr><td> 매체를 마운트 </td><td> 시그마 - 알드리치 USA </td><td> M 1289 </td><td></td></tr><tr><td>lamarBlue </td><td> 아브드 Serotec </td><td> BUF012 B </td><td></td></tr><tr><td> SYBR 그린 I </td><td> 시그마 - 알드리치 USA </td><td> S 9430 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 중탄산염 </td><td> 피셔 문화. </td><td> 523500 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 Pyruvate </td><td> 시그마 - 알드리치 USA </td><td> P2256 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - 메르 캅토 에탄올 </td><td> 시그마 - 알드리치 USA </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11050H </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반 20 </td><td> 시그마 - 알드리치 USA </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반 80 </td><td> 시그마 - 알드리치 USA </td><td> P6474 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 시그마 - 알드리치 USA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> NP-40 </td><td> Calbiochem </tD&gt; <td> 492016 </td><td></td></tr></tbody></table>

세포에 붙어 antileishmanial 검사에 대한 기생충 구조 및 변화 분석<em&gt; leishmania donovani</emthp1 인간 급성 백혈병 monocytic 셀 라인에서&gt; amastigotes

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis은 주로 주로 개발 도상국에서 가난한 사람들의 가난에 영향을 미치는, 세계에서 가장 무시 질병 중 하나입니다. 만 350 명 이상이 leishmaniasis을 계약의 위험에 고려하고, 약 2 명의 새로운 환자가 매년 1 발생하고 있습니다. Leishmania donovani는 내장의 leishmaniasis (VL), 질병의 가장 치명적인 형태의 원인이 에이전트입니다. leishmaniasis을 치료하는 데 사용할 수 약물의 선택은 2 제한되어, 현재의 치료는 제한된 효능을 제공하고 많은 사람들이 치료 복용시 독성이 있습니다. 또한, 첫 번째 치료 약물의 대부분은 이미 여러 약물 저항 할 3 증가로 인해 유틸리티를 잃어 버렸습니다. 반 leishmanial 약품의 현재 파이프 라인은 심각하게 소진되었습니다. 지속적인 노력은 새로운 안티 - leishmanial 약물 발견 파이프 라인을 풍부하게하는 데 필요한,이 노력은 체외 검사 모델 적합의 가용성에 의존하고 있습니다. 체외 promastigotes 4 axenic amastigotes의 assays 5에서 주로하지만, 인해 세포 amastigotes에 비해 크게 세포, 생리학 생화학 및 분자 차이 적합하지 않을 수 있습니다 방지 leishmanial 약물 검사에 사용됩니다. 대 식세포 - amastigotes 모델 Assays은 leishmaniasis의 pathophysiological 조건에 가장 가까운 것으로 간주하고, 따라서 체외 검사에 가장 적합한 있습니다. 차별화 된, 비 나누어 인간의 급성 monocytic 백혈병 세포 (THP1)가 분리 된 주요 대 식세포에 대한 대안 (매력을)과 세포 amastigotes에 대해 서로 다른 화합물을 방지 leishmanial 활동을 시금 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 순수한 화합물을 검사 및 찌르다 자연에 대한 Leishmania donovani과 체외에 감염 차별화 된 THP1 세포와 기생충 - 구조 및 전환 분석을 제시ucts 추출물과 세포 Leishmania의 amastigotes에 대한 효능을 결정. 비 나누어 식세포에 THP1 세포의 (1) 차별화, L.와 대 식세포 (2) 감염 : 분석은 다음 단계를 포함 donovani metacyclic promastigotes, 테스트 약물, 감염된 대 식세포 (4) 제어 용해, (5) 자료 / amastigotes의 구조와 promastigotes에 실시간으로 amastigotes (6) 변화에 감염된 세포 (3) 치료. 검정은 promastigotes로 변환하는 능력에 최소한의 영향을 가능한 세포 amastigotes의 거의 완벽한 구조를 달성 할 수 Leishmania에 감염된 THP1 세포의 제어 용해에 대한 세제 치료를 사용하여 최적화되었습니다. 다른 대 식세포 : promastigotes 비율이 최대 감염을 달성하기 위해 테스트되었습니다. 감염의 정량화는 라이브의 변화를 통해 수행되었다 탈출 Leishmania는 알람에 의해 자신의 성장의 promastigotes 및 평가에 amastigotes96 - 웰 microplates에 arBlue fluorometric 분석. 이 분석은 현재 사용되는 현미경, 유전자 변형 리포터 유전자 및 디지털 이미지 분석 assays 비교됩니다. 이 분석은 견고하며 라이브와 죽은 amastigotes 구별되지 않을 수 있습니다 리포터 유전자 및 이미지 분석 assays에 비해 라이브 세포 amastigotes를 측정합니다. 또한, 분석은 반 leishmanial 약의 현재 패널로 확인되어 성공적으로 대규모 순수 화합물의 심사 및 천연 제품 분수 (Tekwani 외.되지 않은)의 라이브러리에 적용되었습니다.

정량 분석​​은 24, 48, 72 및 96 시간 후 약물 치료를 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 기생충 - 구조 - 변환 - 검정 모두 이루어졌다 L.의 직접 계산 방법, 감염의 donovani에 감염된 대 식세포 (THP1 세포)은 다음 식에 의해 계산 : <img alt="수식 1" fo:content-width="3.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054eq1.jpg" /> amastigotes (amastigotes의 핵을 계산에 의해 결정) / 100 THP1 세포 (THP1 세포 핵에서 계산 계산에 의해 결정) (그림 7)이 감염된 THP1 세포의 비율보다 다른 표준 또는 시험 화합물의 효과를 분석 할 수있는보다 정확한 측정하기위한 한 방법입니다 변환 이 번호는 직접 화합물의 전체적인 효과에 관한되기 때문에 같은, 일부 이전 신문에 보도 중 감소를 통해대 식세포의 cells.Infection에서 대 식세포 셀이나 기생충 총 제거에서 기생충의 다양한 시간 간격 (그림 10, 표 1)에 대해 서로 다른 dilutions에 다른 표준 약물로 치료가 감염된 THP1 세포의 디지털 이미지에서 계산되었다. 기생충 - 구조 - 변환 - 검정을위한 상대 형광 단위 (RFU)였다 읽기 아웃하면서 읽기 아웃은 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 검정을위한 amastigotes infection/100는 THP1 세포를 변형 한 직접 감염된 대 식세포에서 구출 라이브 Leishmania의 amastigotes의 수에 비례하여 promastigotes로 변환 할 수 있습니다. alamarBlue 분석은 정기적으로 Leishmania promastigotes 방지 leishmanial 약물 검사에 사용됩니다. 검정은 처음 표준화 및 Leishmania에 감염된 THP1 세포의 제어 용해에 최적화했다. 목표는 세제 화려 조건을 최적화하는 것이 었습니다구조 amastigotes의 생존에 최소한의 효과 THP1 세포의 거의 완전한 용해를 얻을 수 atment는. 그림 1은 전체 분석 프로토콜의 미세한보기를 도시한다. Leishmania의 amastigotes에 감염 그대로 THP1 셀이 그림 1A에서 볼 수 있습니다. 그림 1B는 세제 치료 후 THP1 세포의 용해를 보여줍니다. 그림 1C가 부분적으로 promastigotes와 그림 1D로 변신 한 Leishmania amastigotes를 구출 표시하기에 amastigotes의 거의 완전한 변화를 보여줍니다 promastigotes 및 후속 확산. 이러한 변화 promastigotes의 성장은 양적 alamarBlue의 추가 및 microplate 리더에 형광 측정을 모니터링 할 수 있습니다. NP-40 (그림 2A) 및 트라이 튼 X-100 (그림 2B)와 치료는 감염된 THP1 세포를 lysed하지만, 또한 생존에 영향을하고구조 amastigotes의 변화. 십대 초반 20 (그림 2C)과 십대 초반 80 (그림 2D)의 치료는 변형 promastigotes의 낮은 숫자로 표시로 amastigotes의 불완전한 구조로 인해 THP1 세포의 최적의 용해가되지 않았다. 30 초에 0.05 % SDS (그림 2E)의 치료는 Leishmania에 감염된 THP1 세포의 거의 완전한 용해가 생긴과 탈출의 amastigotes의 생존과 변화에 영향을 미치지 않았다. 또한 최적화 초이 가능한 Leishmania의 amastigotes (그림 2 층)의 높은 구조가 생긴 20-30에 0.05 % SDS와 함께 세포의 치료를 보여 주었다. 후속 실험에서, 30에 대한 0.05 % SDS 치료는 초를 사용했습니다. SDS 처리를위한 절차는 하나 또는 여러 개의 플레이트에 대해 동일합니다. 여러 접시에서 SDS 치료는 멀티 채널 피펫과 열에서 열을 구현되었습니다. 혈청 무료 매체는 모두 8 판 중 하나를 열 우물과 20 &amp; 무에서 삭제되었습니다, 0.05 % SDS의 리터는 동일한 열 여덟 우물에 추가와 10 % FBS와 RPMI-1640을 30 초 후 희석되었다. 분석 초기 표준화 동안 접시가 아닌 internalized promastigotes에 대한 현미경으로 확인되었다. 오 washings의 최소 표준 화합물과 세 washings SDS 치료의 7 단계 전에 필요한있었습니다 감염된 대 식세포 세포 치료의 5 단계 전에 기생충의 제거에 필요한습니다. 따라서, 셀은 8 번 세탁하고 눈에 띄는 비 internalized promastigotes는 감염된 THP1 세포의 제어 용해되기 전에 남아 없습니다. 디지털 이미지 분석 및 직접 계산 Leishmania에 감염된 THP1 세포의 디지털 이미지는 (그림 3 SYBR 그린 I.와 착색 특성 kinetoplast의 DNA와 대 식세포의 핵 및 세포 Leishmania의 핵 모두가 형광 필터에서 관찰 된 이후 니콘 이클립스 90i 형광 현미경에 잡혀). 또한, 감염된 THP1 세포의 이미지도 DIC에서 촬영되었다. 이미지 모두가 병합되었을 때, 세포 amastigotes과 THP1 전지의 개요는 (그림 4) 더 명확하게 볼 수 있었다. ImageJ 소프트웨어는 이러한 이미지를 분석하는 데 사용되었다. ImageJ는 건강 (국립 연구소에서 개발 된 공개 도메인, 자바 기반의 이미지 프로세싱 프로그램입니다 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</a> ). ImageJ는 Java 플러그인과 기록 매크로를 통해 확장 성을 제공하는 개방형 아키텍처로 설계되었습니다. 사용자 지정 획득, 분석 및 처리 플러그인은 ImageJ에 내장 된 편집기와 자바 컴파일러를 사용하여 개발 할 수 있습니다. ImageJ에 의한 THP1 셀 핵 및 기생충의 핵의 카운트 차등를 들어, 이미지가 ImageJ에 문을 열었습니다. 셀 카운터는 소프트웨어의 플러그인에서 분석 옵션에 발견되었다. 이미지가 초기화되었고 셀 카운터 유형 1 THP1 C에 선정되었습니다예쁜의 핵 및 세포 카운터 타입 2 기생충의 핵 (그림 3)에 선정되었습니다. 미분 계수는 최소한 200 THP1 세포 핵 이러한 THP1 세포 핵에 존재하는 세포 amastigotes에 이루어졌다. 기생충 - 구조 분석 및 이미지 분석 방법의 비교는 서로 다른 대 식세포와 THP1 세포의 감염을 평가되었다 :. promastigote 비율 : promastigotes 비율 (그림 4) 그림 5는 다른 대 식세포에서 THP1 세포의 차등 감염을 나타냅니다. 방법 모두 비교 결과와 대 식세포를 보여 주었다 : 1시 10분의 promastigote 비율이 최적와 재현 감염이 나왔고. parasite-rescue/transformation 분석 및 디지털 이미지 분석을위한 조건이 최적화 된 후, 이러한 assays의 유틸리티는 반 leishmanial 약물 검사에 대한 평가되었다. Leishmania에 감염된 THP1 전지가 표준의 서로 다른 농도로 치료했다즉 nti-leishmanial 약물 Amphotericin B, 24 일부터 96 시간에 이르기까지 서로 다른 시간 간격에 대한 Pentamidine 및 Miltefosine. 기생충에 대한 실험은 / 변환 분석은 세중의에서 수행 된 구조 및 방법을 계산 직접 세포에 대한 실험은 복제로 이루어졌다. 그림 6은 치료와 Leishmania에 감염된 감염 감염되지 않은, 제어, THP1 세포를 처리 컨트롤의 현미경 이미지를 보여줍니다. 선량 반응 곡선은 기생충 - 구조 및 변화 분석 (변형 기생충 대 약물의 농도)과 이미지 분석 분석 (amastigotes/100 THP1 세포의 수) (그림 7-9)에서 준비되었다. 마약의 IC 50 ExcelFit에 의해 계산되었으며 표 1에 표시됩니다. 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 기생충 - 구조 - 변환 - 분석은 유사한 결과를 보여 주었다. 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 검정은 초기 24 시간 지점 및 48 시간 약물 t 동안 적은 최적이었다reatments, 기생충 - 구조 - 변환 - 검정은 약물 치료 후 24-96 시간 동안의 모든 시간 지점에서보고 된 값보다 일관된 결과를 보여 주었다 동안. 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 기생충 - 구조 - 변환 - 검정과 결과의 이러한 차이는 디지털 이미지 분석 - 직접 세기의 약물 치료의 조기 기간 동안 비 가능한 amastigotes의 존재 때문일 수 있습니다 - 검정. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig1.jpg" /> 그림 1. Leishmania donovani의 현미경보기 promastigotes에 구조와 변화를 amastigotes. A - Leishmania amastigotes에 감염 자기편 THP1 세포, B - 제어 용해 C 한 후 점착성의, 감염된 THP1 셀 - 감염된 THP1 대 식세포 세포 D에서 구출 amastigotes에서 Leishmania donovani의 promastigotes을 변화 - 트란의 성장과 확산sformed Leishmania donovani이 promastigotes. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig2.jpg" /> 다른 세제와 Leishmania에 감염된 THP1 세포에서 amastigotes의 THP1 세포 구조의 용해의 그림 2. promastigotes에 라이브 Leishmania donovani의 amastigotes과 변화의 최대 구조를 달성하기 감염된 THP1 세포의 제어 용해의 최적화. 분석. 세제의 두 가지 농도 (0.05 % 및 0.1 %) 및 ​​치료를위한 두 가지 기간은 (30 초와 60 초) 테스트되었습니다. RFU는 = 상대 형광 단위입니다. 각 줄이 중복 관찰의 평균을 나타냅니다. [A] NP-40 치료 THP1 세포의 용해를 야기하고 또한 구출 amastigote의 기생충의 생존에 영향을. [B] 트리톤 X-100 treatmeNT는 THP1 세포의 용해를 야기하고 또한 구출 amastigote의 기생충의 생존에 영향을 [C] 십대 초반 80 amastigotes를 구출하기 위해 THP1 세포의 부분적인 용해를 일으켰습니다. [D] 십대 초반 80 amastigotes를 구출하기 위해 THP1 세포의 부분적인 용해를 일으켰습니다. [E ] SDS 치료는 THP1 세포의 거의 완전한 용해의 원인 및 0.05 % / 30에서 구출 amastigotes의 생존에 영향을 미치지 않은 초. [F 20-30에 0.05 % SDS에] 치료 sec는 THP1 세포의 거의 완전한 용해의 원인과 가능한 기생충을 구출 promastigotes로 변환 할 수 amastigotes이 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig3.jpg" /> 그림 3. Leishmani와 함께 체외에 감염 차별화 된 THP1 세포의 형광 디지털 이미지donovani이 amastigotes. 특성 kDNA 또한 각 기생충 핵으로 볼 수 있습니다. 대 식세포 핵 (MN) (1) 및 기생충의 핵 (PN) (2) 감염의 정량 평가를위한 ImageJ 분석 소프트웨어로 differentially 표시하고 differentially 계산 할 수 있습니다. 정량화가 amastigotes/100 THP1 세포의 숫자로 이루어졌다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig4.jpg" /> 그림 4. 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 검정 (하단 패널)과 기생충 - 구조 - 변환 - 검정 (위 패널) 사이 비교. 대 식세포 : 1시 10분의 promastigote 비율이 최적의 감염을 굴복. 모두 유사한 결과를 보여 주었다. 기생충 - 구조 분석은 몇 가지 배경 값을 보여 주었다. 각 막대 쇼 중복 값 의미합니다. <img alt="그림 5" srC = &quot;/ files/ftp_upload/4054/4054fig5.jpg&quot;/&gt; 그림 5 개의 THP1에 의해 Leishmania의 promastigotes에 감염 THP1 셀 :. promastigote 비율입니다. amastigotes/100 THP1 세포의 수와 같은 양적 결과는 그림 4에 표시됩니다. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig6.jpg" /> 그림 6. Leishmania donovani에 감염된 THP1 세포의 디지털 이미지는 (형광등 + DIC) 다른 기간에 대한 표준 안티 leishmanial 약물 치료 후 amastigotes. 결과는 amastigotes/100 THP1 세포의 숫자로 정량화 및 치료 컨트롤에 비해 %의 성장을 계산하고 IC 50 값을 결정하는 데 사용되었다. <img alt="그림 7" fo: 콘텐츠 폭 = &quot;4.75in&quot;강한 : SRC = SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4054/4054fig7.jpg&quot;/ &quot;를 /는 files/ftp_upload/4054/4054fig7highres.jpg&quot;&gt; 그림 7.의 비교 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 안티 leishmanial 약물 검사 (Amophotericin B)에 대한 기생충 - 구조 - 변환 - 검정. 감염된 대 식세포는 여러 기간에 대한 표준 항 leishmanial 약물의 다양한 농도로 치료했다. IC 50 (μg / ML) 값은 Excelfit하여 선량 반응 곡선에서 계산되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig7large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 8" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig8.jpg" /> 그림 8.에 대한 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 기생충 - 구조 - 변환 - 분석의 비교nti-leishmanial 약물 검사 (Pentamidine). 감염된 대 식세포는 여러 기간에 대한 표준 항 leishmanial 약물의 다양한 농도로 치료했다. IC 50 (μg / ML) 값은 Excelfit하여 선량 반응 곡선에서 계산되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig8large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 9" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig9.jpg" /> 그림 9.의 비교 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 안티 leishmanial 약물 검사 (Mitefosine)에 대한 기생충 - 구조 - 변환 - 검정. 감염된 대 식세포는 다른 기간에 대한 표준 항 leishmanial 약물의 다양한 농도로 치료했다. IC 50 (μg / ML) 값은 Excelfit하여 선량 반응 곡선에서 계산되었다.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig9large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> 시험 약물 </td><td colspan="2"> 24 시간 </td><td colspan="2"> 48 시간 </td><td colspan="2"> 72 시간 </td><td colspan="2"> 96 시간 </td></tr><tr><td> IACA B </td><td> PRTA C </td><td> IACA B </td><td> PRTA C </td><td> IACA B </td><td> PRTA C </td><td> IACA B </td><td> PRTA C </td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> 0.24 ± 0.03 </td><td> 0.17 ± 0.01 * </td><td> 0.12 ± 0.04 </td><td> 0.20 ± 0.07 </td><td> 0.06 ± 0.01 </td><td> 0.06 ± 0.01 </td><td> 0.11 ± 0.03 </td><td> 0.10 ± 0.03 </td></tr><tr><td> Pentamidine </td><td> &gt; 10 </td><td> 2.55 ± 1.16 * </td><td> 2.88 및 PLusmn, 0.58 </td><td> 1.43 ± 0.91 </td><td> 1.24 ± 0.35 </td><td> 1.52 ± 0.16 </td><td> 0.71 ± 0.63 </td><td> 0.98 ± 0.33 </td></tr><tr><td> Miltefosine </td><td> 0.38 ± 0.02 </td><td> 0.19 ± 0.08 * </td><td> 0.24 ± 0.06 </td><td> 0.30 ± 0.08 </td><td> 0.36 ± 0.02 </td><td> 0.16 ± 0.06 </td><td> 0.21 ± 0.15 </td><td> 0.17 ± 0.10 </td></tr></tbody></table> 표 1. 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 안티 leishmanial 약물 검사에 대한 기생충 - 구조 - 변환 - 분석의 비교. 감염된 대 식세포는 여러 기간에 대한 표준 항 leishmanial 약물의 다양한 농도로 치료했다. IC 50 (μg / ML) 값은 Excelfit (그림 7-9)에 의해 선량 반응 곡선에서 계산 된 시간 후 약물 치료,. B IACA = 이미지 분석 및 직접 계산은검정, C PRTA = 기생충 - 구조 및 변환 분석. 주어진 값은 μg / ML로 IC 50 (기생충의 성장에 50 % 억제를 일으키는 약물의 농도)이며 적어도 세 실험의 평균 ± SD 있습니다. * (&lt;0.05) 통계적으로 다르게 IACA으로 IC 50 값으로 비교했다.

감염 THP1 셀과 기생충 - 구조 및 변화 분석<em&gt; 체외에서</em&gt;와<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; 반 leishmanial 약물 검사에 최적화되었습니다. 검정은 THP1 세포, promastigotes과 감염, 테스트 마약, 감염된 대 식세포의 제어 용해, amastigotes의 구조, promastigotes 및 모니터링 promastigote의 성장 변화와 fluorometric 분석과 확산과 치료의 차별화를 포함합니다.

세포에 붙어 Antileishmanial 검사에 대한 기생충 구조 및 변화 분석<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 인간 급성 백혈병 Monocytic 셀 라인에서&gt; Amastigotes

리슈만편모충증(Leishmaniasis)은 세계에서 가장 소외된 질병 중 하나로, 주로 개발도상국의 극빈층에게 큰 영향을 미칩니다. 3억 5천만 명 이상의...

여기에서 시연되는 실험 기술의 전반적인 목표는 내장 리슈만증(visceral leishmaniasis)의 원인균인 Leishmania donovani의 세포 내 아마스티고트(amastigote) 단계의 성장 및 증식에 대항하여 화합물을 스크리닝함으로써, 리슈만증 치료를 위한 신약을 발견하는 것입니다. 우선, THP-1 인간 급성 단핵구 백혈병 세포를 인비트로(in vitro)에서 부착성 대식세포로 분화시킵니다. 분화된 THP-1 세포를 Leishmania donovani 기생충의 프로마스티고트(promastigote)로 감염시키면, 프로마스티고트가 THP-1 대식세포 내부로 침입하여 아마스티고트로 변형되고 세포 내에서 증식하게 됩니다. 다음으로, 리슈만이아에 감염된 THP-1 대식세포를 테스트 화합물 및 표준 약물에 노출시킨 후, 제어된 용해(lysis), 아마스티고트 회수, 잔류 아마스티고트의 프로마스티고트로의 재변형 과정을 거쳐, 비색 세포 성장 분석법(colorimetric cell growth assays)을 통해 프로마스티고트의 양을 정량화합니다.세포 내 am master goats의 정량화를 기반으로, 시험 화합물과 표준 약물이 세포 내 성장 및 증식에 미치는 항마니아 효과를 보여주는 결과입니다. Lemanis는 특히 전 세계 열대 지역에서 주요한 글로벌 보건 위협이 되고 있습니다. 이 질병을 치료하기 위해 더 나은 치료 프로파일을 갖춘 신약이 시급히 필요한 실정입니다.국립 천연물 연구 센터(National Center for Natural Products Research)에서는 열대성 기생충 질환의 새로운 치료제 발견을 위한 다방면의 프로그램을 시작했습니다. 살아있는 MST goods와 죽은 MST goods를 구분하지 못할 수 있는 Rogen 및 현미경 이미지 분석 분석법과 달리, 본 SA는 살아있는 세포 내 MST goods만을 측정합니다. 당사는 순수 화합물 및 천연물 추출물의 스크리닝과 세포 내 limania에 대한 효능 결정을 위해, in vitro에서 liman에 감염된 분화된 TP one 세포를 이용한 기생충 구제 및 형질전환 분석법을 최적화했습니다.본 실험의 세부 사항은 제 연구실의 연구 개발 생물학자로서 이 실험을 수행하는 Ra 씨와 마찬가지로 연구 개발 생물학자로 근무하고 있는 RA Sahu 씨가 시연할 것입니다. 이 분석법에는 네 가지 기본 단계가 있습니다. 첫 번째 단계는 THP-1 세포의 파종 및 최종 분화입니다.두 번째 단계는 분화된 TP one 세포를 L. donovani promastigotes로 in vitro 감염시키는 것입니다. 세 번째 단계는 Lish mania 감염 대식세포를 테스트 화합물 또는 표준 약물로 처리하는 것입니다. 그리고 네 번째 단계는 현미경 이미지 분석 또는 기생충 회수 및 형질전환 분석을 통해 lush mania parasite promastigotes의 성장 및 증식을 정량화하는 것입니다.배양 4일 차의 THP-1 대식세포를 수확하고, 10% 열 활성화 FBS가 첨가된 RPMI에서 2.5 × 10⁵ cells/mL 농도의 세포 현탁액을 준비합니다. 분화를 유도하기 위해 세포에 25 ng/mL의 PMA를 첨가합니다. 그 다음, 세포 현탁액 200 µL를 96-well 플레이트의 각 웰과 16-chamber 글라스 슬라이드의 각 챔버에 옮겨줍니다. 세포 분주가 완료되면, 슬라이드와 96-well 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양하여 세포 분화가 거의 완전히 이루어지도록 합니다.감염을 위해, 대부분의 유기체가 감염성 메타사이클릭 단계에 있는 5~6일 된 ProMaster goat 기생충 배양물을 사용하십시오. 짧은 젤 모양의 꼬리를 가진 짧은 타원형 세포이며 약하게 운동하고 종종 로제트 형태로 발견되는 프로사이클릭 단계의 ProMaster goats와 달리, 감염성 메타사이클릭 유기체는 긴 원통형 모양과 높은 운동성으로 구별할 수 있습니다.기생충을 수확하고 2% F-B-S-R-P-M-I 내에 2.5 × 10⁶ parasites/mL 농도의 ProMaster goat suspension을 준비합니다. 인큐베이터에서 분화된 THP-1 세포 배양액이 담긴 96-well 플레이트와 유리 슬라이드를 꺼냅니다. 동시에 배양액에서 상층액을 제거한 다음, 사전 가온된 무혈청 배지를 첨가하여 세포를 세척합니다. 무혈청 배지를 제거하고 well당 200 µL의 ProMaster goat suspension으로 교체하여, THP-1 세포 1개당 기생충 10개의 비율이 되도록 합니다.대조군 웰에는 기생충 현탁액 대신 2% F-P-S-R-P-M-I 배지 200 µL를 첨가합니다. 기생충을 첨가한 후, 테스트할 약물의 스톡 용액으로부터 감염이 일어나도록 공동 배양물을 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 각 희석액의 농도가 의도한 최종 테스트 농도의 2배가 되도록 2% F-B-S-R-P-M-I에서 1/2부터 1/32까지 6단계 연속 희석액을 준비합니다.공동 배양에 약물을 첨가하기 전, 대조군 표준 항말라리아 약물로 amphotericin b, pentamidine, melter, Fosse 및 sodium stib gluconate를 농도별로 사용할 수 있습니다. 앞서 설명한 대로 플레이트와 슬라이드의 TP one 세포를 반복해서 세척하십시오. 내부로 흡수되지 않은 ProMaster goats를 제거하기 위해 세포를 최소 5회 세척하십시오.그런 다음 각 웰 또는 챔버에 2%F-B-S-R-P-M-I 100 µL와 각 약물 솔루션 100 µL를 추가하고, 약물 처리 후 플레이트와 슬라이드를 37 °C에서 48시간 동안 배양합니다. 무혈청 배지로 챔버와 슬라이드를 3회 세척합니다.슬라이드에서 플라스틱 챔버를 벗겨내고, 슬라이드를 methanol에 30초 동안 담가 세포를 고정합니다. 슬라이드를 층류 랩형 바이오해저드 후드 안에 넣어 건조시킵니다. 그동안 cyber green 5x 용액을 준비합니다.슬라이드가 마르면, 세포 및 기생충 DNA를 염색하기 위해 cyber green에 담급니다. 샘플을 상온의 암소에서 15분 동안 배양합니다. 염색 단계 후, 슬라이드를 물로 세척하고 건조시킵니다.마운팅 매질을 사용하여 슬라이드 위에 유리 커버슬립을 덮습니다. 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 샘플을 관찰하고 각 챔버의 이미지를 캡처합니다. 비감염 세포에서는 대식세포의 핵만 관찰되지만, 감염된 세포의 세포질에서는 기생충의 핵과 관 모양 구조(canlas)가 관찰되어 세포 내 Donny 기생충의 존재를 확인할 수 있습니다.감염량을 정량화하려면 Image J를 사용하여 감염률(percent infectivity)을 계산하며, 이는 기생충 회수 분석(parasite rescue assay)에서 대식세포 핵 수 대비 am master goat 핵 수에 100을 곱한 값으로 산출합니다. 먼저, 96-well plate 공배양물을 무혈청 RPMI 배지로 3회 세척한 후, 0.05% SDS-RPMI 20 µL를 사용하여 세포를 용해합니다. 각 웰에 처리한 후 플레이트를 30초 동안 흔들어 줍니다.그런 다음 웰당 10% F-B-S-R-P-M-I 180 µL를 추가합니다. 구출된 master의 생존력에 영향을 주지 않으면서 대식세포의 제어된 용해를 유도하기 위해 SDS 처리 시간은 30초를 초과해서는 안 됩니다. 구출된 visible a master가 pro master goats로 형질전환 및 증식할 수 있도록 플레이트를 26 °C에서 48시간 동안 배양합니다.프로 마스터 고트(pro master goats)를 정량화하려면, 96-웰 플레이트의 각 웰에 alamar blue 10 µL를 추가하고 26 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후, 표준 형광 광도계로 플레이트를 판독하여 살아있는 기생충을 정량화합니다. 약물이 없는 경우, 대식세포 수 대비 마스터 고트의 수에 따라 감염률이 증가합니다.또한, 구조 분석(rescue assay)을 통해 결정된 생존 기생충의 수는 amphotericin 농도가 증가함에 따른 감염률 백분율과 높은 상관관계를 보입니다. B.구조된 기생충의 수는 농도 의존적으로 감소합니다. 기생충 구조 및 형질전환 분석은 연속적인 현미경 관찰 영상으로 요약될 수 있습니다.이 사진은 *Leishmania amazonensis*에 감염되어 배양 중인 온전한 THP-1 세포를 보여줍니다. 이 감염된 THP-1 세포는 살아있는 *L. amazonensis*를 회수하기 위해 제어된 용해 과정을 거칩니다. 감염된 THP-1 세포에서 회수된 살아있는 *L. amazonensis*는 배양액을 ProMaster 배지로 전환시킵니다.형질전환된 ProMaster goat는 배양액 내에서 성장 및 증식합니다. 배양된 ProMaster goat의 총 수는 살아있는 세포 내 oma goat의 수와 직접적으로 비례합니다. 본 분석법은 limania에 감염된 THP-1 세포의 대조 라이선스에 최적화되었습니다.본 실험의 목적은 세제 처리 조건을 최적화하여, 구조 MST 코드의 TY에는 영향을 최소화하면서 THV one 세포의 용해를 거의 완전히 유도하는 것이었습니다. 이 단계는 본 분석에서 매우 결정적인 과정입니다. 여기서 시연하는 기생충 구조 분석법은 다양한 미세 심장 세포주에서 피부 또는 점막 피부 리슈마니아증을 유발하는 다양한 리니아 기생충 종의 감염력을 측정하는 데 적용할 수 있으며, 서로 다른 리니아 야생 분리주 또는 유전적으로 조작된 기생충 세포주에도 적용 가능합니다.SA로서의 기생충 구조와 SA로서의 이미지 분석 모두 유사한 결과를 보여줍니다. 이들은 자동화 및 대규모 스크리닝에 적용될 가능성이 있습니다. 본 연구진은 저희 센터에서 이용 가능한 천연물 추출물의 고속 분획을 통해 준비된 16,000개 이상의 분획물을 스크리닝하는 데 이 에세이를 성공적으로 적용하였습니다.또한 DIC 및 플루오레세인 필터 하에서 캡처한 이미지를 결합하고 ImageJ를 사용하여 감염 정도를 정량화함으로써 이미지 분석법을 최적화하였습니다. ImageJ는 NIH에서 최초로 개발한 공개 Java 기반 이미지 처리 프로그램입니다. 이 분석법을 통해 새로운 화합물을 포함하는 여러 천연물 분획이 장관 치료제 발견을 위한 새로운 리드 화합물로 확인되었습니다.

a-parasite-rescue-transformation-assay-for-antileishmanial-screening

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

이 비디오는 대식세포를 메타고리 전구세포로 처리하여 세포 내 변형체를 형성함으로써 리슈마니아의 독성을 조사합니다. 리슈마니아의 독성은 핵산 형광 염료 염색을 통해 확인됩니다. 이러한 통찰력은 리슈마니아증에 대한 새로운 치료법 개발에 기여할 수 있습니다.

배양된 대식세포 내 Leishmania Virulence 평가

이 동영상은 골수 유래 대식세포(BMM)에서 기생충의 세포 내 성장을 정량화하는 분석을 보여줍니다. 대식세포 세포는 각각 리슈마니아(Leishmania)의 운동성 및 비운동성 침습 단계(motile and non-motile invasive stages), 메타고리 전구세포(metacyclic promastigotes) 및 무산소세포(amastigotes)에 감염되어 있습니다. 기생충은 대식세포에 침입하여 기생 액포(parasitophorous vacuole)로 내면화되어 내부에서 증식합니다. 세포 내 기생충 성장은 대식세포와 기생충 핵을 형광 염색할 때 현미경을 사용하여 정량화합니다.

대식세포에서 기생충의 세포 내 성장을 정량화하기 위한 In vitro 분석

동일한 순서로 양이온 기능이 혼합된 펩토이드를 합성하는 프로토콜이 제시됩니다(라이신 및 아르기닌 유형 단량체). 피부 리슈마니아증을 일으키는 원생동물 기생충인 Leishmania mexicana에 대한 이러한 화합물의 후속 테스트도 설명됩니다.

이들 안티 leishmanial 역가의 혼합 리신 형 / 아르기닌 형 단량체 및 평가를 펩 토이 드의 합성을위한 효과적인 방법

모든 병원 성 Leishmania 종 있으며 그들의 척추 호스트의 세포 내부 복제. 여기, 선물이 Leishmania, 세포내 성장 속도의 정확한 정량화 다음으로 문화 murine 골 수 유래 세포를 감염 하는 프로토콜. 이 메서드는 호스트 병원 체 상호 작용 및 Leishmania 독성에 영향을 미치는 개별 요소를 공부 하는 데 유용.

대 식 세포 안의 세포내 성장의 정량화는 빠르고 Leishmania 기생충의 독성을 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법

여기에서, 우리는 Leishmania amazonensis를가진 마우스의 절단 감염을 평가하기 위하여 컴파일된 프로토콜을 제출합니다. 이것은 기생충 바이러스를 공부하기 위한 믿을 수 있는 방법, 감염에 척추동물 호스트 반응의 체계적인 보기를 허용하.

리슈마니아 아마존과 생체 감염에서 마우스에서 기생충 독성을 평가하기 위해

Leishmania 감염에서 식균작용과 관련된 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다. 여기에서, 우리는 숙주 세포와의 리슈마니아 상호작용 동안 발생하는 초기 사건을 평가하는 방법을 설명한다.

공초점 현미경을 사용하여 리슈마니아 의 식균작용 조사

여기에 제시된 것은 리슈만편모충 주요 프로마스티고테를 사용하여 기공 형성 독소에 의해 유도된 결합, 세포독성 및 신호전달을 결정하는 프로토콜입니다. 스트렙톨리신 O를 사용한 개념 증명이 제공됩니다. 다른 독소는 또한 독소 내성의 새로운 메커니즘을 정의하기 위해 L. major에서 사용할 수 있는 유전적 돌연변이를 활용하는 데 사용될 수 있습니다.

리슈만편모충 전공을 이용한 기공 형성 독소의 분자 메커니즘과 기능 해독

여기에서는 pLEXSY 시스템을 사용하여 안정적인 통합 이식 유전자로서 eGFP에 대한 유전자를 발현하는 L . panamensis 및 L . donovani 균주를 생성하는 데 사용되는 방법론을 설명합니다. 형질주입된 기생충은 희석을 제한하여 클로닝하고, 두 종 모두에서 가장 높은 형광 강도를 갖는 클론을 약물 스크리닝 분석에 추가로 사용하기 위해 선택했습니다.

eGFP의 구성적 발현을 통한 리슈만편모충 종 균주의 개발

여기에서는 생물 발광 이미징 및 PCR에 의해 L. infantum-Luc에 복강내(IP) 또는 치은내(IG)를 통해 감염된 골든 햄스터에 대한 종단 평가를 제시합니다. 햄스터는 감염 후 1일(1dpi), 감염 1주일(8dpi), 감염 후 3주(22dpi)에 평가를 받고 50번째 dpi와 감염 후 8개월에 안락사시켰다.

생체 내 루시페라아제를 발현하는 Axenic Amastigotes의 치은 접종에 의한 Leishmania infantum-infected Hamsters의 이미징

학습하세요 THP1 세포를 이용한 Leishmania donovani 아마스티고트의 항리슈만증 약물 스크리닝 방법을. 이 기술은 살아있는 세포내 기생충만 정량하여 신약 개발에 필수적인 정확한 결과를 제공합니다.

세포에 붙어 Antileishmanial 검사에 대한 기생충 구조 및 변화 분석

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