Name: 췌장 선암 조직의에서 B7-H1의 Immunohistochemical 착색 (PD-L1) 파라핀은 - 임베디드 슬라이드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 배우세요 췌장 선암 조직에서 B7-H1(PD-L1)의 면역조직화학적 염색법을 이용하여 면역억제 신호를 시각화하는 방법을. 이 기술은 종양 미세환경에서 단백질 발현을 정확히 분석하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

EB, KMB, 그리고 HX 동일하게 기여하고 있습니다. 이 연구는 위장 암 P50 CA062924, NIH K23 CA148964, Lustgarten 재단, Viragh 재단, ASCO 젊은 연구자 상, NIH 5T32 CA0090701-28 교육 교부금, 솔 골드만 삭스의 췌장암 센터, 국립 췌장 재단에서 NCI의 포자에 의해 지원되었다.

B7-H1/PD-L1, 면역 규제 세포 표면 단백질의 B7 가족의 일원은 (PD 프로그래밍 사망-1, 그 수용체와의 상호 작용을 통해 세포 매개 면역 반응의 부정적인 규제에 중요한 역할을 -1) 1,2. 종양 세포의 B7-H1의 Overexpression는 흑색 증, glioblastoma, 그리고 폐, 유방, 대장, 난소 및 신장 세포의 carcinomas을 포함 인간 암의 숫자에 기록되었으며, 항 종양 저해하는 표시되었습니다 T를 세포 면역 3-8. 최근 췌장 선암의 조직에 의해 B7-H1 표현은 잠재적 인 전조 마커 9,10로 확인되었습니다. 또한 췌장암의 마우스 모델에서 B7-H1의 봉쇄는 안티 종양 응답 11 생산 보여왔다. 이러한 데이터는 잠재적 인 치료 목표로 B7-H1의 중요성을 권장합니다. 안티 - B7-H1의 봉쇄 항체 따라서 여러 인간에 대한 임상 실험에서 테스트되고 있습니다흑색 증과 폐, 대장, 신장, 위장, 췌장 (12)의 암 등의 고체 종양. 결국 치료를 타겟으로 B7-H1의 혜택을받을 환자를 식별 할 수 있도록 위해서는 표현과 B7-H1과 B7-H1의 봉쇄 항체 치료에 대한 환자 반응의 국산화 사이의 상관 관계를 조사하는 것이 중요합니다. immunohistochemistry를 통해 인간의 췌장 선암의 조직에서 B7-H1의 표현을 조사하면이 공동 억제 신호 분자가 종양의 microenvironment에 antitumor 면역의 억제에 기여하는 방법에 대한 이해를 제공 할 것입니다. 첸과 동료에 의해 ​​개발 된 안티 - B7-H1 단클론 항체 (클론 5H1)가 인간의 neoplastic 조직 4,8의 여러 유형의 cryosections에서 신뢰할 수있는 염색 결과를 생산하기 위해 표시하지만, 파라핀 - 임베디드 슬라이드에 얼룩되었습니다 것은 때까지 도전이었다 최근 13-18. 우리는 B7-H1 staini을 개발했습니다췌장 선암의 조직의 파라핀 - 임베디드 슬라이드에 대한 것이다 프로토콜. 여기에 설명 된 B7-H1의 착색 프로토콜은 약간의 배경 B7-H1의 일관성 막과 세포질 염색을 생산하고 있습니다. 1. 드 - parafinization <ol><li> 구워 20 분에 55 ° C에서 슬라이드. </li><li> 10 분을위한 크실렌의 화학 후드에서 잠그다는 슬라이드. </li><li> 10 분에 대한 새로운 크실렌에 젖어 슬라이드. </li><li> 젖어은 5 분 동안 100 %의 에탄올에 슬라이드. </li><li> 빠져 5 분을위한 신선한 100 % 에탄올에 슬라이드. </li><li> 젖어은 5 분 동안 95 %의 에탄올에 슬라이드. </li><li> 젖어은 5 분 동안 80 % 에탄올에 슬라이드. </li><li> 젖어은 5 분 동안 탈 이온수에 슬라이드. </li></ol> 2. 항원 불러 오기 <ol><li> 그리고 125 ° C 30 초를위한 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼 (산도 9.0)과 압력 밥솥의 열, 90 ° 10 초에 C에 젖어 슬라이드. </li><li> 60 분에 슬라이드가 멋진 보자. </li><li> 5 분에 TBST에 빠져 슬라이드, repe두 번에. </li></ol> 3. 더럽히는 것 <ol><li> 슬라이드에 조직 주위에 솔루션을 닦아. 소수성 펜으로 조직 주위에 원을 표시합니다. </li><li> 습도 챔버에 슬라이드를 삽입하고 전체 염색 과정에서 슬라이드의 조직의 건조를 방지. 5 분에 퍼 옥시 데이즈 블록에서 슬라이드 및 품다 슬라이드에 소수성 원에서 퍼 옥시 데이즈 블록의 장소 한 방울 (완전히 조직 영역을 커버하기 위해 약 200 μl 이상). </li><li> 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. </li><li> BLOCK ACE 장소 한 방울로 15 분 각 슬라이드 및 배양에 버퍼를 차단. </li><li> 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. </li><li> 15 분 각 슬라이드 및 배양에 아비딘 솔루션의 장소 한 방울. </li><li> 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. </li><li> 15 분 각 슬라이드 및 배양에 비오틴 솔루션의 장소 한 방울. </li><li> SLI를 씻어TBST로 DES, 5 분에 TBST에서 다음 장소. </li><li> 마우스 방지 B7-H1 단클론 항체의 1:1,000 희석 (복제 5H1) 또는 마우스 IgG1과 함께 슬라이드를 배양 4에 200 μl TBST에서 κ isotype 제어 ° C 22 시간 + / 밤새 - 1 시간. TBST의 최종 항체 농도는 2.57 μg / ML입니다. </li><li> 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. 두 번 반복합니다. </li><li> 30 분의 1:500 농도에서 비오틴 복합 쥐 안티 - 마우스 IgG1 항체 보조 (200 μl 2 % 염소 혈청 솔루션)에 슬라이드를 품다. </li><li> 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. 두 번 반복합니다. </li><li> Streptavidin-비오틴 복합체 대신 한 방울은 15 분 각 슬라이드 및 배양에 (사용 전에 적어도 30 분을 준비해야합니다.) </li><li> 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. 두 번 반복합니다. </li><li> 4 분 각 슬라이드 및 배양에 증폭 시약 대신 한 방울 (TBST로 2시 1분을 희석). </li><li> T와 슬라이드를 씻어영국 서머 타임, 5 분에 TBST에서 다음 장소. 두 번 반복합니다. </li><li> 15 분 각 슬라이드 및 배양에 Streptavidin-HRP 대신 한 방울. </li><li> 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. 두 번 반복합니다. </li><li> 각 슬라이드에 하나 3,3-Diaminobenzidine의 드롭 (DAB) 기판과 chromogen을 놓고 2 분의 색상을 개발합니다. </li><li> 즉시 색상 개발 한 후, 1-2 분 동안 ddH 2 O로 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 90 초 동안 hematoxylin 한 방울과 슬라이드를 품다. </li><li> 1-2 분 동안 ddH 2 O로 씻으십시오. </li><li> 1-2 분 동안 비누의 수돗물로 씻으십시오. </li><li> 1-2 분 동안 ddH 2 O로 씻으십시오. </li></ol> 4. 탈수 및 장착 <ol><li> 3 분에 80 % 에탄올에 슬라이드를 빠져. </li><li> 3 분에 95 %의 에탄올에 슬라이드를 빠져. </li><li> 5 분을위한 100 % 에탄올에 슬라이드를 빠져. 반복합니다. </li><li> 5 분에 크실렌에서 슬라이드를 빠져. 반복합니다. </li><li> 한 방울을 추가슬라이드과 장소 coverslip에 Cytoseal 60. </li></ol> 표 1은 위에서 설명한 절차에 사용되는 시약을 나열합니다.

<ol><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+B7s%3A+playing+a+pivotal+role+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity.</a> J. Immunother. 30, 251-260 (2007).</li>
<li>Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1%2C+a+third+member+of+the+B7+family%2C+co-stimulates+T-cell+proliferation+and+interleukin-10+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion.</a> Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).</li>
<li>Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+improves+myeloid+dendritic+cell-mediated+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity.</a> Nat. Med. 9, 562-567 (2003).</li>
<li>Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDong%2C+H+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. 8, 793-800 (2002).</li>
<li>Dong, H., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+pathway+and+its+role+in+the+evasion+of+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity.</a> J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).</li>
<li>Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+blockade+augments+adoptive+T-cell+immunotherapy+for+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma.</a> Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).</li>
<li>Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+and+PD-1+by+monoclonal+antibodies+potentiates+cancer+therapeutic+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity.</a> Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costimulatory+B7-H1+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+Indicator+of+tumor+aggressiveness+and+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).</li>
<li>Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+up-regulated+expression+in+human+pancreatic+carcinoma+tissue+associates+with+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).</li>
<li>Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+regulation+of+the+costimulatory+molecule+B7-H1+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer.</a> Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).</li>
<li>Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+or+B7-DC+induces+an+anti-tumor+effect+in+a+mouse+pancreatic+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model.</a> Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).</li>
<li>Wang, S., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+cancer+therapies+targeting+CD137+and+B7-H1%2FPD-1+cosignal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).</li>
<li>Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+glycoprotein+blockade%3A+a+novel+strategy+to+enhance+immunotherapy+in+patients+with+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma.</a> Urology. 66, 10-14 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+B7-H1+is+associated+with+poor+prognosis+in+renal+cell+carcinoma+patients+with+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up.</a> Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).</li>
<li>Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+B7-H1+expression+in+clear+cell+carcinoma+of+the+kidney+for+prognostication+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy.</a> Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).</li>
<li>Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-expressed+B7-H1+and+B7-DC+in+relation+to+PD-1%2B+T-cell+infiltration+and+survival+of+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma.</a> Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).</li>
<li>Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+%28B7-H1%29+expression+by+urothelial+carcinoma+of+the+bladder+and+BCG-induced+granulomata%3A+associations+with+localized+stage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression.</a> Cancer. 109, 1499-1505 (2007).</li>
<li>Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).</li>
<li>Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+B7-H1+and+B7-1+expressions+in+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma.</a> World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).</li>
<li>Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+therapeutic+potential+of+the+programmed+death-1+ligand%2Fprogrammed+death-1+pathway+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer.</a> Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).</li>
<li>Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+inflammatory+response+with+B7-h1+expression+in+human+melanocytic+lesions+supports+an+adaptive+resistance+mechanism+of+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape.</a> Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

cryosections에서 B7-H1의 Immunohistochemical 착색은 암 3,4의 다양한 사전 연구에서보고되었습니다. 그러나, 임상 종양 샘플을 일반적으로 파라핀 - 임베디드 블록의 형태로 사용할 수 있습니다. 5H1 단클론 항체는 최근 성공적으로 신장 세포 암종, 자궁 경부 암, 방광 암, 흑색 증 13-18 등의 파라핀 포함 된 종양 조직의 착색에 적용되었습니다. 파라핀 - 임베디드 9,19 또는 그라 이오 스탯 다른 단클론 항체와 췌장 선암의 조직의 20 섹션에서 B7-H1의 얼룩도보고되었습니다. 여기, 우리는 B7-H1에 5H1 단클론 항체와 파라핀 - 임베디드 췌장 선암의 조직을 성공적으로 착색을 보여 주었다. 췌장 선암의 B7-H1의 표현은 흑색 증 4,21 등 malignancies의 많은 다른 유형의 것과 유사 이기종입니다. B7-H1 AR의 막과 세포질 모두 표현e는 선암 세포 (그림 1...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> CSA 시스템 </td><td> Dako </td><td> K1500 </td><td> 퍼 옥시 데이즈 블록, streptavidin-비오틴 단지, 증폭 시약, streptavidin-HRP 및 DAB 기판과 chromogen 다음 프로토콜에 언급 된 시약을 포함 </td></tr><tr><td> 아비딘 / 비오틴 차단 키트 </td><td> 벡터 </td><td> SP-2001 </td><td></td></tr><tr><td> 차단 ACE </td><td> Serotec </td><td> BUF029 </td><td></td></tr><tr><td> 비오틴 안티 - 마우스 IgG1 </td><td> BD </td><td> 553441 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 IgG1 K Isotype 제어 </td><td> eBioscience </td><td> 14-4714-85 </td><td></td></tr><tr><td> 10X TBS (생리 트리스 버퍼) </td><td> Cellgro </td><td> 46-012-CM </td><td> 10xTBS 80 G / L NaCl 및 24.2 g / L Tirs을 포함, 세차를위한 ddH2O와 1X로 희석; </td></tr><tr><td> 십대 초반 20 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P1379 </td><td> 한 ML은 TBST를 만들기 위해 1X TBS의 1 L에 추가 </td></tr><tr><td> 대상 검색, 20x </td><td> Celerus 웨이브 </td><td> 014-3000-000 </td><td> ddH 2 O로 1 회에 희석 </td></tr><tr><td> 190 증명 에틸 알코올 </td><td> Pharmco - Aaper </td><td> 111000190 </td><td></td></tr><tr><td> 200 증명 에틸 알코올 </td><td> Pharmo - Aaper </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> 크실렌 </td><td> VWR </td><td> 95057-827 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> 리차드 - 앨런 과학 </td><td> 72,804 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> 리차드 - 앨런 과학 </td><td> 8310-4 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> 코닝 </td><td> 2940-245 </td><td></td></tr><tr><td> 습도 챔버 </td><td> 시그마 </td><td> H6644 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 시약 및 장비. </td></tr></tbody></table>

췌장 선암 조직의에서 b7-h1의 immunohistochemical 착색 (pd-l1) 파라핀은 - 임베디드 슬라이드

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, 면역 규제 세포 표면 단백질의 B7 가족의 일원은 (PD 프로그래밍 사망-1, 그 수용체와의 상호 작용을 통해 세포 매개 면역 반응의 부정적인 규제에 중요한 역할을 -1) 1,2. 종양 세포의 B7-H1의 Overexpression는 흑색 증, glioblastoma, 그리고 폐, 유방, 대장, 난소 및 신장 세포의 carcinomas을 포함 인간 암의 숫자에 기록되었으며, 항 종양 저해하는 표시되었습니다 T를 세포 면역 3-8. 최근 췌장 선암의 조직에 의해 B7-H1 표현은 잠재적 인 전조 마커 9,10로 확인되었습니다. 또한 췌장암의 마우스 모델에서 B7-H1의 봉쇄는 안티 종양 응답 11 생산 보여왔다. 이러한 데이터는 잠재적 인 치료 목표로 B7-H1의 중요성을 권장합니다. 안티 - B7-H1의 봉쇄 항체 따라서 mul에 대한 임상 실험에서 테스트되고 있습니다흑색 증과 폐, 대장, 신장, 위장, 췌장 (12)의 암을 포함 tiple 인간의 고체 종양. 결국 치료를 타겟으로 B7-H1의 혜택을받을 환자를 식별 할 수 있도록 위해서는 표현과 B7-H1과 B7-H1의 봉쇄 항체 치료에 대한 환자 반응의 국산화 사이의 상관 관계를 조사하는 것이 중요합니다. immunohistochemistry를 통해 인간의 췌장 선암의 조직에서 B7-H1의 표현을 조사하면이 공동 억제 신호 분자가 종양의 microenvironment에 antitumor 면역의 억제에 기여하는 방법에 대한 이해를 제공 할 것입니다. 첸과 동료에 의해 ​​개발 된 안티 - B7-H1 단클론 항체 (클론 5H1)가 인간의 neoplastic 조직 4,8의 여러 유형의 cryosections에서 신뢰할 수있는 염색 결과를 생산하기 위해 표시하지만, 파라핀 - 임베디드 슬라이드에 얼룩되었습니다 것은 때까지 도전이었다 최근 13-18. 우리는 개발자가췌장 선암의 조직의 파라핀 - 임베디드 슬라이드에 대한 사랑의 도피를 떠났을 B7-H1의 착색 프로토콜. 여기에 설명 된 B7-H1의 착색 프로토콜은 약간의 배경 B7-H1의 일관성 막과 세포질 염색을 생산하고 있습니다.

B7-H1의 성공적인 immunohistochemical 얼룩은 췌장 선암의 B7-H1 (갈색 신호 DAB 색상 개발)의 이기종 표현을 보여줍니다. 다른 B7-H1 또는 B7-H1 (도 2 및도 3)의 작은 표현 중 하나 주로 세포질 표현을 할 수 있지만 일부 췌장 선암 세포는 B7-H1의 주로 막 표현 (그림 1A)를 갖추고 있습니다. 일반 췌장 덕트 상피는 (그림 4) B7-H1 약간을 표현한다. 마우스 IgG1 κ isotype 제어 항체와 얼룩 대신 반 B7-H1 항체의 것은 약간의 배경 착색 (그림 1B)를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/4059/4059fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. 반 B7-H1과 A. Immunohisto...

B7-H1 (PD-L1) 및 PD-1의 바인딩은 종양의 microenvironment의 주요 종양 유발 면역 신호를 제공합니다. 표현과 췌장 선암의 B7-H1의 국산화를 특성화 할 수 immunohistochemical 얼룩 기법이 여기에 설명되어 있습니다.

췌장 선암 조직의에서 B7-H1의 Immunohistochemical 착색 (PD-L1) 파라핀은 - 임베디드 슬라이드

면역 조절 세포 표면 단백질인 B7 가족의 구성원인 B7-H1/PD-L1은 세포 매개 면역의 부정적 조절에서 중요한 역할을 합니다.

본 절차의 전반적인 목표는 면역조직화학 염색 기법을 사용하여 인간 췌장선암 조직의 파라핀 절편에서 B seven H one PD L one의 발현을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 슬라이스 된 조직 절편에서 파라핀을 제거하고 재수화함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 항원 회복으로, 압력솥을 사용하여 조직을 염색하는 과정이 포함됩니다.항체 염색 과정 후 신호 증폭 및 DAB 발색 단계가 이어집니다. 마지막 단계는 조직을 탈수하고 마운팅하는 것입니다. 모든 과정이 완료되면.현미경 관찰 및 이미지 분석을 통해 막성 및 세포질의 B7-H1을 시각화할 수 있습니다. 이는 종양 미세환경에서 B7-H1/BTL1이 항종양 면역 억제에 어떻게 기여하는지에 대한 더 나은 이해를 제공함으로써, 췌장 내분비암 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 동결 절편 염색과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 더 쉽게 구할 수 있고 보관이 용이한 파라핀 매립 조직 절편 사용에 최적화되었다는 점입니다.파라핀을 먼저 제거하지 않으면 슬라이드에서 신뢰할 수 있는 항체 염색이 불가능합니다. 따라서 파라핀에 매립된 조직이 있는 슬라이드를 준비하려면, 먼저 슬라이드를 55 °C에서 20분 동안 가열하십시오. 다음으로, 화학 흄 후드 내에서 7단계의 화학 세척조를 사용하여 파라핀을 제거하는데, 먼저 슬라이드를 xylene에 10분 동안 담그십시오.다음으로, 슬라이드를 두 번째 새 자일렌 수조에 10분 동안 담급니다. 세 번째로, 슬라이드를 100% ethanol에 5분 동안 담급니다. 네 번째로, 다시 한번 슬라이드를 새 100% ethanol에 5분 동안 담급니다.다섯째로, 슬라이드를 95% ethanol에 5분 동안 담급니다. 여섯째로, 슬라이드를 80% ethanol에 5분 동안 담급니다. 마지막으로, 탈이온수로 슬라이드를 5분 동안 깨끗이 세척합니다.파라핀을 제거한 후, 다음으로 항원을 노출시켜야 합니다. 먼저, 슬라이드를 Tris EDTA 완충액에 담급니다. 그런 다음, 2단계 프로그램을 설정한 압력솥에서 슬라이드를 가열합니다.먼저, 125 °C에서 30초 동안 가열합니다. 두 번째로, 90 °C에서 10초 동안 가열합니다. 그 다음 슬라이드를 그대로 두어 실온까지 식힙니다.슬라이드를 한 시간 동안 식힌 후, TBST로 2회 세척하며 각 세척 단계마다 5분씩 유지합니다. 이제 각 슬라이드를 염색할 수

immunohistochemical-staining-b7-h1-pd-l1-on-paraffin-embedded-slides

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 hematoxylin 및 eosin (H &amp; E)과 immunohistochemistry (IHC)을 사용하여 인간의 췌장 islets의 특성화를위한 절차를 설명합니다. 머리, 몸, 그리고 꼬리 지역의 췌장 부분은 섬 내분비 성분 (인슐린, 글루카곤, 그리고 췌장 폴리펩티드), 세포 복제 (Ki67) 및 염증 infiltrates (H &amp; E, 인 경우에는 3 번 CD)를 결정하기 위해 H &amp; E와 IHC 모두가 묻은 게있다. uncinate 지역은 췌장 폴리펩티드에 대한 IHC를 사용하여 지역화된됩니다.

인간의 췌장 Islets위한 염색법 프로토콜

여기, 우리는 프로토콜 사용 하 여 3 차원 (3D) 이미지 인간의 췌 섹션을 최적화 수동 삭제 방법 제시. 이 원고에서는 수동 광 비운 뒤에 여러 면역 형광 인간의 독도 innervating 자율 고 감각 신경 네트워크의 핵심 요소를 식별 하기 위해 얼룩에 대 한이 절차를 보여 줍니다.

인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징

Murine orthotopic PDAC homografts immunophenotyping에 실험 절차는 종양 면역 microenvironment 프로 파일링 목표로 합니다. 종양은 수술을 통해 이식 하는 orthotopically. 종양 크기에 200-600 m m3 의 수확 되었고 단일 셀 정지, 여러 면역 표식 FACS 분석 다른 붙일 표시 된 항 체를 사용 하 여 다음을 준비 하는 해리.

Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의

췌 장 섬 연구 비보 전 당뇨병 연구에 대 한 중요 하다. 기존 기술을 그들의 네이티브 3 차원 건축 교양된 독도 공부 시간이 소요, 비효율적이 고, 자주 사용 됩니다. 이 작품 전체 교양된 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하기 위한 새로운 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다.

췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

자세한 프로토콜 6-마커 멀티플렉스 면역 형광 패널 최적화 수행 위한 더 일관 된 결과를 짧은 절차 시간 자동된 염색기를 사용. 이 방법은 종양 면역 연구에 대 한 모든 실험실에 의해 직접 적응 될 수 있다.

포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널

여기, 우리는 간단 하 고, 침략, 그리고 쉽게 처리 방법, 더 적은에서 유 방 지방 패드에 유방암 세포를 이식 하는 프로토콜을 제시 하 고이 마우스 orthotopic 유 방 암 모델 적절 한 유 방 지방 패드 환경으로 사용할 수 있습니다의 다양 한 측면을 조사 하 암입니다.

Orthotopic 쥐 유 방 지방 패드 유방암 세포의 주입

생체 내 면역형광 국소화(IVIL) 방법은 생체내 종양 표적화 및 ex vivo 면역염색의 조합을 사용하여 살아있는 유기체에서 종양학적 목적을 위해 항체 및 항체 접합체의 생체 분포를 검사하는데 사용될 수 있다. 방법.

암 연구에서 치료 및 진단 항체 바이오 유통 평가를 위한 생체내 면역형광 국소화

이 실험 프로토콜은 주로 단일 채널 항체 배양 조건을 최적화하고 항체 및 채널의 설정을 조정하여 임상 기원 폐암 조직의 자가형광 및 채널 누화 문제를 해결함으로써 다중 면역조직화학(IHC) 염색 방법을 설명하고 최적화합니다.

파라핀 포매된 폐암 조직을 위한 다중 면역조직화학 염색

다중 순환 면역조직화학은 반복적인 항원-항체 배양, 이미지 스캐닝, 이미지 정렬 및 통합을 사용하여 여러 마커를 동시에 현장에서 검출할 수 있습니다. 여기에서는 폐암과 쌍을 이루는 뇌 전이 샘플에서 이 기술로 면역 세포 기질을 식별하기 위한 운영 프로토콜을 제시합니다.

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry(다중 순환 형광 면역조직화학)

전립선 암의 개시, 소설과 혁신적인 인체 모델 시스템과 방법을 기본 최초의 분자 메커니즘이 절실히 필요 해명합니다. 인간의 전립선 상피 세포를 형성하는 만능 줄기 세포 인구를 유도하는 사전 전립선 비뇨 동 간엽 (UGSM)의 가능성이 전립선 연구에 강력한 실험 도구입니다.

설치류 비뇨 부비동 간엽 및 인간 줄기 세포의 조직 재조합을 사용하여 인간의 전립선 상피의 형성

배우세요 췌장 선암 조직에서 B7-H1(PD-L1)의 면역조직화학적 염색법을 이용하여 면역억제 신호를 시각화하는 방법을. 이 기술은 종양 미세환경에서 단백질 발현을 정확히 분석하는 데 활용됩니다.

췌장 선암 조직의에서 B7-H1의 Immunohistochemical 착색 (PD-L1) 파라핀은 - 임베디드 슬라이드

더 많은 동영상 탐색