Name: 췌장 선암 조직의에서 B7-H1의 Immunohistochemical 착색 (PD-L1) 파라핀은 - 임베디드 슬라이드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 배우세요 췌장 선암 조직에서 B7-H1(PD-L1)의 면역조직화학적 염색법을 이용하여 면역억제 신호를 시각화하는 방법을. 이 기술은 종양 미세환경에서 단백질 발현을 정확히 분석하는 데 활용됩니다.

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EB, KMB, 그리고 HX 동일하게 기여하고 있습니다. 이 연구는 위장 암 P50 CA062924, NIH K23 CA148964, Lustgarten 재단, Viragh 재단, ASCO 젊은 연구자 상, NIH 5T32 CA0090701-28 교육 교부금, 솔 골드만 삭스의 췌장암 센터, 국립 췌장 재단에서 NCI의 포자에 의해 지원되었다.

B7-H1/PD-L1, 면역 규제 세포 표면 단백질의 B7 가족의 일원은 (PD 프로그래밍 사망-1, 그 수용체와의 상호 작용을 통해 세포 매개 면역 반응의 부정적인 규제에 중요한 역할을 -1) 1,2. 종양 세포의 B7-H1의 Overexpression는 흑색 증, glioblastoma, 그리고 폐, 유방, 대장, 난소 및 신장 세포의 carcinomas을 포함 인간 암의 숫자에 기록되었으며, 항 종양 저해하는 표시되었습니다 T를 세포 면역 3-8. 최근 췌장 선암의 조직에 의해 B7-H1 표현은 잠재적 인 전조 마커 9,10로 확인되었습니다. 또한 췌장암의 마우스 모델에서 B7-H1의 봉쇄는 안티 종양 응답 11 생산 보여왔다. 이러한 데이터는 잠재적 인 치료 목표로 B7-H1의 중요성을 권장합니다. 안티 - B7-H1의 봉쇄 항체 따라서 여러 인간에 대한 임상 실험에서 테스트되고 있습니다흑색 증과 폐, 대장, 신장, 위장, 췌장 (12)의 암 등의 고체 종양. 결국 치료를 타겟으로 B7-H1의 혜택을받을 환자를 식별 할 수 있도록 위해서는 표현과 B7-H1과 B7-H1의 봉쇄 항체 치료에 대한 환자 반응의 국산화 사이의 상관 관계를 조사하는 것이 중요합니다. immunohistochemistry를 통해 인간의 췌장 선암의 조직에서 B7-H1의 표현을 조사하면이 공동 억제 신호 분자가 종양의 microenvironment에 antitumor 면역의 억제에 기여하는 방법에 대한 이해를 제공 할 것입니다. 첸과 동료에 의해 ​​개발 된 안티 - B7-H1 단클론 항체 (클론 5H1)가 인간의 neoplastic 조직 4,8의 여러 유형의 cryosections에서 신뢰할 수있는 염색 결과를 생산하기 위해 표시하지만, 파라핀 - 임베디드 슬라이드에 얼룩되었습니다 것은 때까지 도전이었다 최근 13-18. 우리는 B7-H1 staini을 개발했습니다췌장 선암의 조직의 파라핀 - 임베디드 슬라이드에 대한 것이다 프로토콜. 여기에 설명 된 B7-H1의 착색 프로토콜은 약간의 배경 B7-H1의 일관성 막과 세포질 염색을 생산하고 있습니다. 1. 드 - parafinization <ol><li> 구워 20 분에 55 ° C에서 슬라이드. </li><li> 10 분을위한 크실렌의 화학 후드에서 잠그다는 슬라이드. </li><li> 10 분에 대한 새로운 크실렌에 젖어 슬라이드. </li><li> 젖어은 5 분 동안 100 %의 에탄올에 슬라이드. </li><li> 빠져 5 분을위한 신선한 100 % 에탄올에 슬라이드. </li><li> 젖어은 5 분 동안 95 %의 에탄올에 슬라이드. </li><li> 젖어은 5 분 동안 80 % 에탄올에 슬라이드. </li><li> 젖어은 5 분 동안 탈 이온수에 슬라이드. </li></ol> 2. 항원 불러 오기 <ol><li> 그리고 125 ° C 30 초를위한 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼 (산도 9.0)과 압력 밥솥의 열, 90 ° 10 초에 C에 젖어 슬라이드. </li><li> 60 분에 슬라이드가 멋진 보자. </li><li> 5 분에 TBST에 빠져 슬라이드, repe두 번에. </li></ol> 3. 더럽히는 것 <ol><li> 슬라이드에 조직 주위에 솔루션을 닦아. 소수성 펜으로 조직 주위에 원을 표시합니다. </li><li> 습도 챔버에 슬라이드를 삽입하고 전체 염색 과정에서 슬라이드의 조직의 건조를 방지. 5 분에 퍼 옥시 데이즈 블록에서 슬라이드 및 품다 슬라이드에 소수성 원에서 퍼 옥시 데이즈 블록의 장소 한 방울 (완전히 조직 영역을 커버하기 위해 약 200 μl 이상). </li><li> 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. </li><li> BLOCK ACE 장소 한 방울로 15 분 각 슬라이드 및 배양에 버퍼를 차단. </li><li> 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. </li><li> 15 분 각 슬라이드 및 배양에 아비딘 솔루션의 장소 한 방울. </li><li> 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. </li><li> 15 분 각 슬라이드 및 배양에 비오틴 솔루션의 장소 한 방울. </li><li> SLI를 씻어TBST로 DES, 5 분에 TBST에서 다음 장소. </li><li> 마우스 방지 B7-H1 단클론 항체의 1:1,000 희석 (복제 5H1) 또는 마우스 IgG1과 함께 슬라이드를 배양 4에 200 μl TBST에서 κ isotype 제어 ° C 22 시간 + / 밤새 - 1 시간. TBST의 최종 항체 농도는 2.57 μg / ML입니다. </li><li> 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. 두 번 반복합니다. </li><li> 30 분의 1:500 농도에서 비오틴 복합 쥐 안티 - 마우스 IgG1 항체 보조 (200 μl 2 % 염소 혈청 솔루션)에 슬라이드를 품다. </li><li> 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. 두 번 반복합니다. </li><li> Streptavidin-비오틴 복합체 대신 한 방울은 15 분 각 슬라이드 및 배양에 (사용 전에 적어도 30 분을 준비해야합니다.) </li><li> 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. 두 번 반복합니다. </li><li> 4 분 각 슬라이드 및 배양에 증폭 시약 대신 한 방울 (TBST로 2시 1분을 희석). </li><li> T와 슬라이드를 씻어영국 서머 타임, 5 분에 TBST에서 다음 장소. 두 번 반복합니다. </li><li> 15 분 각 슬라이드 및 배양에 Streptavidin-HRP 대신 한 방울. </li><li> 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. 두 번 반복합니다. </li><li> 각 슬라이드에 하나 3,3-Diaminobenzidine의 드롭 (DAB) 기판과 chromogen을 놓고 2 분의 색상을 개발합니다. </li><li> 즉시 색상 개발 한 후, 1-2 분 동안 ddH 2 O로 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 90 초 동안 hematoxylin 한 방울과 슬라이드를 품다. </li><li> 1-2 분 동안 ddH 2 O로 씻으십시오. </li><li> 1-2 분 동안 비누의 수돗물로 씻으십시오. </li><li> 1-2 분 동안 ddH 2 O로 씻으십시오. </li></ol> 4. 탈수 및 장착 <ol><li> 3 분에 80 % 에탄올에 슬라이드를 빠져. </li><li> 3 분에 95 %의 에탄올에 슬라이드를 빠져. </li><li> 5 분을위한 100 % 에탄올에 슬라이드를 빠져. 반복합니다. </li><li> 5 분에 크실렌에서 슬라이드를 빠져. 반복합니다. </li><li> 한 방울을 추가슬라이드과 장소 coverslip에 Cytoseal 60. </li></ol> 표 1은 위에서 설명한 절차에 사용되는 시약을 나열합니다.

<ol><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+B7s%3A+playing+a+pivotal+role+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity.</a> J. Immunother. 30, 251-260 (2007).</li>
<li>Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1%2C+a+third+member+of+the+B7+family%2C+co-stimulates+T-cell+proliferation+and+interleukin-10+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion.</a> Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).</li>
<li>Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+improves+myeloid+dendritic+cell-mediated+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity.</a> Nat. Med. 9, 562-567 (2003).</li>
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<li>Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-expressed+B7-H1+and+B7-DC+in+relation+to+PD-1%2B+T-cell+infiltration+and+survival+of+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma.</a> Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).</li>
<li>Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+%28B7-H1%29+expression+by+urothelial+carcinoma+of+the+bladder+and+BCG-induced+granulomata%3A+associations+with+localized+stage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression.</a> Cancer. 109, 1499-1505 (2007).</li>
<li>Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).</li>
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</ol>

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cryosections에서 B7-H1의 Immunohistochemical 착색은 암 3,4의 다양한 사전 연구에서보고되었습니다. 그러나, 임상 종양 샘플을 일반적으로 파라핀 - 임베디드 블록의 형태로 사용할 수 있습니다. 5H1 단클론 항체는 최근 성공적으로 신장 세포 암종, 자궁 경부 암, 방광 암, 흑색 증 13-18 등의 파라핀 포함 된 종양 조직의 착색에 적용되었습니다. 파라핀 - 임베디드 9,19 또는 그라 이오 스탯 다른 단클론 항체와 췌장 선암의 조직의 20 섹션에서 B7-H1의 얼룩도보고되었습니다. 여기, 우리는 B7-H1에 5H1 단클론 항체와 파라핀 - 임베디드 췌장 선암의 조직을 성공적으로 착색을 보여 주었다. 췌장 선암의 B7-H1의 표현은 흑색 증 4,21 등 malignancies의 많은 다른 유형의 것과 유사 이기종입니다. B7-H1 AR의 막과 세포질 모두 표현e는 선암 세포 (그림 1...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> CSA 시스템 </td><td> Dako </td><td> K1500 </td><td> 퍼 옥시 데이즈 블록, streptavidin-비오틴 단지, 증폭 시약, streptavidin-HRP 및 DAB 기판과 chromogen 다음 프로토콜에 언급 된 시약을 포함 </td></tr><tr><td> 아비딘 / 비오틴 차단 키트 </td><td> 벡터 </td><td> SP-2001 </td><td></td></tr><tr><td> 차단 ACE </td><td> Serotec </td><td> BUF029 </td><td></td></tr><tr><td> 비오틴 안티 - 마우스 IgG1 </td><td> BD </td><td> 553441 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 IgG1 K Isotype 제어 </td><td> eBioscience </td><td> 14-4714-85 </td><td></td></tr><tr><td> 10X TBS (생리 트리스 버퍼) </td><td> Cellgro </td><td> 46-012-CM </td><td> 10xTBS 80 G / L NaCl 및 24.2 g / L Tirs을 포함, 세차를위한 ddH2O와 1X로 희석; </td></tr><tr><td> 십대 초반 20 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P1379 </td><td> 한 ML은 TBST를 만들기 위해 1X TBS의 1 L에 추가 </td></tr><tr><td> 대상 검색, 20x </td><td> Celerus 웨이브 </td><td> 014-3000-000 </td><td> ddH 2 O로 1 회에 희석 </td></tr><tr><td> 190 증명 에틸 알코올 </td><td> Pharmco - Aaper </td><td> 111000190 </td><td></td></tr><tr><td> 200 증명 에틸 알코올 </td><td> Pharmo - Aaper </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> 크실렌 </td><td> VWR </td><td> 95057-827 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> 리차드 - 앨런 과학 </td><td> 72,804 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> 리차드 - 앨런 과학 </td><td> 8310-4 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> 코닝 </td><td> 2940-245 </td><td></td></tr><tr><td> 습도 챔버 </td><td> 시그마 </td><td> H6644 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 시약 및 장비. </td></tr></tbody></table>

췌장 선암 조직의에서 b7-h1의 immunohistochemical 착색 (pd-l1) 파라핀은 - 임베디드 슬라이드

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, 면역 규제 세포 표면 단백질의 B7 가족의 일원은 (PD 프로그래밍 사망-1, 그 수용체와의 상호 작용을 통해 세포 매개 면역 반응의 부정적인 규제에 중요한 역할을 -1) 1,2. 종양 세포의 B7-H1의 Overexpression는 흑색 증, glioblastoma, 그리고 폐, 유방, 대장, 난소 및 신장 세포의 carcinomas을 포함 인간 암의 숫자에 기록되었으며, 항 종양 저해하는 표시되었습니다 T를 세포 면역 3-8. 최근 췌장 선암의 조직에 의해 B7-H1 표현은 잠재적 인 전조 마커 9,10로 확인되었습니다. 또한 췌장암의 마우스 모델에서 B7-H1의 봉쇄는 안티 종양 응답 11 생산 보여왔다. 이러한 데이터는 잠재적 인 치료 목표로 B7-H1의 중요성을 권장합니다. 안티 - B7-H1의 봉쇄 항체 따라서 mul에 대한 임상 실험에서 테스트되고 있습니다흑색 증과 폐, 대장, 신장, 위장, 췌장 (12)의 암을 포함 tiple 인간의 고체 종양. 결국 치료를 타겟으로 B7-H1의 혜택을받을 환자를 식별 할 수 있도록 위해서는 표현과 B7-H1과 B7-H1의 봉쇄 항체 치료에 대한 환자 반응의 국산화 사이의 상관 관계를 조사하는 것이 중요합니다. immunohistochemistry를 통해 인간의 췌장 선암의 조직에서 B7-H1의 표현을 조사하면이 공동 억제 신호 분자가 종양의 microenvironment에 antitumor 면역의 억제에 기여하는 방법에 대한 이해를 제공 할 것입니다. 첸과 동료에 의해 ​​개발 된 안티 - B7-H1 단클론 항체 (클론 5H1)가 인간의 neoplastic 조직 4,8의 여러 유형의 cryosections에서 신뢰할 수있는 염색 결과를 생산하기 위해 표시하지만, 파라핀 - 임베디드 슬라이드에 얼룩되었습니다 것은 때까지 도전이었다 최근 13-18. 우리는 개발자가췌장 선암의 조직의 파라핀 - 임베디드 슬라이드에 대한 사랑의 도피를 떠났을 B7-H1의 착색 프로토콜. 여기에 설명 된 B7-H1의 착색 프로토콜은 약간의 배경 B7-H1의 일관성 막과 세포질 염색을 생산하고 있습니다.

B7-H1의 성공적인 immunohistochemical 얼룩은 췌장 선암의 B7-H1 (갈색 신호 DAB 색상 개발)의 이기종 표현을 보여줍니다. 다른 B7-H1 또는 B7-H1 (도 2 및도 3)의 작은 표현 중 하나 주로 세포질 표현을 할 수 있지만 일부 췌장 선암 세포는 B7-H1의 주로 막 표현 (그림 1A)를 갖추고 있습니다. 일반 췌장 덕트 상피는 (그림 4) B7-H1 약간을 표현한다. 마우스 IgG1 κ isotype 제어 항체와 얼룩 대신 반 B7-H1 항체의 것은 약간의 배경 착색 (그림 1B)를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/4059/4059fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. 반 B7-H1과 A. Immunohisto...

B7-H1 (PD-L1) 및 PD-1의 바인딩은 종양의 microenvironment의 주요 종양 유발 면역 신호를 제공합니다. 표현과 췌장 선암의 B7-H1의 국산화를 특성화 할 수 immunohistochemical 얼룩 기법이 여기에 설명되어 있습니다.

췌장 선암 조직의에서 B7-H1의 Immunohistochemical 착색 (PD-L1) 파라핀은 - 임베디드 슬라이드

면역 조절 세포 표면 단백질인 B7 가족의 구성원인 B7-H1/PD-L1은 세포 매개 면역의 부정적 조절에서 중요한 역할을 합니다.

본 절차의 전반적인 목표는 면역조직화학 염색 기법을 사용하여 인간 췌장선암 조직의 파라핀 절편에서 B seven H one PD L one의 발현을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 슬라이스 된 조직 절편에서 파라핀을 제거하고 재수화함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 항원 회복으로, 압력솥을 사용하여 조직을 염색하는 과정이 포함됩니다.항체 염색 과정 후 신호 증폭 및 DAB 발색 단계가 이어집니다. 마지막 단계는 조직을 탈수하고 마운팅하는 것입니다. 모든 과정이 완료되면.현미경 관찰 및 이미지 분석을 통해 막성 및 세포질의 B7-H1을 시각화할 수 있습니다. 이는 종양 미세환경에서 B7-H1/BTL1이 항종양 면역 억제에 어떻게 기여하는지에 대한 더 나은 이해를 제공함으로써, 췌장 내분비암 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 동결 절편 염색과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 더 쉽게 구할 수 있고 보관이 용이한 파라핀 매립 조직 절편 사용에 최적화되었다는 점입니다.파라핀을 먼저 제거하지 않으면 슬라이드에서 신뢰할 수 있는 항체 염색이 불가능합니다. 따라서 파라핀에 매립된 조직이 있는 슬라이드를 준비하려면, 먼저 슬라이드를 55 °C에서 20분 동안 가열하십시오. 다음으로, 화학 흄 후드 내에서 7단계의 화학 세척조를 사용하여 파라핀을 제거하는데, 먼저 슬라이드를 xylene에 10분 동안 담그십시오.다음으로, 슬라이드를 두 번째 새 자일렌 수조에 10분 동안 담급니다. 세 번째로, 슬라이드를 100% ethanol에 5분 동안 담급니다. 네 번째로, 다시 한번 슬라이드를 새 100% ethanol에 5분 동안 담급니다.다섯째로, 슬라이드를 95% ethanol에 5분 동안 담급니다. 여섯째로, 슬라이드를 80% ethanol에 5분 동안 담급니다. 마지막으로, 탈이온수로 슬라이드를 5분 동안 깨끗이 세척합니다.파라핀을 제거한 후, 다음으로 항원을 노출시켜야 합니다. 먼저, 슬라이드를 Tris EDTA 완충액에 담급니다. 그런 다음, 2단계 프로그램을 설정한 압력솥에서 슬라이드를 가열합니다.먼저, 125 °C에서 30초 동안 가열합니다. 두 번째로, 90 °C에서 10초 동안 가열합니다. 그 다음 슬라이드를 그대로 두어 실온까지 식힙니다.슬라이드를 한 시간 동안 식힌 후, TBST로 2회 세척하며 각 세척 단계마다 5분씩 유지합니다. 이제 각 슬라이드를 염색할 수 있습니다. 먼저 조직 주변의 TBST 용액을 흡수시켜 건조시킨 다음, 소수성 펜을 사용하여 조직 주변에 원을 그려 표시합니다.이 절차 전반에 걸쳐, 슬라이드를 습윤 챔버에 보관하여 조직이 마르는 것을 방지하십시오. 세척액에 담그지 않을 때는 슬라이드의 소수성 원 안에 peroxidase block을 한 방울 떨어뜨리십시오. 5분 동안 기다린 후 TBST로 peroxidase를 씻어내십시오.그 다음 슬라이드를 TBST에 5분 동안 담가 둡니다. 슬라이드를 용액에서 꺼내어 과잉의 TBST를 부드럽게 털어냅니다. 이제 각 슬라이드에 CE 블로킹 버퍼를 한 방울씩 떨어뜨리고 상온에서 15분 동안 배양합니다.슬라이드를 헹구고 TBST에 5분간 담가 세척합니다. 다음으로 각 슬라이드에 Vidan 용액을 한 방울씩 떨어뜨리고 15분 동안 기다립니다. 동일한 TBST 헹굼 및 침전 과정으로 AVADON을 제거합니다.이제 비오틴을 처리합니다. 5분 동안 기다린 후 TBST로 슬라이드를 다시 세척합니다. 이제 마우스 단클론 항체 희석액 또는 대조 항체와 함께 슬라이드를 배양합니다.TBST 내에서 두 항체 중 하나가 4°C에서 22시간 동안 결합하도록 둡니다. 다음 날, 이전과 동일하게 슬라이드를 TBST로 3회 세척합니다. 각 세척 단계는 TBST 린스와 5분간의 침전 세척을 포함합니다.1차 항체를 세척하는 동안 이 3회 세척 과정을 여러 번 반복합니다. STR titin Bio ITIN 복합체 용액을 준비합니다. 이 용액은 사용하기 최소 30분 전에 준비되어야 합니다.이제 슬라이드를 염소 혈청 용액에 희석된 biotin 결합 goat anti-US 2차 항체와 함께 30분 동안 인큐베이션합니다. 인큐베이션하는 동안 DACO 키트 지침에 따라 DAB substrate CHROMOGEN 용액을 준비하십시오. 이 용액은 4°C의 암소에서 최대 8시간 동안 보관할 수 있습니다.배양 후, TBST로 3회 세척합니다. 다음으로 strippin biotin complex를 한 방울씩 떨어뜨립니다. 각 슬라이드를 15분 동안 배양한 후, TBST로 3회 세척합니다.다음으로, 각 슬라이드에 증폭 시약 한 방울을 도포합니다. 4분 동안 대기한 후 TBST로 슬라이드를 3회 세척합니다. 증폭 시약을 세척한 후, 각 슬라이드에 streptavidin HRP 한 방울을 첨가하고 15분 동안 배양합니다.다음 단계를 진행하기 전, TBST로 세 번 더 세척합니다. 이제 실험 과정 중 가장 민감한 단계입니다. 슬라이드에 과산화수소 기질이 포함된 DAB substrate CHROMOGEN 한 방울을 떨어뜨리고, DAB substrate의 색상 발현을 관찰하기 시작합니다.발색제(CHROMOGEN) 반응 시간은 보통 2분이지만, 최적의 염색 상태를 보장하기 위해 일반적으로 현미경으로 반응 과정을 모니터링합니다. 각 염색 단계에서 배경 염색을 최소화하며, 이전 배치에서 가져온 슬라이드 한 장과 편도 슬라이드 한 장을 양성 대조군으로 포함합니다. 완료되면 TBST가 아닌 물로 슬라이드를 즉시 세척하십시오.슬라이드에 헤마틴 한 방울을 떨어뜨리고 90초 동안 배양합니다. 즉시 증류 탈이온수로 슬라이드를 세척한 다음, 비눗물을 섞은 수돗물로 세척하고 다시 DD water로 세척합니다. 이것으로 염색 과정이 완료됩니다.모든 슬라이드의 염색이 완료되면, 마운팅 하기 전에 에탄올 시리즈를 사용하여 슬라이드를 탈수합니다. 첫째, 슬라이드를 80% ethanol에 3분 동안 담급니다. 둘째, 슬라이드를 95% ethanol에 3분 동안 담급니다.세 번째와 네 번째 세척 단계에서는 슬라이드를 100% ethanol에 5분 동안 담급니다. 다섯 번째와 여섯 번째 단계에서는 슬라이드를 xylene에 5분 동안 담급니다. 마지막으로, 각 슬라이드에 per 한 방울을 떨어뜨리고 커버 슬립을 조심스럽게 덮습니다.이제 슬라이드는 B7-H1에 대한 면역조직화학 염색 현미경 관찰 준비가 완료되었습니다. 췌장선암에서 B7-H1의 불균일한 발현이 확인되었으며, 이는 DAB 발색을 통해 갈색으로 나타납니다. 일부 췌장선암 세포는 주로 세포막에서 B7-H1이 발현되는 반면, 다른 세포들은 주로 세포질에서 발현되거나 거의 발현되지 않습니다. 정상 췌관 상피에서는 B7-H1 염색이 거의 나타나지 않았습니다. anti-B7-H1 항체 대신 mouse IgG1 kappa isotype 대조 항체를 사용하여 염색했을 때 배경 염색이 거의 관찰되지 않았습니다. 이 기술을 숙달하면, 22시간의 하룻밤 배양을 포함하여 이틀에 걸쳐 총 7시간 이내에 수행할 수 있으며, 발색 과정이 적절히 이루어져야 합니다.이 기술은 종양학 분야의 연구자들이 다른 악성 종양에서 B7-H1/PD-L1 신호 전달 체계를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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