일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

이 실험 절차의 전반적인 목표는 미세아교세포(microglia) 내의 micro RNA 발현을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 뇌와 척수를 적출한 후, 중추신경계(CNS) 조직을 균질화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 Percoll 밀도 구배 원심분리를 통해 CNS로부터 단핵세포를 분리하고, 이후 FACS를 사용하여 미세아교세포 집단을 식별합니다.

다음으로, 미세아교세포의 RNA를 분리하고 시료의 품질을 분석합니다. 마지막으로, 관심 있는 특정 마이크로 RNA에 대한 실시간 PCR을 수행합니다. 최종적으로, 델타 델타 CT 방법을 사용하여 미세아교세포 내 특정 마이크로 RNA의 상대적 발현 수준을 나타낼 수 있습니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 CNS에서 충분한 수의 단핵 세포를 분리하지 못하거나, 시료가 수초 및 세포 파편으로 인해 오염되어 어려움을 겪게 됩니다. 두 경우 모두 준비물의 품질 저하로 이어지며, 각각 RNA 농도가 낮아지거나 단백질 오염이 발생하게 됩니다. 본 절차의 시연은 저와 vir가 진행하겠습니다.

모든 마우스의 관류 후, 뇌와 척수를 적출합니다. 그다음 뇌 하나와 척수 하나를 한 번에 15 mL Dounce homogenizer에 넣고, 매회 조직에 5 mL PBS를 추가합니다. 10~20회 부드럽게 갈아준 후, 균질물을 70 µm 세포 여과기(cell strainer)를 통해 개별 50 mL 원뿔형 튜브에 옮기고, 834 ×g, 4 °C에서 5~7분 동안 원심분리합니다.

상층액을 제거한 후, 2~3마리 생쥐의 뇌 및 척수 균질액을 5~7 mL의 70% Percoll에 현탁합니다. 그 후 40% Percoll 7 mL를 위에 층분리하여 얹고, Percoll 및 세포 용액을 20 °C에서 850 ×g로 30분 동안 브레이크 없이 원심분리합니다. 70% Percoll 층 상단에 위치한 손상된 세포, 마이엘린 및 파편을 제거합니다.

그런 다음 70%와 40% Percoll 용액 사이의 계면에 있는 단핵구를 수집하고, 수집한 세포를 PBS로 최소 1:1 비율로 희석합니다. 세포를 원심 분리하여 가라앉힌 후, 펠릿을 0.5 mL의 PBS로 재부유시켜 1.7 mL 마이크로 튜브로 옮깁니다. 밀도 구배로 분류된 세포 50 µL를 새 1.7 mL 마이크로 튜브로 옮긴 다음, 해당 튜브에 FACS 버퍼 350 µL를 추가합니다.

그 후 튜브에 5~10 µL의 anti FCR 항체를 첨가하고, 세포를 얼음 위에서 10~15분 동안 배양합니다. 세포 샘플을 두 개의 에펜도르프 튜브로 나누고, 한 개의 튜브에 1 µL의 anti CD 11 B와 2 µL의 anti CD 45 항체를 첨가합니다.

세포를 얼음 위에서 10~15분 더 배양합니다. 두 번째 튜브에 음성 대조군이라고 표시하고 얼음 위에 둡니다. 염색 항체와 함께 배양한 후, 두 튜브 모두에 fax buffer 1 mL를 추가하고 마이크로 원심분리기를 사용하여 1200×g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.

G. 다음으로, PBS에 희석된 1% paraformaldehyde 400 µL로 펠렛을 고정하고, 튜브를 볼텍싱하여 응집을 방지합니다. 마지막으로, 음성 대조군 세포 샘플과 BD com beads를 사용하여 유세포 분석기로 세포를 분석합니다. EAE를 유도하기 위해 8~12주령의 C 57 black six 마우스 5~10마리 그룹에 complete frons adjuvant 4 mg/mL에 희석된 MOG 35-55 펩타이드 150 mg을 피하 면역합니다. 그 후, 면역 0일째와 2일째에 백일해 독소를 복강 내 투여합니다.

앞서 보여드린 대로 세포를 분리하고 염색한 후, 소팅 직전에 고정액 대신 400 µL의 PBS에 펠릿을 현탁합니다. 그런 다음 샘플 수집을 위해 10% FBS가 첨가된 PBS 300 µL를 1.7 mL 에펜도르프 튜브 두 개에 채웁니다. 마지막으로, 이 대표 밀도 도표에 표시된 게이팅 전략을 사용하여 미세아교세포와 대식세포 집단을 고순도로 소팅합니다.

분리 후, 분리된 세포 샘플의 순도를 결정하기 위해 미세아교세포(microglia)와 대식세포(macrophage) 집단을 재분석합니다. 마이크로 원심분리기를 사용하여 분리된 세포 집단을 1200 ×g에서 5~7분 동안 원심분리한 후, 상층액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿을 드라이아이스 위에서 급속 냉동합니다. 그다음, 냉동된 세포 펠릿을 일반 얼음으로 옮깁니다.

해동을 위해 Nirvana 키트의 용해 버퍼 300 µL를 첨가한 다음, 피펫팅을 5~7회 하여 세포 용액을 부드럽게 혼합합니다. 그다음 균질화 첨가제 30 µL를 넣고, 세포 현탁액을 30초 동안 볼텍싱한 후 튜브를 얼음 위에 10분간 둡니다. 이제 산성 페놀-클로로포름 300 µL를 첨가하고 튜브를 30초 더 볼텍싱합니다.

그 후 9,500 ×g에서 5분 동안 세포를 원심분리한 다음, 수성 상(aqueous phase)을 포함하는 상층액 300 µL를 조심스럽게 새로운 1.7 mL 에펜도르프 튜브로 옮깁니다. 이 용액을 100% 에탄올 375 µL와 혼합합니다. 튜브의 전체 내용을 Nirvana 키트의 필터 카트리지로 옮기고 9,500 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 그다음, 통과액(flow through buffer)을 버립니다.

카트리지를 세척한 후, Nirvana 키트의 wash solution one 700 µL를 넣고 9,500 ×g에서 1분 동안 더 원심분리합니다. Nirvana 키트의 wash solution two 500 µL를 사용하여 이 과정을 두 번 더 반복합니다. 예열된 nuclease free water 60 µL를 사용하여 카트리지에서 RNA를 용출합니다.

마지막으로, 미세아교세포 및 대식세포 샘플 내의 micro RNA를 검출하기 위해 realtime Q-R-T-P-C-R을 수행한 후, NanoDrop 분광광도계를 사용하여 RNA의 순도와 양을 평가합니다. 형광 표지된 mere 1 24 및 snow RNA 55 PCR 생성물에 대한 P-R-T-P-C-R 곡선은 첫 번째 그래프에 표시된 것과 같이 생성할 수 있습니다. 미세아교세포 또는 골수 유래 대식세포에서 분리한 대조군 snow RNA 55 RNA 샘플에 대해, PCR 사이클 수에 따른 형광 표지된 특정 PCR 생성물 양의 전형적인 곡선이 나타나 있습니다.

서로 다른 세포군에서 추출한 snow RNA 55 발현 분석을 위한 CT 값이 그래프의 녹색 및 청색 수직선으로 표시된 바와 같이, Q-R-T-P-C-R 곡선의 선형 범위 하단과 기저선의 교점에서 어떻게 결정되는지 확인하십시오. 이 두 번째 그래프에서는 마이크로글리아 또는 골수 유래 대식세포에서 얻은 실험군 mere 1 24 RNA 샘플의 형광 표지된 특정 PCR 생성물 양을 PCR 사이클 수와 비교하여 보여줍니다. 서로 다른 세포군에서 mere 1 24 발현 분석을 위한 CT 값이 다시 한번 그래프의 녹색 및 청색 수직선으로 표시된 바와 같이 Q-R-T-P-C-R 곡선의 선형 범위 하단과 기저선의 교점에서 어떻게 결정되는지 확인하십시오.

이 표에 제시된 정상 및 EAE 마우스의 미세아교세포(microglia)와 골수 유래 대식세포(BM dms) 내 snow RNA 55 및 mere 1 24 발현의 CT 값과 같이 각 샘플의 CT 값을 결정한 후, 각 샘플의 중복 측정치에 대한 delta CT 값을 계산하기 위해 실험군 mere 1 24 샘플의 CT 값에서 대조군 snow RNA 55 샘플의 CT 값을 뺍니다. 그런 다음 다른 샘플의 delta CT 값에서 참조 샘플의 delta CT 값을 빼어 delta delta CT 값을 계산합니다. 마지막으로, 이 밀도 도표(density plot)에서 보는 바와 같이 각 샘플의 상대적 발현 수준은 2^(-delta delta CT)로 계산합니다.

정상 CNS에서 미세아교세포(microglia)가 잘 분리된 경우, 세포의 95~98%는 CD 11 B 양성 CD 45 low 미세아교세포이며, 세포 현탁액의 2~5%는 CD 11 B 양성 CD 45 high 혈관주위 대식세포(perivascular macrophages)로 구성되고, CD 11 B 음성 CD 45 high 림프구 또는 CD 11 B 음성 CD 45 음성 성상교세포(astroglia)나 희소돌기아교세포(oligodendroglial cells) 또는 세포 파편은 1% 미만으로 존재합니다. 반면, 분리 상태가 좋지 않은 준비물에서는 CD 11 B 음성 CD 45 음성 세포나 성상교세포 또는 수초 입자와 같은 세포 파편의 상당한 오염이 발생하여 RNA 분리 및 추가 분석에 부적합하게 됩니다. 또한, 불충분한 관류로 인해 혈액 림프구가 오염되었음을 나타내는 CD 11 B 음성 CD 45 high 세포가 존재할 수도 있습니다. 이 밀도 도표(density plot)에서는 신경염증 동안 CNS에 존재하는 세 가지 세포 집단인 CD 11 B 양성 CD 45 low 미세아교세포, CD 11 B 양성 CD 45 high 대식세포 및 CD 11 B 음성 CD 45 high 림프구가 표시되어 있습니다.

양호한 분리와 불량한 분리 이후 겔 전기영동으로 결정된 RNA의 품질이 나타나 있습니다. RNA가 깨끗하게 분리되었을 때는 RNA 래더와 리보솜 RNA가 뚜렷하게 보이며, 분리 과정이 제대로 이루어지지 않았을 때는 스미어 현상과 저분자량 분해 산물이 나타납니다. 이 최종 데이터는 정상 성체 미세아교세포, EAE 마우스의 미세아교세포 및 발달 초기 단계의 마우스에서 분리한 미세아교세포에서 mere 1 24의 발현을 보여줍니다.

첫 번째 막대 그래프에서, 정상 CNS 유래 미세아교세포의 mere 1 24 상대적 발현량은 골수 유래 대식세포에서 관찰된 것보다 훨씬 높습니다. 마찬가지로, EAE 마우스의 CNS 유래 대식세포에서 mere 1 24 RNA가 증가했지만, 미세아교세포는 여전히 5배 더 많은 양의 mere 1 24 RNA를 발현합니다. 마지막 막대 그래프는 이 실험 방법을 통해 성체인 8주령 마우스와 비교하여 1주, 2주 및 4주령 마우스의 발달 과정 중 미세아교세포 내 mere 1 24 발현 수준의 변화를 어떻게 평가할 수 있는지 보여줍니다.

전체 실험의 좋은 결과를 보장하기 위해서는 충분한 양의 고품질 분리 세포를 확보하는 것이 중요하다는 점을 기억해야 합니다.