일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

이 절차의 전반적인 목표는 미세아교세포(microglia) 내의 마이크로 RNA 발현을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 뇌와 척수를 적출한 다음, 중추신경계 또는 CNS 조직을 균질화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 Percoll 밀도 구배 원심분리를 통해 CNS의 단핵세포를 분리하고, 이후 FACS를 이용하여 미세아교세포 군집을 식별합니다.

다음으로, 미세아교세포 RNA를 분리하고 샘플의 품질을 분석합니다. 마지막으로, 관심 대상인 특정 micro RNA에 대한 실시간 PCR을 수행합니다. 결과적으로, delta delta CT 방법을 사용하여 미세아교세포 내 특정 micro RNA의 상대적 발현 수준을 나타낼 수 있습니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 중추신경계(CNS)에서 충분한 수의 단핵구를 분리하지 못하거나, 샘플이 수초 및 세포 파편으로 오염되어 어려움을 겪습니다. 두 경우 모두 시료 준비의 품질 저하를 초래하며, 각각 RNA 농도가 낮아지거나 단백질 오염이 발생하는 결과로 이어집니다. 본 절차의 시연은 저와 vir가 진행하겠습니다.

모든 마우스의 관류가 끝나면 뇌와 척수를 적출하십시오. 그다음 뇌 하나와 척수 하나를 한 번에 15 mL 다운스 균질기(downs homogenizer)에 넣고, 매번 조직에 5 mL의 PBS를 추가하십시오. 10~20회 정도 부드럽게 분쇄한 후, 균질물을 70 µm 세포 스트레이너를 통해 각각의 50 mL 원추형 튜브에 통과시키고, 834 ×g, 4 °C에서 5~7분 동안 원심분리하십시오.

상층액을 제거한 후, 마우스 2~3마리에서 얻은 뇌 및 척수 균질액을 70% percoll 5~7 mL에 다시 현탁합니다. 그다음 40% percoll 7 mL를 위에 층성히 얹고, percoll 및 세포 용액을 20 °C에서 850 ×g로 30분 동안 브레이크 없이 원심분리합니다. 70% percoll 층 상단에 위치한 손상된 세포와 마이엘린 및 파편을 제거합니다.

그 후 70%와 40% Percoll 용액 사이의 계면에 있는 단핵 세포를 수집하고, 수집된 세포를 PBS에 최소 1:1 비율로 희석합니다. 세포를 원심 분리하여 가라앉힌 후, 펠렛을 0.5 mL의 PBS로 재부유시켜 1.7 mL 에펜도르프 튜브에 옮깁니다. 밀도 구배로 분류된 세포 50 µL를 새로운 1.7 mL 에펜도르프 튜브에 옮긴 다음, 해당 튜브에 FACS 버퍼 350 µL를 첨가하는 것으로 시작합니다.

그 후 튜브에 anti FCR 항체 5~10 µL를 첨가하고, 세포를 얼음 위에서 10~15분 동안 배양합니다. 세포 샘플을 두 개의 einor 튜브로 나누어, 한 개의 튜브에 anti CD 11 B 1 µL와 anti CD 45 항체 2 µL를 첨가합니다.

세포를 얼음 위에서 10분에서 15분 동안 더 배양합니다. 두 번째 튜브에 음성 대조군이라고 표시하고 얼음 위에 둡니다. 염색 항체와 함께 배양한 후, 두 튜브 모두에 fax 버퍼 1 mL를 첨가하고 마이크로 원심분리기를 사용하여 1200 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 가라앉힙니다.

G.그 다음 1% para formaldehyde가 포함된 PBS 400 µL로 펠릿을 고정하고, 튜브를 볼텍싱하여 뭉침을 방지합니다. 마지막으로, 음성 대조군 세포 샘플과 BD com beads를 사용하여 유세포 분석기로 세포를 분석합니다. EAE를 유도하기 위해 8~12주령의 C 57 black six 마우스 5~10마리 그룹에 4 mg/mL의 complete frons adjuvant에 희석된 150 mg의 MOG 35 to 55 펩타이드를 피하 면역합니다. 그 후, 면역 0일째와 2일째에 백일해 독소를 복강 내 투여합니다.

앞서 보여드린 것과 같이 세포를 분리하고 염색한 후, 소팅 직전에 펠렛을 고정액 대신 400 µL의 PBS에 부유시킵니다. 그런 다음, 샘플 수집을 위해 10% FBS가 첨가된 PBS 300 µL를 1.7 mL 에펜도르프 튜브 두 개에 채웁니다. 마지막으로, 이 대표 밀도 도표에 예시된 게이팅 전략을 사용하여 미세아교세포와 대식세포 군집을 고순도로 소팅합니다.

분리 후, 미세아교세포(microglia) 및 대식세포(macrophage) 집단을 재분석하여 분리된 세포 샘플의 순도를 결정합니다. 마이크로 원심분리기를 사용하여 분리된 세포 집단을 1200 ×g에서 5~7분 동안 원심분리한 후, 상층액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿을 드라이아이스에 얼립니다. 그다음, 얼린 세포 펠릿을 일반 얼음으로 옮깁니다.

해동을 위해 Nirvana 키트의 용해 버퍼 300 µL를 추가한 다음, 피펫팅을 5~7회 실시하여 세포 용액을 부드럽게 혼합합니다. 그다음 균질화 첨가제 30 µL를 추가하고, 세포 현탁액을 30초 동안 볼텍싱한 후 튜브를 얼음 위에 10분 동안 둡니다. 이제 산성 페놀-클로로포름 300 µL를 추가하고 튜브를 30초 더 볼텍싱합니다.

그 후 세포를 9,500 ×g에서 5분 동안 원심 분리한 다음, 수성 상이 포함된 상층액의 상위 300 µL를 조심스럽게 새로운 1.7 mL 에펜도르프 튜브로 옮깁니다. 이 용액을 100% ethanol 375 µL와 혼합합니다. 튜브의 전체 내용물을 Nirvana 키트의 필터 카트리지로 옮기고 카트리지를 9,500 ×g에서 1분 동안 원심 분리합니다. 그다음, 통과액 버퍼를 제거합니다.

카트리지를 세척한 후, Nirvana 키트의 세척 용액 1(wash solution one) 700 µL를 첨가하고 9,500 ×g에서 1분 동안 더 원심 분리합니다. Nirvana 키트의 세척 용액 2(wash solution two) 500 µL를 사용하여 이 과정을 두 번 더 반복합니다. 예열된 nuclease free water 60 µL를 사용하여 카트리지에서 RNA를 용출합니다.

마지막으로, 미세아교세포 및 대식세포 샘플 내 micro RNA를 검출하기 위해 realtime Q-R-T-P-C-R을 수행한 후, NanoDrop 분광광도계를 사용하여 RNA의 순도와 양을 평가합니다. 형광 표지된 mere 1 24 및 snow RNA 55 PCR 생성물에 대한 P-R-T-P-C-R 곡선은 첫 번째 그래프에 표시된 것과 같이 생성할 수 있습니다. 미세아교세포 또는 골수 유래 대식세포에서 분리한 대조군 snow RNA 55 RNA 샘플의 형광 표지된 특정 PCR 생성물 양을 PCR 사이클 횟수와 비교하여 나타낸 전형적인 곡선이 표시되어 있습니다.

서로 다른 세포군에서 유래한 snow RNA 55 발현 분석을 위한 CT 값이 그래프의 녹색 및 청색 수직선으로 표시된 것처럼, Q-R-T-P-C-R 곡선의 선형 범위 하단과 베이스라인이 교차하는 지점에서 어떻게 결정되는지 확인하십시오. 이 두 번째 그래프에서는 미세아교세포 또는 골수 유래 대식세포에서 얻은 실험적 mere 1 24 RNA 샘플의 형광 표지 특이적 PCR 생성물 양을 PCR 사이클 횟수와 비교하여 보여줍니다. 서로 다른 세포군에서 유래한 mere 1 24 발현 분석을 위한 CT 값 또한 그래프의 녹색 및 청색 수직선으로 표시된 것처럼, Q-R-T-P-C-R 곡선의 선형 범위 하단과 베이스라인이 교차하는 지점에서 다시 한번 결정되는지 확인하십시오.

이 표에 제시된 정상 및 EAE 마우스의 미세아교세포(microglia)와 골수 유래 대식세포(BM dm) 내 snow RNA 55 및 mere 1 24 발현과 같이 각 샘플의 CT 값을 결정한 후, 각 샘플의 중복 측정값(duplicate)에 대한 delta CT 값을 계산하기 위해 실험군 mere 1 24 샘플의 CT 값에서 대조군 snow RNA 55 샘플의 CT 값을 뺍니다. 그런 다음 다른 샘플들의 delta CT 값에서 기준 샘플의 delta CT 값을 빼서 delta delta CT 값을 계산합니다. 마지막으로, 이 밀도 도표(density plot)에 나타난 바와 같이 각 샘플의 상대적 발현 수준은 2의 마이너스 delta delta CT 제곱으로 계산합니다.

정상 CNS에서 미세아교세포가 잘 분리된 경우, 세포의 95~98%는 CD 11 B 양성 CD 45 low 미세아교세포이며, 세포 현탁액의 2~5%는 CD 11 B 양성 CD 45 high 혈관주위 대식세포로 구성됩니다. CD 11 B 음성 CD 45 high 림프구 또는 CD 11 B 음성 CD 45 음성 성상교세포, 희소돌기아교세포 또는 세포 파편은 1% 미만으로 존재합니다. 반면, 상태가 좋지 않은 표본의 경우, 성상교세포나 마이엘린 입자와 같은 CD 11 B 음성 CD 45 음성 세포 또는 세포 파편의 상당한 오염이 발생하여 RNA 분리 및 추가 분석에 부적합합니다. 또한, 불충분한 관류로 인해 혈액 림프구가 오염되었음을 나타내는 CD 11 B 음성 CD 45 high 세포가 나타날 수도 있습니다. 본 밀도 도표(density plot)에서는 신경염증 동안 CNS에 존재하는 세 가지 세포 집단인 CD 11 B 양성 CD 45 low 미세아교세포, CD 11 B 양성 CD 45 high 대식세포, 그리고 CD 11 B 음성 CD 45 high 림프구가 표시되어 있습니다.

적절한 분리 과정과 부적절한 분리 과정 후 젤 전기영동으로 확인한 RNA의 품질을 보여줍니다. RNA가 깨끗하게 분리된 경우, RNA 래더와 리보솜 RNA가 뚜렷하게 나타나지만, 분리 과정이 제대로 수행되지 않은 경우에는 스미어 현상과 저분자량 분해 산물이 나타납니다. 이러한 최종 데이터는 정상 성체 미세아교세포, EAE 마우스의 미세아교세포, 그리고 발달 초기 단계의 마우스에서 분리한 미세아교세포에서의 mere 1 24 발현을 입증합니다.

첫 번째 막대 그래프에서, 정상 CNS 유래 미세아교세포의 mere 1 24 상대적 발현량은 골수 유래 대식세포에서 관찰된 것보다 훨씬 높습니다. 마찬가지로, EAE 마우스의 CNS 유래 대식세포에서 mere 1 24 RNA가 증가하기는 하지만, 미세아교세포는 여전히 5배 더 많은 양의 mere 1 24 RNA를 발현합니다. 마지막 막대 그래프는 이 방법을 사용하여 절차를 수행하는 동안 성체인 8주령 마우스와 비교하여 1주, 2주 및 4주령 마우스의 발달 과정 중 미세아교세포 내 mere 1 24 발현 수준의 변화를 어떻게 평가할 수 있는지를 보여줍니다.

전체 실험의 좋은 결과를 보장하기 위해서는 충분한 양의 고품질 분리 세포를 확보하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.