Name: Microfluidic 장치의 저렴한 제작에 대한 PDMS의 비 플라즈마 본딩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:41:54.000+00:00
Duration: 4 min 45 s
Description: 배우세요 PDMS와 유리 간 비플라즈마 가역 본딩 기법으로 신경 세포용 마이크로플루이딕 장치를 저렴하게 제작하는 방법을. 이 기술은 플라즈마 장비 없이도 방수 밀봉과 세포 배양이 가능합니다.

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신경 세포의 세포 배양에 대한 Microfluidic 장치를 준비 1) 클린 코닝 제일 24mm X 40mm 유리 슬라이드 <ul><li> 30 분 물 목욕 sonicator의 유리 슬라이드를 Sonicate </li><li> 70 % EtOH로 유리 슬라이드 린스 </li><li> 세차 DH 2 O로 세 번 슬라이드 </li><li> 선호 하루 몇 시간을위한 조직 문화 후드에 건조 슬라이드 </li></ul> 참고 : 우리는 슬라이드와 함께로드되는 특수 금속 쟁반 있습니다. 슬라이드는 개별적으로 구분이 금속 선반에 슬롯에 배치됩니다. 그러면 우리가 물 욕실 sonicator에 물, 장소 기입되는 유리 접시에서 이러한 금속 로딩 트레이를 배치하고, 30 분 sonicate 수 있습니다. 후속 세척이 접시에 실시하고 있습니다. 2) PDMS 장치를 준비 <ul><li> PDSM 캐스트 및 분기 안에있는 실리콘 웨이퍼에서 PDMS 금형을 잘라 펀치 구멍 </li><li> 먼저 전체 불활성 가스 (아르곤 또는 질소) 불어로 PDMS 장치를 청소하십시오. 그런 다음 남은 부스러기를 떠 3M 스카치 브랜드 471 테이프를 사용하여 </li></ul> 참고 : 장치까지 얼굴 유지하는 것이 중요합니다. 처음에는, 우리는 실리콘 웨이퍼에서 멀리 PDMS를자를 때, 웨이퍼와 접촉하는 측면이 깨끗한 측면입니다 그것은 microfluidic 채널을 포함하고 있습니다. 우리는 같은 장치를 손상하고, 우리가 플라즈마 결합에 대한 준비가 될 때까지 깨끗한 측면 얼굴을 유지하지 않을 수있는만큼 조심하십시오. <ul><li> 플라스틱 용기 압력솥 장치 </li><li> autoclaving, 깨끗한 제 1 코닝 유리 슬라이드와 Harrick 브랜드 플라즈마 클리너 사용 플라즈마 처리 장치 후 <a href="http://www.harrickplasma.com/" target="_blank">www.harrickplasma.com을</a> </li><li> 장치가 유리 슬라이드에 측면을 청소 플레이스. </li></ul> 이 장치는 이제 유리 슬라이드에 접착 플라즈마입니다. 3) 코팅 폴리 L - 라이신 (PLL)를 가진 장치 <ul><li> PLL은 장치의 양쪽에 잘 추가하고 다음 우물에를 통해 흐름을 허용 </li></ul> = 작은 우물에 대한 큰 우물 30 μ 리터 PLL에 대한 PLL의&gt; 150 μl. 그것은 한 우물 전체 있으므로 정확한 필요가 없습니다. 참고 : 장치에서 보면 당신은 4 우물을 볼 수 있습니다 : 각 두 연결됩니다. 당신은 잘 따라서는 다음 잘으로 장치를 통해 흐름을 것입니다 하나의 PLL을 데려가고 싶다는 거잖아요. <ul><li> PLL에 대해 10 분 동안 장치를 통해 흐름을 그리고 그들을 채우기 위해 우물에 더 많은 PLL 추가 허용 </li><li> (야간 바람직합니다) 4 시간 최소 37 ° C에서 배양기에서 PLL을 포함하고있는 장치를 배치 </li><li> 치료 후 여분의 PLL을 진공하지만, 장치의 밖으로 모든 액체를 빨아하지 않도록주의해야 </li></ul> 참고 : 채널 또는 챔버에 공기 방울을 소개하고 싶지 않아요. 그냥 우물에 과다한 PLL을 진공. <ul><li> 장치의 양쪽에 각각 잘하는 autoclaved DH 2 O를 추가하고, 모세관 작용에 의해 다른 잘하는 흐름 수 </li></ul> 그림 1은 microfluidic 장치의 다이어그램입니다. 블루 (소마 쪽)이 연결 방법은 공지 사항과 레드는 (Axonal 쪽) 연결됩니다. 우리가 장치의 양쪽에 잘 하나에서 PLL, 또는 물이나 미디어를 넣어 말할 때, 우리는 무슨 말인지 예를 들어,입니다 플레이스 autoclaved DH 중 하나를 블루 그럼 곳에서 150 μl의 autoclaved DH 2 O 150 UL 글쎄, 첫째 레드로 2 0. 물 (또는 PLL, 또는 미디어, 또는 전지) 다른 해당 잘 수있는 장치를 통해 흐름을 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/old/410_2008_8_27_3/410_Figure-01.png" alt="그림 1" width="362" height="216" /> 그림 1 참고 사항 : 지금부터 내가 말하는 &quot;TOP 우물에서 개최 미디어, 세포, 물 또는 PLL은&quot;내가 소마의 왼쪽에 될 어디에 위의 그림과 Axons 말하는거야, 참고하면로 성장할 것입니다 좋아. <ul><li> 물 (다시 신중하다고하는 것은 완전히 장치에서 모든 액체를 제거하지 않음)에서 대기음 후, 잘 연결되어있는 각각의 하나 autoclaved DH 2 O의 또 다른 150 μl를 추가하고 잘 대응까지 흐름 수 있습니다. </li><li> 37 인큐베이터에서 DH 2 O를 포함하는 장치를 ° C 1 시간 후 다시 세척 단계를 반복합니다. 총 있습니다 일시간 각각에 대해 DH 2 O와 장치를 세 번 씻으십시오. </li></ul> 참고 : PLL에서 borate는 전 연구소의 일부 제가 몇 이후 autoclaved DH 2 O와 하룻밤 장치를 잠복기 추천 PDMS에 흡수 수있는 가능성으로 인해nitial 빠른 rinses. 이것은 모두 무료 borate는 세포의 로딩하기 전에 PDMS 밖 리치 것을 보장합니다. 이것이 완료되지 않으면 세포 독성을 초래할 수 시간이 지남에 따라 미디어에 borate의 출시가있을 수 있습니다. <ul><li> 상단 우물에 필요한 요소 (glutamax, B27, PenStrep)과 신경 기저 미디어 (NBM)를 추가 </li></ul> 참고 : 장치 하룻밤과 그 다음날 전지와 도금 incubated, 또는 세포를 도금하기 전에 NMB + 요인 3 시간 최소 incubated 수 있습니다. 장치 속으로 로딩에 대한 뉴런 준비 우리는 어느 뇌 비​​트 또는 우리 캠퍼스에 여기서 준비라는 회사에서 구입되는 십팔일 오래된 태아 쥐의 피질을 사용합니다. 우리는 조직 신선한 얻을 것을 선호합니다. <ol><li> 최대 절전 E에 저장 한 태아의 두뇌 피질을 (조직 2 개) 구합니다 </li><li> 알코올 램프를 사용하여 세 긴 유리 pipettes를 타고 연속 작은 크기로 각각 그들을 불 </li><li> 멸균 15 ML 튜브에 NMB + 요인이 ML에 유리 피펫과 장소와 최대 절전 E에서 조직을 제거하십시오. </li><li> 분쇄 : 피질은 10-5 번 정도 아래로 통과하고있는 전구와 유리 피펫을 사용합니다. 그런 다음 작은 피펫은 조직을 아래로 피펫과하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 가장 작은 피펫은 조직을 아래로 피펫과하는 데 사용됩니다. 우리는 보이는 덩어리가 없는지 확인 것을 좋아합니다. 참고 : 최근 전 연구실 처음 50 % 0.125 %의 트립신 대우 조직의 준비가되어있는 세포에 최대 절전 E에 저장된 조직에서 세포를 비교하기 시작 칼슘 + + 무료 MG + + 무료 해부 버퍼. 합의는 트립신 당신이 바로 조직을 사용하지 않을 경우에는 최대 절전 모드 E.에 처음 배치 조직보다 더 많은 가능한 세포를 얻을 사용 준비가되는 조직이며, 다음은 최대 절전 E.에있는 조직을 저장해야합니다 지금 당장 조직을 이용하려고하고 증가 가능성을 원하시면 다음과 같이 다음 이전 기계적 분쇄에 트립신과 조직을 치료 : 1) 칼슘 + + 무료 MG + + 무료 1 ML 1 ML 0.25 % 트립신 (Gibco, Invitrogen)를 희석 해부 버퍼는 15 ML 튜브 (얼음 추위를 유지)에 (최종 트립신 = 0.125 %) 2) 장소 버퍼의 조직과 8 분 ° C 37 즉시 품어, 3)을 중지 10 ML DMEM/10 % FBS를 추가 트립신 반응하고 아래 절차를 계속 진행합니다. </li><li> 1 분 1,100 rpm으로 원심 분리기 세포 </li><li> 조심스럽게 세포 펠렛에서 Aspirated 미디어 </li><li> 최대 pipetting하여 펠렛 다시 일시 중지 그것에 NMB + 요인 1 ML을 추가하고 다운 </li><li> (BD 팰컨 셀 스트레이너 40 음 나일론)에 대단히 짧은 시간을 제거하는 필터를 통해 중력의 흐름에 의해 다시 정지 세포 패스 </li><li> 카운트 및 플레이트 세포 : <ul><li> microfuge 튜브에 60 μl NMB를 추가 + 요인, 세포 현탁액 20 μl와 trypan 파랑 20 μl 다음 믹스 </li><li> hemocytometer이 솔루션을 10 μl에 대한 추가하고 살아있는 세포를 (파란색) 개수 </li><li> 2.5 농도를 조절 - 4.5 X10 6 셀 / ML 참고 : 우리는 일반적으로 약 2.5 농도 취득 - 4.5 X 106 세포 / ML 있습니다. 볼륨에 따라 전지 (일반적으로 1 ML NBM + B27/Glutamax/PenStrep percortex)에 resuspended 있습니다. 조직이 트립신 사용한 경우, 생산량은 가능성이 증가됩니다. </li></ul></li></ol> 장치를 도금 <ol><li> 하나로 잘 장치의 세포 (뉴런 주)로드 </li><li> 플레이트 작은 장치 당 5 μl 큰 장치 당 20 μl 참고 :이 장치의 상단과 장치의 하단 (반 전체 볼륨) 10 μl의 세포 10 μl를로드하거나, 상단 somal 우물에 세포의 직접 모든 20 μl (물론 상단 somal 5 μl 수 작은 장치에 대한). </li><li> 37 ° C 배양기에서 10 분 동안 부화하기 때문에 전지는 첨부 시작할 수 있습니다 </li><li> 물론 장치의 크기에 따라 각각 NMB의 + 요인의 약 30분의 150 μl 추가 참고 : 볼륨이 PDMS의 두께에 따라 달라질 수 있습니다. 모든 문제는 우물이 가득이다. </li></ol> 플라즈마 본딩없이 장치를 사용하여 보충 플라즈마 처리하지 않고, 플라즈마없이 매주 성공적으로 그것을 크리스티나 화, 기술자, 그냥 바로 세포를 로드할 수 말합니다. 소마의 측면에 모두 우물 (자네가 미디어를 남기시려면 축삭 측면은 중요하지 않습니다)에서 미디어를 해제하는 것을 잊지 말아주세요. 이것은 세포가 주요 채널을 입력할 수있는 유체 흐름의. 당신이 우물에 미디어가있다면, 당신은 유체 흐름을하지 않습니다.

<ol><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li>
</ol>

저자들은 공개할 이해관계가 없습니다.

여기서 우리는 플라즈마 클리너없이 신경 microfluidic 장치를 사용하는 방법을 보여주었다. 우리는이 같은 비 - 플라즈마 결합을 참조하십시오.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>시약</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>경화제 포함 Sylgard 184. 가까운 판매처는 Dow Corning에 문의하십시오</td></tr><tr><td>Cornig No. 1 커버 글라스</td><td>커버 글라스</td><td>Corning</td><td>Corning No. X2935 244</td><td>Fisher Scientific을 통해 구매 가능, Fish 카탈로그 번호 12-531D</td></tr><tr><td>B27</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27은 Invitrogen의 Gibco 세포 배양 시약 라인을 통해 제공되는 독자적인 보충제입니다.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Glutamax는 Invitrogen의 Gibco 세포 배양 시약 라인을 통해 제공됩니다.</td></tr><tr><td>60 mm 페트리 접시</td><td>도구</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13A</td><td>60 mm 폴리스티렌 멸균 페트리 접시는 유리에 결합된 장치를 수용하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1274</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50 ml 튜브</td><td>도구</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352098</td><td>Fisher Scientific 카탈로그 번호 14-959-49A를 통해 구매 가능</td></tr><tr><td>BD Falcon 15 ml 튜브</td><td>도구</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352097</td><td>Fisher Scientific 카탈로그 번호 14-959-70C를 통해 구매 가능</td></tr></tbody></table>

microfluidic 장치의 저렴한 제작에 대한 pdms의 비 플라즈마 본딩

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

이 비디오에서는, 우리는 플라즈마 결합하지 않고 신경 세포 microfluidic 장치를 사용하는 방법을 보여줍니다. 어떤 경우에는 그것은 코닝 제 1 커버 유리 reversibly 결합 장치를하는 것이 바람직하다 수 있습니다. 이것은 가능한되지 않는 플라즈마 클리너로, 아마도으로 인해 수 있습니다. 그것은 뉴런이 장치의 스테인드 수 있으므로 immunostaining을위한 장치를 제거하는 데 필요한 것은 아니지만, 다른 경우에, 그것은 현미경이나 immunostaining 특정 유형의 뉴런의 culturing 후에 유리에서 장치를 제거하는 것이 바람직하다 수 있습니다. 일부 연구자들은 그러나 여전히 장치를 제거하는 것을 선호합니다. 이 경우, 커버 유리에 장치의 가역 본딩은 가능합니다. 인감으로 꽉하지가 형성되어있는 장치가 아닌 플라즈마 접합 몇 가지 단점이 있습니다. 어떤 경우에는 axons은 홈 아래에보다는 그들을 통해 성장 수 있습니다. 또한, 유리와 PDMS는 소수성이기 때문에, 액체는 쉽게 장치에 미디어 및 기타 시약을 강제로 시간이 필요하고 장치를 입력하지 마십시오. 액체가 모세관을 통해 장치를 입력하지만, 그것은 상당히 이상으로 플라즈마 보세 있었 장치에 비해 소요됩니다. 플라즈마 청소기 초 이내에 결합 후 장치를 통해 액체의 흐름을 촉진 유리 및 장치에 임시 친수성 ​​요금을 만듭니다. 비 - 플라즈마 바운드 장치, 장치를 통해 액체 흐름은 몇 분 정도 걸립니다. 장치가 플라즈마 청소기 그들을 소독하기 때문에 플라즈마 처리 장치를 사용하기 전에 소독을 할 필요가 없습니다 비해 먼저 소독을해야 결합이 아닌 플라즈마와 함께 사용할 수 있습니다 또한 중요하다.

이 비디오에서 우리는 플라즈마 결합하지 않고 신경 세포 microfluidic 장치를 사용하는 방법을 보여줍니다.

Microfluidic 장치의 저렴한 제작에 대한 PDMS의 비 플라즈마 본딩

본 영상에서는 플라즈마 본딩 없이 뉴런 미세유체 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 어떤 경우에는 가역적으로 본딩하는 것이 바람직할 수 있으며...

포토리소그래피와 소프트 리소그래피를 일상적으로 수행하는 실험실에는 일반적으로 플라스마 세정기(plasma cleaner)라고 불리는 장비가 있습니다. 플라스마 세정기에는 전자, 이온, 중성 원자 및 분자로 구성된 부분 이온화 가스를 생성하는 전기 코일이 있습니다. 플라스마는 유리와 소자 표면에 반응성 종을 생성하며, 이를 서로 접촉시키면 영구적인 결합이 형성됩니다.또한 플라즈마는 장치의 표면을 친수성으로 만들어 액체 첨가를 용이하게 합니다. 하지만 경우에 따라 영구적이고 가역적이지 않은 결합이 바람직하지 않을 수 있습니다. 아울러 많은 실험실에서 플라즈마 세척기를 사용할 수 없는 상황일 수도 있습니다.이러한 문제를 해결하기 위해, 오늘은 뉴런 장치를 커버 글라스에 가역적으로 플라즈마 없이 접합하는 방법을 시연하겠습니다. PDMS와 유리 사이의 정전기력은 수밀성이 있으며 세포 배양에 적합한 접합을 형성합니다. 시연을 진행할 Kiana Lee를 소개하겠습니다.Corning 1번 24 mm x 40 mm 커버슬립을 워터 배스 초음파 세척기를 사용하여 세척합니다. 유리를 스테인리스 스틸 랙에 담은 후, 탈이온수로 채워진 유리 용기에 넣습니다. 그런 다음 이 유리 용기를 워터 배스 초음파 세척기에 넣습니다.그 후 유리 슬라이드를 30분 동안 초음파 세척합니다. 초음파 세척 후, 유리 용기에서 탈이온수를 비웁니다. 유리 슬라이드가 들어 있는 유리 용기에 70% ethanol을 채운 다음, 멸균 상태를 유지하기 위해 이를 표준 생물안전작업대 내부로 옮깁니다.70% ethanol로 헹군 후, 스테인리스 스틸 랙을 유리 용기에서 꺼내 유리 슬라이드가 몇 시간 동안 또는 밤새 완전히 건조되도록 둡니다. 다음으로, 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 유리 슬라이드를 PLL 용액이 채워진 용기에 담가 PLL로 코팅합니다. 유리 슬라이드는 PLL 용액에 최소 3시간 또는 밤새 담가 둡니다.PLL 코팅 후, 디쉬에서 PLL 용액을 제거하고 유리 슬라이드를 탈이온수로 충분히 헹굽니다. PLL이 코팅된 유리를 물로 여러 번 헹군 다음, 디쉬에 물을 채우고 유리 슬라이드를 수 시간 동안 담가둡니다. 탈이온수에 수 시간 동안 담근 후, 디쉬에서 물을 흡입하여 제거합니다.유리 슬라이드를 빠르게 헹군 다음, 디쉬에서 꺼내 스테인리스 스틸 랙에 놓고 하룻밤 동안 건조시킵니다. 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서, Neuron device를 가져와 70% ethanol로 충분히 헹구어 멸균합니다. 그 후 장치에 남은 과잉 ethanol을 흡입하여 제거합니다. 이후 해당 장치들을 생물안전작업대 내에서 하룻밤 동안 건조시킨 뒤 다음 날 사용합니다.이 멸균된 뉴런 디바이스를 깨끗하고 멸균 처리되었으며 PLL이 코팅된 유리 위에 단순히 배치합니다. PDMS는 유리와 함께 액체가 새지 않는 가역적 결합을 형성합니다. 가벼운 압력으로 디바이스를 유리에 접합하거나, 즉시 디바이스에 배지를 추가합니다.조립 후 장치에 배지나 세포를 추가하기까지 너무 오래 기다리면 액체가 장치 내부로 진입하는 것이 더 어려워질 수 있습니다. 플라즈마 처리를 하지 않은 장치는 플라즈마 처리된 장치만큼 액체가 빠르게 진입하지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 플라즈마 처리된 장치는 처리 직후에 친수성을 띠어 액체가 친수성 장치 내부로 쉽게 흐르는 반면, 플라즈마 본딩을 하지 않은 장치를 통한 흐름은 훨씬 더 느립니다.경우에 따라 피펫을 사용하여 액체를 장치 내부로 강제로 밀어 넣어야 할 수도 있습니다. 본 영상에서는 뉴런 장치를 커버 글라스에 플라스마 본딩 없이 부착하는 방법을 보여드렸습니다. 이는 PDMS를 유리 표면에 가역적으로 BLO 하는 효율적이고 저렴한 방법입니다.이 영상이 유익하고 도움이 되었기를 바랍니다. 이상으로 John Lab의 영상을 마치겠습니다. 시청해주셔서 감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서 우리는 culturing의 뉴런에 microfluidic 장치를 farbricate을 사용 polydimethyl 실록산 (PDMS)과 소프트 리소그래피의 기술을 보여줍니다.

신경 소마와 Axons의 Compartmentalization위한 Microfluidic 장치의 제작

PDMS 장치 제작 및 표면 변경

Microfluidic 장치는 실시간으로 적절한 물리적인 비늘에서 복잡한 자연의 프로세스를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 표면 하의에 박테리아의 성장과 교통 수단을 공부하고 자연 다공성 매체의 주요 기능을 모방한 것이었 간단한 microfluidic 장치를 개발했습니다.

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우리는 폴리디메틸실록산(PDMS)에서 두 마이크로채널 사이에 나노유체 접합을 생성하기 위해 실리카 콜로이드 나노입자의 간단한 자기 조립 기술을 제안합니다. 이 기술을 사용하여 기공 크기가 ~45nm인 나노다공성 비드 멤브레인을 마이크로채널 내부에 구축하고 DNA 샘플의 동전기 사전 농축에 적용했습니다.

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Microfluidic 장치의 저렴한 제작에 대한 PDMS의 비 플라즈마 본딩

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