셀 침습적 DISC1 단백질 종의 생성, 정제 및 특성

다음 절차의 전반적인 목적은 정제된 디스크를 생성하는 것입니다. 하나는 수용 세포에 침입할 수 있는 응집체입니다. 이 목표를 달성하기 위한 두 가지 다른 방법이 첫 번째 방법으로 설명됩니다.

형광 단백질 디스크 하나의 융합 단백질을 형성하는 asome은 NLF 인간 신경모세포종 기증자 세포에서 과발현됩니다. 그런 다음 세포를 PBS로 세척하고 세제를 사용하지 않고 수집하여 눕힙니다. DNA가 소화되고 농업 구역이 자당 구배 시스템을 사용하여 정제됩니다.

이 방법으로 정제된 Agrios는 세포 침입 효율이 낮습니다. 대안적인 접근법은 대장균에서 재조합 디스크 1 단백질의 아미노산 5 98 - 7 85를 과발현하는 것입니다. 그런 다음 단백질 단편을 DITE 5 94로 라벨링하고 NI NTA 매트릭스를 사용하여 정제하여 남아 있는 결합되지 않은 염료 다중체 디스크를 제거합니다.

이 방법으로 생성된 One fragment는 숙주 세포 침입을 평가하기 위한 높은 세포 침입 효율을 가지고 있습니다. 정제된 형광 단백질 디스크, 리솜 디스크 또는 표지된 재조합 디스크. 하나의 단편은 관심 수용 세포와 함께 배양됩니다.

그런 다음 Trian blue를 첨가하여 세포 외 형광을 소멸시키고 침습을 컨포칼 현미경으로 시각화합니다. 지금까지, 단백질 응집은 정신분열증과 같은 만성 정신 질환의 특징으로 인식되지 않았다. 정신분열증에서 교란된 단백질이 후보 세포인 경우, 단백질 응집체의 세포 침입성은 단백질 확인 질환의 특징이다.

여기에서는 두 가지 방법을 통해 디스크 1 단백질 응집체가 세포 침습적이므로 디스크 1 관련 장애 또는 디스크 1 신경병증이 단백질 확인 장애임을 보여줍니다. 두 가지 방법은 첫째, 신경모세포종 세포주에서 ASOS인 전장 디스크를 정제하는 것이고, 둘째는 C 말단 다량체 디스크를 발현하는 것입니다. 대장균의 한 조각과 형광 염료를 사용한 정제 및 라벨링.

첫 번째 방법은 정제된 마이크로솜을 흡수하는 세포의 0.3%의 저효율 세포 침입으로 이어지지만, PUR 재조합 단백질 단편은 노출된 세포의 최대 20%를 감염시킵니다. 여기에 설명된 방법은 아크로솜 형성 또는 다중체 조립이 설득력 있게 입증된 다른 단백질로 이전할 수 있어야 합니다. 10 센티미터 접시 10 개마다.

보충된 RPMI 1640 배지에 있는 6개의 인간 신경모세포종과 LF 세포에 1.5배 10을 파종하고 하룻밤 동안 자랍니다. 다음날 세포는 70-80%confluent label 5개의 접시가 있어야 하며, PC DNA 3.1 MRFP 및 EGFP 태그가 지정된 human fulllength disk 1을 사용한 transfection을 위한 5개의 접시를 EGFP 플라스미드 단독으로 transfection해야 합니다. 각 10 센티미터 접시에 대해, 15 마이크로 그램의 플라스미드 DNA 30 마이크로 리터 만난 영향을 미치고 750 마이크로 리터를 결합하십시오.

Opti MEM을 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 위아래로 피펫팅하여 실온에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포를 형질주입하기 위해 DNA 형질주입 시약 용액을 세포에 적가하고 5%CO 2로 섭씨 37도에서 세포를 적가하여 형집행 후 48시간 동안 MRFP 전장 디스크 1의 발현을 모니터링하고 형광 현미경 하에서 농업 영역의 형성을 확인했습니다. 일부 세포는 여기에서 볼 수 있듯이 다량의 형광 단백질이 포함되어 있습니다.

이 프로토콜은 뇌 조직에서 루이소체를 정제하는 방법과 더 큰 응집체 또는 농업 구역을 분리하는 프로토콜을 결합합니다.이미 존재하는 방법은 세제의 사용을 기반으로 하기 때문에 세포 침습 분석에 적용하기 위한 무계면활성제 단백질의 분리가 중요합니다. 다음으로, PBS로 매체 세척을 흡인하고 프로테아제 억제제 칵테일이 함유된 PBS 400마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 세포를 긁어내고 1ml의 세포 현탁액과 10개의 세라믹 비드를 2mL lysis tube에 추가합니다.

pre-cell lyse 24 균질화기에서 3개의 62nd pulse를 사용하여 세포를 용해합니다. 공정의 기계적 힘으로 인해 샘플 내 온도가 섭씨 37도 이상으로 상승할 수 있습니다. 따라서 샘플을 얼음에서 식히도록 주의해야 합니다 용해 절차 후 얼음 위에서 세포를 냉각시킨 후 DNA 10밀리리터당 40단위의 염화마그네슘을 넣고 흔들면서 섭씨 37도에서 60분 동안 배양합니다.

PBS의 부피 당 80 % 50 % 및 20 % 자당 중량의 각 10 밀리리터를 준비합니다. 그런 다음 15 밀리리터 원뿔형 튜브에서 80 % 자당 2 밀리리터로 시작하여 50 % 자당 2 밀리리터와 20 % 자당 2 밀리리터로 자당 그라디언트를 준비합니다. 그라디언트를 천천히 붓고 이미 부어진 레이어를 방해하지 않도록 주의하십시오.

다음으로 분해된 용해물을 구배 위에 겹겹이 쌓고 섭씨 4도에서 1000배 G로 15분 동안 원심분리합니다. 분리된 상태에서 피펫으로 50-80% 자당 층 사이의 계면을 조심스럽게 수집하고 섭씨 4도에서 1000배 G로 15분 동안 15ml 원추형 튜브 원심분리기 5가지 부피와 혼합합니다. 상등액을 조심스럽게 제거하고 펠릿이 들어있는 농업 구역을 유지하십시오.

이 인터페이스에서 세척을 두 번 더 반복합니다. 농업 구역은 형광성이며 마지막 세척 후 자외선 아래에서 현미경으로 시각화 할 수 있으며, 상층액을 버리고 펠릿을 250-500 마이크로 리터의 PBS에 재현탁 할 수 있습니다. 이 펠릿에는 정제된 농업 구역이 포함되어 있습니다.

SHSY 5 Y 인간 신경모세포종 세포를 포함하는 24웰 플레이트의 각 웰에 10마이크로리터의 MRFP 디스크, 1개의 현탁액을 추가합니다. 멸균 유리 커버에 용해성 GFP 디스크 one C 말단을 구성적으로 발현하면 배양 후 48-72시간 동안 배양합니다. PBS로 세포를 세 번 세척하고 5분 동안 0.04% 트리안 블루로 세포외 형광을 끕니다.

그런 다음 PBS로 세척하여 트리안 블루를 제거합니다. 다음으로 접시를 얼음 위에 놓고 4% PFA와 PBS를 10분 동안 첨가하여 세포를 고정합니다. 그런 다음 멸균수로 한 번 씻고 DPI 장착 매체를 사용하여 연장된 금색으로 된 유리 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다.

외인성의 침입에 있는 흡수를 확인하십시오. Zack 이미지에서 수용 세포에 의해 발현된 모집된 단백질과의 공동 국소화를 통해 어그로 영역을 적용했습니다. 이 Zack의 깊이는 약 6마이크로미터입니다.

200나노미터 단위로 촬영한 24장의 사진. 빨간색으로 표시된 MRFP 디스크 하나의 농업 구역의 형광은 세포질 GFPC 말단 디스크를 모집합니다. 녹색 공동 국소화로 표시된 한 단편은 노란색으로 나타나며 농업 영역이 수용자 세포질에 들어가 이전에 용해성 디스크 1 단백질을 모집했음을 나타냅니다.

프로토콜의 이 부분에서는 인간 디스크 하나에 DITE 5 94가 표시됩니다. 이 D는 추가적인 면역 염색 없이 재조합 단백질을 직접 모니터링할 수 있게 해줍니다. 먼저 빔 메르캅토에탄올에서 빔 메르캅토에탄올로부터 제조된 단백질을 2리터의 PBS에 1에서 2000의 희석으로 3회 투석하여 분리하는 것으로 시작합니다.

다음으로 DITE 5 94 IDE가 있는 1밀리그램 디스크를 PBS에 1밀리리터 단백질을 용해시키고 5밀리몰 TCEP를 첨가하여 유리 TH기를 회수하고, DMF 용해 염료 20마이크로리터를 반응에 첨가하고, 분자량 컷오프가 10인 SLI 투석 카세트를 사용하여 실온에서 2시간 동안 배양하고, 000. Daltons는 PBS에서 1:2000의 비율로 단백질을 매번 2시간 동안 세 번 투석합니다. 다음으로 표지된 단백질의 순도를 더욱 증가시킵니다.

NI NTA 컬럼에서 히스 태그 기반 친화도 정제가 수행됩니다. 1 밀리리터 NI NTA 매트릭스를 10 밀리리터로 세척하십시오. 그런 다음 PBS는 라벨링된 투석 단백질을 컬럼에 적용하고 컬럼 위로 흐르게 합니다.

천천히 용액은 단백질이 NTA 매트릭스에 결합하기 때문에 파란색의 일부를 잃게 되며, 표지되지 않은 유리 염료는 흐름에 남아 있습니다. 일단 단백질 용액에 들어갑니다. 컬럼은 단백질을 용리시키기 위해 20 밀리리터 PBS로 컬럼을 세 번 세척하고 500 밀리몰 올레를 함유하는 PBS 2 밀리리터를 컬럼에 첨가합니다.

밸브를 저속으로 설정하고 N NI NTA 컬럼의 색상 띠를 모니터링하면서 적방울로 용리합니다. 암시하기 위하여는, 용리액의 이 착색한 분획은 레테르를 붙인 재조합 단백질을 포함한다, EIT를 SLI 투석 카세트로 옮기고 투석 후에 2개의 리터에서 2 시간 동안 1에서 2000의 희석에 10 밀리몰 NAPI에 EIT를 3 시간 투석한다. 멸균 0.45마이크로미터 주사기 필터를 통해 EIT를 밀어 넣은 다음 100마이크로리터 샘플의 5배에서 부분 표본을 추출하고 액체 질소에서 급속 동결합니다.

단백질의 총량은 각 100마이크로리터 분취액당 밀리리터당 0.5-1마이크로그램이어야 합니다. 단백질의 침습성을 평가하기 위해 수혜자 SH SY 5Y 인간 신경모세포종 세포를 포함하는 24웰 플레이트의 각 웰에 라벨링된 재조합 디스크 1개의 단백질로 표시된 밀리리터당 5-10마이크로그램을 포함하는 배지를 추가합니다. 멸균 유리 커버 슬립에 용해성 GFP 태그 디스크 1 C 말단을 구성적으로 발현하여 48-72 시간 동안 배양합니다.

농업 지역 처리된 세포에 대해 수행된 것처럼 세포를 담금질, 세포 외 형광 고정 및 장착, Zack Imaging에 의해 외인성으로 적용된 재조합 단백질의 침입을 확인합니다. 표지된 단백질이 채택되면 컨포칼 현미경 검사로 생성된 이미지에서 수용 세포의 둘레 내에서 검출됩니다. 이 Zack은 220나노미터의 24단계에서 약 5마이크로미터의 깊이를 포함합니다.

여기서, 빨간색으로 표시된 재조합 디스크 1 단편 5, 98 내지 7, 85는 용해성 C 단자 GFP 태그가 붙은 디스크를 발현하는 수용 세포에 의해 흡수되어 디스크의 침습성을 결정합니다. MRFP로 표기된 전장 디스크로 구성된 1개의 단백질 응집체, 1개의 단백질을 NLF 세포에서 정제하고 여기에 표시된 바와 같이 이 사진에 설명된 대로 수용자 SH SY 5개의 Y 세포에 적용했습니다. A-M-R-F-P 태그 디스크 하나 acrosome은 인간 신경 모세포종 SH SY 5 Y 세포를 침범하여 가용성 GFP 태그 C 터미널 디스크 하나를 발현합니다.

또한, MRFP 태그 디스크 1은 가용성 GFP 태그 디스크 1을 불용성 응집체로 동원하여 DIA 광 표지 재조합 디스크 1의 침습성을 측정하기 위해 여기에 나타난 바와 같이 용해성 GFP 디스크 1을 발현하는 SH SY 5 Y 신경모세포종 세포에 적용하였다. 빨간색으로 표시된 재조합 디스크 1 단백질 malters가 수용자 세포를 침범하고, 노란색 점은 용해성 GFP의 모집을 나타내고, C 말단 디스크 1을 재조합 디스크로 표시하고, 대장균에서 발현 및 정제 된 응집체로 표시되며, 대장균에서 발현되고 정제 된 세포는 multimeric 단백질이 쥐의 내측 전두엽 피질에 정위 론으로 주입 될 때 생체 내에서 뉴런에 침입 한 세포였습니다. Zack 영상은 뉴런 핵에 대한 항체로 염색된 쥐 피질 뉴런에서 재조합 디스크 1 단백질의 존재를 확인합니다.

세포 침입을 연구하기 위해 디스크 1 응집체를 생성하는 두 가지 방법을 보여드렸습니다. 이러한 방법 중 하나를 사용하여 외래 DNA의 transfection에 의한 재조합 유전자 발현의 잠재적으로 혼란스러운 변수 없이 디스크 1 응집체 흡수의 세포 효과를 조사할 수 있습니다. 이러한 기술은 디스크 1 단백질 병리학의 생물학적 효과를 조사하기 위해 적용할 수 있으며, 세포 내 및 생체 내 접종 또는 동물 모델의 기타 투여를 통해 생체 내에서 수행할 수 있습니다.

우리는 이러한 기술이 각 특정 단백질에 채택된 프로토콜에 약간의 수정을 가하면 결국 다른 단백질 응집체로 이전될 수 있다고 확신합니다. 이 절차를 수행할 때는 컨포칼 현미경 이미지를 성실히 분석하는 데 시간을 할애해야 합니다.