Name: 셀 침습적 DISC1 단백질 종의 생성, 정제 및 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: 배우세요 DISC1 단백질 응집체의 생성 및 정제 방법을 통해 세포 침습성을 평가하는 기술을. 이 방법은 신경과학 및 단백질 응집 질환 연구에 활용됩니다.

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뒤셀도르프 (Düsseldorf)의 대학 의료 학부 Forschungskommission의 교부금으로 지원하는 CKVB에,이 작품은 CK와 JPH, DFG (GRK1033 고 1679/3-1)에 신경 세포 - ERANET 발견 (BMBF 01EW1003)에 의해 재정 지원되었다.

1. Aggresome 기증자 세포의 준비 : Monomeric 레드 형광 단백질 (mRFP) 또는 향상된 그린 형광 단백질 (eGFP) 태그 인간 전체 길이 (FL) DISC1의 Transfection <ol><li> 종자 1.5 X 10 6 / 10cm 접시 인간의 neuroblastoma NLF (NLF, 필라델피아의 어린이 병원, 필라델피아, PA) 열 10cm 요리의 세포와 하룻밤 성장합니다. NLF 전지는 10 % 보충 RPMI-1640 배지에서 배양 아르 FBS, 페니실린 / Strepomycin, L-글루타민. 다음 날, 세포는 70-80% confluency에 있어야합니다. </li><li> Transiently 15 μg 플라스미드 DNA와 Metafectene transfection 시약 (Biontex, Martinsried, 독일)가 각각 10cm의 접시를 transfect. 간단히 말하자면, 10cm 요리에 대해, 15 μg 플라스미드 DNA와 30 μl Metafectene는, 750 μl Opti-가상에 추가 혼합 20 분 동안 RT에서 incubated되었습니다. 5 요리 pcDNA3.1 mRFP / eGFP-플라스미드 혼자있는 eGFP 태그 인간 (FL) DISC1 5 요리와 transfected했다. </li></ol> 2. AggresomeTransfected 기증자 세포의 정화 여기에 설명 된 프로토콜은 뇌 조직의 13 대형 집계 및 aggresomes 14 분리 할 수있는 프로토콜에서 Lewy - 몸을 정화 할 수있는 방법의 조합입니다. 이미 기존 방법은 세제의 사용, 세포 invasiveness의 assays의 응용 프로그램에 대한 세제없는 단백질의 고립을 기반으로하기 때문에 중요합니다. <ol><li> 48 시간 transfection 후, eGFP 및 mRFP/eGFP-DISC1의 표현을 모니터링하고 형광 현미경 (그림 1)에서 aggresomes의 형성을 확인합니다. </li><li> 1X 프로테아제 억제제 칵테일을 추가 (로슈, 인디애나 폴리스, IN)와 Precellys24 균질 (Bertin 기술, 프랑스)를 사용하여 셀을 방해, PBS 산도 7.4, 400 μl PBS 각과 흠집으로 세포를 씻으십시오. 간단히, 2 ML의 용해 튜브에 1 ML 세포 현탁액을 추가하고 열 세라믹 구슬을 추가합니다. 3 개 60 초 펄스로 세포를 Lyse. 프로세스의 기계적 힘은 할 수있다37 위의 샘플 내에서 온도를 증가 ° C 있으므로주의가 용해 절차 후 얼음에 샘플을 냉각하기 위해주의해야한다. </li><li> 얼음에 세포를 시원하고 37 60 분 10 MM MgCl 2, 40 U / ML DNase 및 배양을 추가 ° C </li><li> 80 % 솔루션, 50 %, PBS의 pH를 7.4 (10 ML 각)에 20 %의 자당 (w / V)를 준비합니다. </li><li> 50 % 20 % 다음, 2 ML 80 % 자당로 시작, 15 ML 팔콘 튜브에 자당 기울기를 준비합니다. 천천히 기울기를 넣어 이미 부어 레이어를 방해하지 않도록주의하십시오. 4 번 레이어 1,000 XG에서 15 분의 기울기와 원심 분리기 위의 소화 lysate를 ° C. </li><li> 조심스럽게 PBS 산도 7.4의 5 권과 피펫과 혼합으로 50-80%의 자당 층 사이의 계면를 수집합니다. 4 ° C.에서 1,000 XG 15 분 동안 원심 분리기 두 개의 추가 번 세척 반복합니다. 이 계면에서 aggresomes는 형광 있으며, UV 빛 아래에서 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 표면에 뜨는을 취소하고250-500 μl PBS의 산도를 7.4에서 펠렛을 resuspend. 이 펠렛은 정화 aggresomes (그림 2)가 포함되어 있습니다. </li></ol> 3. mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes로받는 SH-SY5Y 세포 치료 <ol><li> 종자 5 X 10 4받는 SH-SY5Y 인간 neuroblastoma 세포 constitutively 24 잘 플레이트의 각 잘에 멸균 유리 coverslips에 GFP-DISC1 (598-854)를 표현. SH-SY5Y 세포는 페니실린 / 스트렙토 마이신, 비 필수 아미노산 (NEAA)와 10 % FBS와 보충 DMEM/F-12 매체에 배양되어 있습니다. </li><li> 24 시간 후, 각도에 10 μl를 추가하고 48-72 시간에 품다. </li><li> PBS 산도 7.4으로 세포에게 3 x를 깨끗이 씻어 5 분에 0.04 % Trypan 파랑과 세포 형광을 해소. </li><li> 얼음에 10 분 동안 PBS 산도 7.4의 4% PFA으로 세포를 수정, DAPI 장착 매체 (Invitrogen, USA)와 골드를 연장으로 멸균 H 2 O로 한 번 씻고, 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재합니다. </li><li> / 이해를 확인Z-스택 이미지에받는 사람 세포에 의해 표현 모집 단백질과 colocalization로 exogenously 적용 aggresomes의 침략. </li></ol> 그러나 외인성 단백질의 이해 / 침략은 본질적으로 숙주 세포 단백질 모집과 병렬로 감지되지 않을 수 있습니다. 이 예에서는 mRFP는 태그 DISC1 aggresomes 모집 용해 GFP 태그 DISC1 (598-854) 숙주 세포 (그림 3 참조)에 의해 표현 단백질을. 사진은 Zeiss LSM 510 공 촛점 또는 Zeiss Axiovision Apotome2 현미경에 촬영 된 것입니다. 4. 재조합 DISC1의 세대 (598-785) 이전 발행물에서 우리는 자기 협회 도메인의 존재에 따라 자기 상호 작용에 다양한 DISC1 단백질 조각의 능력을 분석했다. 모든 단백질 중에는 인간의 DISC1 (598-785)는 (그림 4) 강한 multimerization 성향에게 4 표시 테스트 조각. 따라서, 인간 DISC1 (598-785)가 (없음 pET15b으로 복제 된vagen, 매디슨, 위스콘신)은 E. 표현 6 히스티딘 태그 N-터미널을 포함 대장균 BL21-(lDE3)이 로제 (Novagen, 미국), 그리고 4에 설명 된대로 8 몰 / 리터 요소의 denaturing 조건 하에서 정화. 즉, 프로토콜은 아래 설명되어 있습니다. <ol><li> BL21-(IDE3) 로제 E. 대장균은 OD 600 5mM 5 MM-아르기닌-HCL, MGSO4, 100 μg / ML carbencillin, 35 μg / ML chloramphenicol을 포함하는 2 X 500 ML 2YT에서 재배되었습니다 0.6-0.8와 DISC1 (598-785) 표현식은 유도 된 1 ㎜의 IPTG를 갖추고 있습니다. </li><li> DISC1 (598-785)가 37 ° C에서 4 시간에 표현 된, 그 표현은 원심 분리하여 박테리아를 수확하여 종료되었습니다. </li><li> 박테리아 펠렛은 50 ML TE 버퍼 (50 MM 트리스 - HCL 산도 8.0, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))와 2 MM PMSF, 1 % TX-100, 250 μg / ML 라이소자임, 20 MM MgCl 2, 400 U/50 ML에 resuspended되었습니다 완전한 용해을 보장하기 위해 DNase I.는, 반응은 부드러운 저어와 RT 30 분 동안 incubated되었습니다. </li><li> β-mercapt 10 MM을 추가또 다른 30 ​​분에 oethanol (ME), 500 MM NaCl 및 품다. </li><li> 4 ° C. 30 분에 20.000 g에 세균 포함기구를 스핀 다운 </li><li> Resuspend 펠릿 50mM 트리스 산도 8.0, 5 MM 이미 다졸, 500 MM NaCl, 8 M의 요소와 10 MM β-ME를, 4시 30 분에 20.000 g에서 원심 분리하여 오염 물질을 제거 ° C.를 포함하는 50 ML 추출 버퍼에 </li><li> 추출 버퍼와 니켈 NTA 아가로 오스 행렬을 씻으십시오. RT에서 2 시간에 니켈 NTA 매트릭스와 resuspended, precleared 단백질 추출물을 품다. </li><li> 12 MM 이미 다졸을 포함하는 추출 버퍼와 니켈 NTA 행렬을 씻으십시오. </li><li> 50 ㎜ 트리스, 500 MM NaCl, 300 MM 이미 다졸, 8 M 우레아, 1 MM PMSF, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 β-ME 10 MM를 포함하는 15 ML의 용출 버퍼와 함께 천천히 단백질을 Elute. </li><li> β-ME 10 MM를 포함하는 PBS 산도 7.4에 stepwise 단백질을 Dialyze. </li></ol> 1 L 세균 시작 문화에서 그 재조합 DISC1 (598-785) 제자의 50 밀리그램까지 분리 할 수​​ 있습니다EIN. α-synuclein의 refolding α-synuclein의 경우, 재조합 단백질 500 μg (시그마 - 알드리치, USA)와 실험은 1 MG / ML의 농도에 PBS에 용해되었다. oligomers를 구하려면 refolding이 37 박을 수행 한 ° C로 이전 간행물 10에 설명되어 있습니다. 5. DyLight594와 재조합 DISC1 (598-785)의 라벨 <ol><li> 이전 다음 라벨 프로세스 DISC1 (598-785)는 단백질은 β-ME에서 해방 될 수있다. 따라서 단백질은 1:2,000의 희석에 PBS 산도 7.4-3 시간을 dialyzed 있습니다. </li><li> 라벨 1 제조업체의 지침에 따라 DyLight 594 maleimide (열 과학, USA)와 MG DISC1 (598-785). 즉, PBS 산도 7.4에서 1 MG / ML 단백질을 분해 및 무료 thiol 그룹을 복구 할 5 밀리미터 TCEP를 추가합니다. RT에서 2 시간의 반응과 배양에 DMF 용해 염료의 20 μl를 추가합니다. </li><li> PBS 산도에 단백질 3 개를 Dialyze2 1:2000의 비율로 7.4 각을 시간. </li></ol> 추가로 표시된 단백질의 순도를 높이기 위해 그의 6 태그 니켈 NTA 열이 수행에 친 화성 - 정화 기반. <ol start="4"><li> 10 ML PBS 산도 7.4 1 개 ML 니켈 NTA 매트릭스 (Qiagen, 독일)을 씻으십시오. </li><li> 열에 표시, dialyzed 단백질을 적용하고 천천히 열을 통해 실행할 수 있습니다. </li><li> 3 개 20 ML PBS의 산도를 7.4으로 단백질을 씻어 </li><li> eluate 볼륨을 줄이기 위해 니켈 NTA 컬럼에 색 대역을 모니터링하면서 PBS 산도 7.4, 500 MM 이미 다졸 dropwise과 단백질을 Elute. </li><li> 2 시간 각 1:2000의 희석 10 MM NaPi 산도 7.4에 eluate 3 개를 Dialyze. </li><li> eluate, 액체 질소에 5 × 100 μl 샘플 및 스냅 동결에 나누어지는을 필터링하는 필터 살균 0.45 μm의 주사기를 사용합니다. 각 100 μl 나누어지는 1 μg / ML - 단백질의 총 금액은 0.5이어야합니다. </li></ol> 선택 concentration 단계 <ol start="10"><li> stereotactical 쥐 주사를 들어, 단백질은 속도 VAC (Eppendorf 집중 장치 5301)에 10 배 농축되었다. 최종 버퍼 상태는 100 밀리미터 NaPi했다. </li></ol> α-synuclein의 라벨링 재조합 α-synuclein의 라벨 및 정화 (니켈 NTA 열) DISC1 (598-785)에 병렬로 수행되었다. 총 출발 물질은 500 μg 대신 DISC1 (598-785) 1 밀리그램했다. 6. 레이블 재조합 DISC1 (598-785) 단백질과받는 SH-SY5Y 세포 치료 <ol><li> 종자 5x10 4받는 SH-SY5Y 인간 neuroblastoma 세포는 constitutively 24 잘 플레이트의 각 잘에 멸균 유리 coverslips에 GFP-DISC1 (598-854)를 표현. </li><li> 5-10 μg / ML의 농도에서 세포 배양 매체에 표시된 단백질을 추가하고 48-72 시간에 품다. </li><li> PBS 산도 7.4으로 세포에게 3 x를 깨끗이 씻어 extrac을 해소5 분에 0.04 % Trypan 파랑과 ellular 형광. </li><li> 얼음에 10 분 동안 PBS 산도 7.4의 4% PFA으로 세포를 수정, DAPI 장착 매체 (Invitrogen, USA)와 골드를 연장으로 멸균 H 2 O로 한 번 씻고, 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재합니다. </li><li> 레이저 공 촛점 현미경을 스캔에 의해 생성 된 Z-스택 이미지에받는 사람 세포에 의해 표현 모집 단백질과 colocalization하여 재조합 단백질을 적용 exogenously의 이해 / 침략을 확인합니다. 그러나 내생 단백질 모집은 기본적으로 숙주 세포 단백질의 침략과 병렬로 감지되지 않을 수도 있습니다, Z-스택 이미지가 여전히 단백질의 침해 자연을 확인할 수 있습니다. </li></ol> 우리의 예를 들어 REC합니다. DISC1 (598-785) * 최소 부분 모집에 용해 DISC1 (598-854) 숙주 세포 (그림 5A를 참조)에 의해 표현 단백질을 GFP 태그. 재조합 α-synuclein의 침략 있지만 모집합니다 (그림 5B) 표시됩니다. 사진이 촬영 된Zeiss LSM 510의 공 촛점 또는 Zeiss Axiovision Apotome2 현미경. 집중의 주입으로도 동물의 재관류 후 감지 할 수있는 주사 사이트 주변의 단백질의 확산에 mPFC 결과에 DISC1 (598-785) *로 표시 (2.5 μg / μl의 ca. 4 μl), rhodamine의 filterset와 PBS 산도 7.4의 4퍼센트 PFA. 이 예에서는 DISC1 (598-785)은 뉴런의 고유 한 숫자에 의해 촬영되어 있으며 Z-스택 영상 (그림 6)에 모니터링 할 수 있습니다. 일반적으로 사람들이 여기서 사용하여 다른 단백질의 주입이 반드시 셀 침략으로 이어질하지 않습니다. 침공 이벤트가 단백질의 특성에 근본적으로 의존 그럼에도 불구하고 깨끗한 정화는 추가 분석을 위해 필수입니다. 7. 대표 결과 NLF 세포에서 재조합 FL DISC1-eGFP 정화 구성된 Aggresomes는받는 SH-SY5Y CE를 침공낮은 효율의 재편 (약 0.3 % 5) 등의 공 촛점 현미경 (그림 3)과 colocalization 볼. 이전에보고 된 바와 같이, DISC1 (598-785)는 표현과 E.에서 정화 대장균은 multimers 4 긍정적 인 제어 (그림 5B)로 병렬로 사용 된 α-synuclein 그와 유사한 약 20 % 5 (그림 5A)의 효율성을 동일하게 휴대 침습적 있었다 형성했다. 표시 재조합 DISC1 (598-785)는 표현과 E.에서 정화 multimeric 단백질이 stereotactically 쥐의 내측 전두엽 피질 (; Pum, 베이더, 휴스턴, Korth, 게시되지 않은 그림 6)에 주입했을 때 대장균은 세포 침습적 생체의 뉴런을했다. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. NLF의 neuroblastoma 세포는 transiently FP-DISC1 (빨간색)를 표현. 레드 형광 aggresomes는 dete 수 있습니다세포 내에서 cted. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 자당 기울기에서 정화 한 후 DISC1 aggresomes을 mRFP 태그 정화. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 침략 aggresomes의 형광등 그림. mRFP 태그 flDISC1 aggresomes는 SH-SY5Y neuroblastoma 세포와 정화와 incubated되었습니다 overexpressing 용해 GFP 태그 DISC1 (598-854)을. 분류 aggresomes의 이해는 레이저 스캔 현미경 (Zeiss LSM 510)에 Z-스택 영상에 의해 모니터링된다. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. REC의 SEC - 프로필입니다. S704과 C704 단일 염기 polymorphisms (SNP)을 포함 DISC1 (598-785). 두 변종은 주문 oligomerization의 중단과 높은 분자량의 복수의 형성을 보여imers (빨간색 화살표). 이 사진은 Leliveld 외의 기사., 생화학 2009 수정됩니다. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 침해 DyLight - 라벨 재조합 DISC1 (598-785)의 형광 Z-스택 사진. 수용성 GFP-DISC1 (598-854)를 표현 SH-SY5Y의 neuroblastoma 세포가 표시와 incubated되었습니다, 5 μg / ML의 농도에서 재조합 단백질. (A) 레드 집계는 REC의 침략을 보여줍니다. DISC1 (598-785) 단백질과 노란색 점을 합산로 용해 GFP-DISC1 (598-854)의 영입을 나타냅니다. (B) 재조합 α-synuclein (빨간색)은 20 %의 주파수로 채용하지 않고 세포를 침공. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="그림 6" /> 의 그림 6. Immunofluorescent 사진주입 라벨, 재조합 DISC1 (598-785) 단백질. Z-스택 영상은 REC의 존재를 확인합니다. neuronal 핵 (NeuN, 녹색)에 대한 항체 물들 쥐 대뇌 피질의 뉴런에서 DISC1 (598-785) 단백질.

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</ol>

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이 연구에서 우리는 transfected neuroblastoma 세포 라인, 준비와 재조합 DISC1 단백질 종의 라벨 및 체외 및 생체 내받는 세포의 세포 침공 실험에서의 응용 프로그램에서 mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes의 정화에 대해 설명합니다. 기본 mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes의 정화는 Lewy 몸과 같은 구조와 큰 합산 13, 14을 분리 프로토콜에서 개발하지만, 세제의 사용을 방지하고, 발생할 수있는 세포 침략 허위 긍정적의 위험을 최소화하기 위해 바뀌 었습니다 세제 - 용이 막 침투로 인해. 한 가지 가능한 미래의 개선은 더욱 aggresomes에서 완전히 별도의 남아있는 세포막과 세포 골격에 sonication하여 aggresomes의 순도를 증가시키기에 있습니다. 증가 전반적인 순도함으로써, 대형 aggresomes mA에 대해 기록 된 총 침공 이벤트의 수y는 5 증가. Google에서 제안하는 3 상 자당의 제한된 정의가 다른 단백질 종의 aggresomes 충분한인지 여부를 테스트 할 수 있으며, 이런 의미에서 프로토콜 여기서 설명은 개별 최적화를위한 출발점으로 간주해야합니다. 정화의 aggresomes은 자당의 흔적 크게 전체 생산량을 축소하지 않았습니다을 제거하기 위해 손, 추가 세척 단계 (세제없이)에 매우 강력한 것으로 판명. 이전 발행물에서 우리는 DISC1의 올리고머 조립은 C-말단 4 (그림 4)에서 서로 다른 multimerization 도메인에 의존 것을 설명했다. 우리는 E.의 재조합 용해 표현이 조각을 선택 대장균 및 후속 니켈 NTA 정화. 그 multimerization를 모니터링하고 α-synuclein과 같은 설명 셀 침습적 단백질과의 세포 invasiveness을 비교하기 위해 형광 염료 DyLight594와 DISC1 (598-785)를 표시하고, 비교하여똑같이 표시 α-synuclein의와 세포 invasiveness. 재조합 DISC1 조각의 세포 invasiveness은 크게 기본, 전체 길이 DISC1 aggresomes을 가능성은 작은 크기와 훨씬 더 높은 순도로 인한의에 비해 증가했다. 다시 말하지만, 순도는 세포 invasiveness에 결정적인 역할을 보인다. 우리의 예에서 침입 aggresomes는 recombinantly 가용성, 즉 세포 분산 형태로 표현 된 대상 셀 라인의 가용성 homologue 단백질을 모집. 이 Z-스택 영상을 통해받는 셀 범위 안에서 침해 aggresomes 및 재조합 단백질의 colocalization 수 있기 때문에받는 사람 세포주의 형광 단백질 (예 : GFP 또는 RFP)의 표정은 장점이 될 것이다. 셀 침습적 DISC1의 aggresomes과 multimeric 조각 표현과 E.에서 정화 대장균은 DISC1, DI에 관한 단백질 conformational 질병의 정의 기능 될 수SC1opathies 15. 촬영 방해가 : 자당 기울기 정화 후 낮은 aggresome 수율 : 이 프로토콜에 소개 자당 기울기는 eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes 잘 작동합니다. 다른 단백질로 구성된 Aggresomes은 변수 차원이 될 수 있습니다 따라서 자당 농도는 다른 사용자가 최적화되어야합니다. 재조합 단백질의 부족 정화 : 재조합 단백질의 정제 과정에서 세균 오염 물질은 또한 프로토콜의 이후 단계에 표시됩니다. contaminations을 방지하려면 SDS-PAGE에서 단백질을 실행하고 재조합 단백질은 Coomassie - 블루와 얼룩의 순수한 이상 95% 수 있는지 확인하십시오. 최고의 품질과 수율을 보장하기 위해 프로토콜은 각각의 단백질에 최적화되어야한다. 낮은 라벨 EF재조합 단백질의 ficiency : 무료 SH-그룹을 포함하는 모든 contaminations은 단백질의 효율적인 라벨이 감소합니다. 따라서 광범위한 투석 및 니켈 NTA 기반의 정화는 필수입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> 매체는 숙주 세포 라인에 따라 달라집니다. 최적받는 셀 라인은 사용자에 의해 결정됩니다. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> 매체는받는 사람 세포 라인에 따라 달라집니다. 최적받는 셀 라인은 사용자에 의해 결정됩니다. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> 다른 transfection의 시약은 잘 작동 할 수 있지만, 우리의 프로토콜 테스트되지 않았습니다. </td></tr><tr><td> 니켈 NTA 아가로 오스 </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ TD&gt; <td> 실험 Qiagen에서 Ni_NTA 아가로 오스 짓을 한 다른 공급 업체뿐만 아니라 작동합니다. </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 로슈 </td><td> 04716728001 </td><td> aggresomes 정화의 과정에서 RNase 무료 DNase 필요가 없습니다. </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-가상 </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> 혈청 무료 매체뿐만 아니라 작동 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> SH-SY5Y과 NLF 매체에 보완 </td></tr><tr><td> 비 필수 - 아미노 산 (NEAA) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M7145 </td><td> SH-SY5Y 매체에 대한 보완 </td></tr><tr><td> Trypan 파랑 0.4 % </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T8154 </td><td> 독성 시약 </td></tr><tr><td> DyLight 594 마leimide </td><td> 열 피셔 과학 </td><td> 46,608 </td><td> 안정적인 thioether 채권을 형성 시스테인 반응을 염색 감소. 다른 색상 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> DAPI와 골드을 연장 </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> 이 antifade 액체 mountant는 우리 손에 우수한 결과를 주었다. </td></tr><tr><td> 프로테아제 억제제 칵테일 </td><td> 로슈 </td><td> 11873580001 </td><td> 100X 솔루션 500 μl H 2 O에 1 표를 분해. </td></tr><tr><td> 합성 - synuclein </td><td> 시그마 </td><td> S7820 </td><td> Refold 같은 텍스트에 설명되어 있습니다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 특정 시약 표. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin 기술 </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> 우리는 다른 기계 homoge을 테스트하지 않은이 이외의 다른 nizers. 다른 세제 무료로 균질화 방법은 잘 작동 수도 있지만,이 프로토콜에 대한 테스트 된 것은 아닙니다. </td></tr><tr><td> 5301 농축기 (speedvac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> 단백질은 집중되어야하는 경우에만 필요합니다. </td></tr><tr><td> LSM 510 및 Axiovision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> 제조업체의 카탈로그를 참조하십시오 </td><td> 두 현미경은 Z-스택 이미징을 수행 할 수있는 능력을 숨기 죠. 이 침공 이벤트의 견고하고 심각한 평가 필수입니다. </td></tr><tr><td> 세포 배양 플라스틱 재료 </td><td> Nunc </td><td> 10cm 요리 # 172958, 24 잘 접시 # 142475 </td><td> 다른 플라스틱 재료의 사용은 재조합 단백질 또는 aggresomes 및 플라스틱 표면의 상호 작용에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에 설명 된 이외의 자료를 테스트하지 않았습니다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 특정 재료와 장비의 표. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 수 </td><td> 버퍼 이름 </td><td> 내용 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 박테리아 성장 매체 </td><td> 16g / L Bacto Tryptone, MGSO4 5mM 10g / L Bacto 효모 추출물, 5g / L NaCl, 5 MM-아르기닌-HCL, 100 μg / ML carbencillin, 35 μg / ML chloramphenicol </td><td> OD 600 박테리아의 성장 : 0.6-0.8 1 밀리미터 IPTG와 표현을 유도. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 세균 resuspension 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 - HCL 산도 8.0, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2 MM PMSF, 1 % TX-100, 250 μg / ML 라이소자임, 20 MM MgCl 2, 400 U/50 ML DNase I </td><td> ove 한 L에서 세균 펠릿을 Resupend50 ML의 resuspension 버퍼에 rnight 문화. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> 단백질 추출 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 산도 8.0, 5 MM 이미 다졸, 500 MM NaCl, 8 M의 요소와 10 MM B-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> 니켈 NTA 컬럼 세척 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 산도 8.0, 5 MM 이미 다졸, 500 MM NaCl, 8 M의 요소와 10 MM B-ME, 12 MM 이미 다졸 </td><td> 12 MM 이미 다졸과 수정 추출 버퍼가 추가되었습니다. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> 니켈 NTA 컬럼 용출 버퍼 </td><td> 50 ㎜ 트리스, 500 MM NaCl, 300 MM 이미 다졸, 8 M 우레아, 1 MM PMSF, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 MM B-ME </td><td> 용출 버퍼는 나중에 dialyzed되어 10 MM B-ME가 포함되어 있습니다. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8g / L NaCl, 0.2 g / L KCl, 1.44 g / L 오세영 2 HPO 4, 0.24 g / L KH 2 PO 4, pH를 7.4로 조정 </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> 버퍼를 라벨 </td><td> PBS는 5 밀리미터 TCEP를 포함하는 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 조리법 표. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

셀 침습적 disc1 단백질 종의 생성, 정제 및 특성

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

단백질 집합이 알츠하이머 병 (Aβ, 타우) neurodegenerative 질병에, 예를 들어, 같은 만성, 퇴행성 뇌 조건의 일반적인 특징으로 볼 수 있으며, 파킨슨 병 (α-synuclein), 헌팅턴 병 (polyglutamine, huntingtin) 등. 단백질 집합 방해 proteostasis으로 인해 발생하는 것으로 생각되며, 발생 및 misfolded 단백질의 저하 사이의 불균형을 즉. 노트의 같은 단백질은 가족 형태의 희귀 한 변종의 돌연변이 아르 이러한 질병의 산발적 인 형태로 집계 찾아 볼 수 있습니다. 정신 분열증은 많은 경우에 영구와 돌이킬인지 적자와 함께가는 만성 진보적 인 뇌 상태입니다. 후보 유전자 접근 방식에서 우리는 중단 인 정신 분열증 1 (DISC1), 만성 정신 질환 1, 2 결합과 스코틀랜드의 가정에서 복제 유전자가 brai에 불용성 응집체로 발견 될 수 있는지의 여부도 조사N 정신 분열증 3 산발적 가지 경우. SMRI의 CC를 사용하여, 우리는 CMD과 가지 경우 약 20 %에서 발견되지만 생화학 분류 한 후 neurodegenerative 질병과 일반 컨트롤이나 환자가 sarkosyl - 불용성 DISC1의 immunoreactivity. 체외의 후속 연구는 DISC1의 집계 성향은 질병 관련 다형성 S704C 4에 의해 영향을 것을 발표하고, 체외에서 생성 된 DISC1 aggresomes는 Aβ 6 표시 된 것과 유사한 5, 타우 7-9, α 세포 침습적 있다는 - synuclein 10, polyglutamine 11, 또는 SOD1 집계 12. 이러한 연구 결과는 우리 CMD와 가지 경우 적어도 일부, 통합 DISC1을 가진 단백질 conformational 장애 될 수 있다는 제안하라는 메시지가 나타납니다. 여기에 우리가 포유류의 세포에서 DISC1 aggresomes를 생성하는 방법을 설명, 자당 기울기에 올려 정화 및 세포 invasiveness의 studi 위해를 사용하는에스. 마찬가지로, 우리는 독점적으로 multimeric C-터미널 DISC1 조각, 라벨을 생성하고 세포 invasiveness 연구를 위해 정화 방법에 대해 설명합니다. DISC1의 재조합 multimers 사용하여 우리는 비슷하게 표시 합성 α-synuclein 조각에 관해서는 유사한 세포 invasiveness를 얻을 수 있습니다. 우리는 또한 stereotactically받는 동물의 뇌에 주입 할 때이 조각은 생체에서 촬영되어 표시됩니다.

배양 한 세포에서 세포, 세포질 전체 길이 DISC1 단백질 aggresomes와의 표시, multimeric 재조합 DISC1 단백질 조각의 생성, 정화 및 세포 침공<em&gt; E. 대장균</em&gt;에 설명되어 있습니다. 세포 invasiveness은 세포 배양과 뉴런에받는 사람 세포에 표시됩니다<em&gt; 생체 내</em&gt; stereotactical 뇌 접종 후.

셀 침습적 DISC1 단백질 종의 생성, 정제 및 특성

단백질 응집은 예를 들어 알츠하이머병(Aβ, tau), 파킨슨병(α-synuclein), 헌팅턴병(polyglutamine, huntingtin) 및 기타 신경퇴행성 질환과 같은 만성 퇴행성 뇌 질환의 일반적인 특징으로 간주됩니다. 단백질 응집은 단백질 항상성, 즉 잘못 접힌 단백질의 생성과 분해 사이의 불균형으로 인해 발생하는 것으로 생각됩니다. 주목할 점은, 가족성 형태의 희귀 변이에서 돌연변이가 나타나는 동일한 단백질들이 이러한 질환의 산발성 형태에서도 응집된 상태로 발견된다는 것입니다. 조현병은 많은 경우 영구적이고 되돌릴 수 없는 인지 저하를 동반하는 만성 진행성 뇌 질환입니다. 후보 유전자 접근법을 통해, 본 연구진은 만성 정신 질환과의 연관성이 있는 스코틀랜드 가족 내에서 클로닝된 유전자인 DISC1(Disrupted-in-schizophrenia 1)이 산발성 조현병 환자의 뇌에서 불용성 응집체로 발견될 수 있는지 조사하였습니다. SMRI CC를 사용하여 생화학적 분획법을 시행한 결과, 정상 대조군이나 신경퇴행성 질환 환자에서는 나타나지 않았으나, 만성 정신 질환(CMD) 사례의 약 20%에서 사코실(sarkosyl) 불용성 DISC1 면역반응성이 확인되었습니다. 이후 진행된 인비트로(in vitro) 연구에서 DISC1의 응집 경향은 질환 관련 다형성 S704C의 영향을 받는 것으로 나타났으며, 인비트로에서 생성된 DISC1 어그레솜(aggresome)은 Aβ, tau, α-synuclein, polyglutamine 또는 SOD1 응집체에 대해 보고된 것과 유사하게 세포 침습성을 보였습니다. 이러한 발견을 바탕으로 본 연구진은 CMD 사례 중 DISC1 응집체가 있는 일부 사례는 단백질 구조 이상 질환일 수 있다는 가설을 제안하게 되었습니다. 본 논문에서는 포유류 세포에서 DISC1 어그레솜을 생성하고, 이를 수크로스 밀도 구배 원심분리로 정제하여 세포 침습성 연구에 사용하는 방법을 설명합니다. 이와 유사하게, 배타적인 다량체 형태의 C-말단 DISC1 단편을 생성하고, 이를 표지 및 정제하여 세포 침습성 연구에 활용하는 방법을 기술합니다. 재조합 DISC1 다량체를 사용하여 유사하게 표지된 합성 α-synuclein 단편과 동등한 수준의 세포 침습성을 구현하였습니다. 또한, 이 단편을 수용 동물 뇌에 정위 주입했을 때 인비보(in vivo)에서 섭취됨을 보여줍니다.

다음 절차의 전반적인 목적은 정제된 disc를 생성하는 것입니다. 이는 수용 세포로 침투할 수 있는 응집체를 형성합니다. 첫 번째 방법을 통해 이 목표를 달성하기 위한 두 가지 서로 다른 방법이 시연될 것입니다.some forming 형광 단백질 disc one 융합 단백질을 NLF 인간 신경모세포종 공여자 세포에서 과발현시킵니다. 그다음 세포를 PBS로 세척하고 수집하여 계면활성제 없이 용해합니다. DNA를 소화시키고 sucrose 구배 시스템을 사용하여 agro zone을 정제합니다.이 방법으로 정제된 Agrios는 세포 침투 효율이 낮습니다. 대안적인 접근 방식은 재조합 disc one 단백질의 5 98에서 7 85까지의 아미노산을 e coli에서 과발현시키는 것입니다. 그 후 단백질 단편을 DITE 5 94로 표지하고 투석하며, 결합되지 않은 잔류 염료 및 다량체 disc를 제거하는 NI NTA 매트릭스를 사용하여 정제합니다.이 방법으로 생성된 fragment는 숙주 세포 침투를 평가하기 위한 높은 세포 침투 효율을 갖습니다. 정제된 형광 단백질 disc, 리보솜 또는 표지된 재조합 disc를 사용합니다. fragment를 대상 수용 세포와 함께 배양합니다.그 후 Trypan blue를 첨가하여 세포 외 형광을 소광시키고, 공초점 현미경으로 침습 정도를 시각화합니다. 지금까지 단백질 응집은 조현병과 같은 만성 정신 질환의 특징으로 인식되지 않았습니다. 조현병에서 파괴된 하나의 단백질이 후보이며, 단백질 응집체의 세포 침습성은 단백질 구조 질환의 핵심적인 특징입니다.본 연구에서는 두 가지 방법을 통해 disc one 단백질 응집체가 세포 침투성을 가지며, 이에 따라 disc one 관련 질환 또는 disc one 신경병증이 단백질 구조 이상 질환임을 보여줍니다. 두 가지 방법은 첫째, 신경모세포종 세포주로부터 전체 길이의 disc one ASOS를 정제하는 것이며, 둘째, E. coli에서 C-말단 다량체 disc one 단편을 발현시킨 후 이를 정제하고 형광 염료로 표지하는 것입니다.첫 번째 방법은 정제된 마이크로솜을 흡수한 세포의 약 0.3%만이 침투하는 낮은 효율을 보인 반면, 정제된 재조합 단백질 단편은 노출된 세포의 최대 20%까지 감염시켰습니다. 여기에 기술된 방법들은 아크로솜 형성 또는 다량체 조립이 입증된 다른 단백질에도 적용 가능할 것입니다. 10 cm 디시 10개 각각에서.보충제가 첨가된 RPMI 1640 배지에 1.5 × 10⁶개의 인간 신경모세포종 및 LF 세포를 분주하고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 세포의 합류도가 70~80%가 되어야 합니다. 5개의 디쉬에는 PC DNA 3.1 MRFP 및 EGFP가 태깅된 인간 full-length disc 1을 형질전환하기 위해 표시하고, 나머지 5개의 디쉬에는 EGFP 플라스미드만 형질전환하기 위해 표시합니다. 각 10 cm 디쉬당 15 µg의 플라스미드 DNA, 30 µL의 met affecting 및 750 µL를 혼합합니다.마이크로 원심분리 튜브에 Opti MEM을 넣고 피펫팅으로 섞어준 뒤, 상온에서 20분 동안 배양합니다. 그 다음 세포에 형질전환시키기 위해 DNA 형질전환 시약 용액을 세포에 한 방울씩 첨가하고, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양합니다. 형질전환 후 mRFP full length disc 1의 발현을 모니터링하고 형광 현미경 하에서 aggresome의 형성을 확인합니다. 여기에서 보는 바와 같이 일부 세포에는 거대한 형광 단백질 응집체가 존재합니다.본 프로토콜은 뇌 조직에서 루이 소체(Lewy bodies)를 정제하는 방법과 더 큰 응집체 또는 agro zone을 분리하는 프로토콜을 결합한 것입니다. 기존의 방법들은 세제(detergent) 사용을 기반으로 하므로, 세포 침습성 분석(cell invasiveness assays)에 적용하기 위해 세제가 없는 단백질을 분리하는 것이 매우 중요합니다. 다음으로, 배지를 흡입하여 제거하고 PBS로 세척한 후, 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)이 포함된 PBS 400 µL를 첨가합니다. 그런 다음 세포를 긁어 모아 세포 현탁액 1 mL와 세라믹 비드 10개를 2 mL 용해 튜브(lysis tube)에 넣습니다.pre-cell lyse 24 균질기를 사용하여 62nd 펄스로 3회 세포를 용해합니다. 이 과정의 기계적 힘으로 인해 샘플 내부 온도가 37 °C 이상으로 상승할 수 있으므로, 샘플을 얼음 위에서 냉각시키는 데 주의를 기울여야 합니다. 용해 절차 후, 세포를 얼음 위에서 냉각시킨 다음 10 mM magnesium chloride와 40 units/mL DNAA를 첨가하고 37 °C에서 60분 동안 흔들어주며 배양합니다.PBS에서 80%, 50%, 20% 농도의 설탕(sucrose) 용액(w/v)을 각각 10밀리리터씩 준비합니다. 그 다음 15밀리리터 원심분리관(conical tube)에 80% 설탕 용액 2밀리리터를 먼저 넣고, 이어서 50% 설탕 용액 2밀리리터와 20% 설탕 용액 2밀리리터를 순차적으로 넣어 설탕 농도 구배(sucrose gradient)를 형성합니다. 이때 이미 부어놓은 층이 섞이지 않도록 천천히 붓습니다.소화된 용해물을 농도 구배 위에 층을 이루게 얹고 4°C에서 1000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리기를 멈춘 후, 피펫을 사용하여 50~80% sucrose 층 사이의 계면을 조심스럽게 수집하고, 15 mL 원추형 튜브에 5배 부피와 섞어 4°C에서 1000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿이 포함된 agrisome 층을 유지합니다.이 인터페이스에서 세척 과정을 두 번 더 반복합니다. Agri zone은 형광성을 띠므로 마지막 세척 후 UV 광원 하의 현미경으로 시각화할 수 있으며, 상층액을 제거하고 펠렛을 250에서 500 µL의 PBS에 재현탁합니다. 이 펠렛에는 정제된 agro zone이 포함되어 있습니다.SH SY5Y 인간 신경모세포종 세포가 담긴 24웰 플레이트의 각 웰에 MRFP disc 1 아좀 현탁액 10 µL를 첨가합니다. 멸균 유리 커버 슬립 상에서 가용성 GFP disc 1 C-말단을 상시 발현시키고 48~72시간 동안 배양합니다. 배양 후 세포를 PBS로 3회 세척하고, 0.04% trypan blue로 5분 동안 세포 외 형광을 소광합니다.그 후 PBS로 세척하여 트라이판 블루(trian blue)를 제거합니다. 다음으로, 디쉬를 얼음 위에 놓고 4% PFA와 PBS를 첨가하여 10분 동안 세포를 고정합니다. 그런 다음 멸균수로 한 번 세척하고, DPI 마운팅 용액이 포함된 prolonged gold를 사용하여 커버슬립을 유리 슬라이드에 마운팅합니다.Z-stack 이미지에서 수용 세포에 의해 발현된 모집 단백질과의 공국소화를 통해, 외인성으로 적용된 aggro zone의 침입 및 섭취를 확인합니다. 이 Z-stack은 약 6 µm의 깊이를 포함합니다.200 nanometers 간격으로 촬영된 24장의 사진입니다. 빨간색으로 표시된 MRFP disc one agri zone의 형광이 세포질의 GFPC terminal disc fragment를 모집합니다. 녹색으로 표시된 부분의 공동 국소화(colocalization)는 노란색으로 나타나며, 이는 agri zone이 수용 세포질로 진입하여 이전에 가용성 상태였던 disc one 단백질을 모집했음을 나타냅니다.프로토콜의 이 단계에서는 human disc one을 DITE 5 94로 표지합니다. 이 D는 추가적인 면역 염색 없이도 재조합 단백질을 직접 모니터링할 수 있게 해줍니다. 먼저, 동봉된 문서에 기술된 대로 준비된 단백질을 1:2000 희석된 2L의 PBS에서 3회 투석하여 beam mercaptoethanol을 제거하십시오.1 mg의 disc 1을 DITE 5 94 IDE로 라벨링하십시오. 1 mg/mL 농도의 단백질을 PBS에 녹인 후, 자유 TH 그룹을 회복시키기 위해 5 mM TCEP를 첨가하십시오. DMF에 녹인 염료 20 µL를 반응물에 넣고 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하십시오. 분자량 컷오프가 10,000 Daltons인 SLI 투석 카세트를 사용하여, PBS에서 1:2000 비율로 2시간씩 3회 단백질을 투석하십시오. 다음으로 라벨링된 단백질의 순도를 더욱 높이십시오.Ni-NTA 컬럼을 이용한 His-tag 기반 친화성 정제를 수행합니다. 1 mL의 Ni-NTA 매트릭스를 10 mL의 PBS로 세척한 후, 라벨링 및 투석 과정을 거친 단백질을 컬럼에 로딩하여 통과시킵니다.단백질이 NTA 매트릭스에 결합함에 따라 용액의 푸른색이 서서히 옅어지며, 라벨링되지 않은 유리 염료는 통과액에 남아 있게 됩니다. 단백질 용액이 컬럼에 주입되면, 20 mL의 PBS로 컬럼을 3회 세척하십시오. 단백질을 용출시키기 위해 500 mM imidazole이 포함된 PBS 2 mL를 컬럼에 첨가하십시오.밸브를 저속으로 설정하고 Ni-NTA 컬럼의 유색 밴드를 모니터링하면서 한 방울씩 용리합니다. 용리액의 이 유색 분획에는 표지된 재조합 단백질이 포함되어 있습니다. 용리액(EIT)을 SLI 투석 카세트로 옮기고, 2L의 10 mM NaPi 용액에 1:2000 비율로 희석하여 2시간씩 총 3회 투석합니다. 투석 후, 용리액(EIT)을 멸균된 0.45 µm 시린지 필터로 여과한 다음, 100 µL씩 5개의 샘플로 분주하여 액체 질소로 급속 냉동합니다.각 100 µL 분주액당 총 단백질 양은 0.5에서 1 µg/mL가 되어야 합니다. 단백질의 침습성을 평가하려면 수용 세포인 SH SY 5Y 인간 신경아세포종 세포가 포함된 24웰 플레이트의 각 웰에 5~10 µg/mL의 표지된 재조합 Disc1 단백질이 포함된 배지를 첨가하십시오. 수용성 GFP 태그가 부착된 Disc1 C-말단이 지속적으로 발현되는 멸균 유리 커버슬립 위에서 48~72시간 동안 배양하십시오.세포 외 형광을 소광하고 agri zone 처리 세포와 동일한 방식으로 세포를 고정 및 마운트한 후, Z-stack 이미징을 통해 외생적으로 투여된 재조합 단백질의 침투를 확인합니다. 라벨링된 단백질이 흡수되면, 공초점 현미경으로 생성된 이미지에서 수용 세포의 경계 내에서 검출됩니다. 이 Z-stack은 220 nm 간격의 24단계로 약 5 µm의 깊이를 포함합니다.여기서 빨간색으로 표시된 재조합 disc one 단편 5 98 to 7 85가 녹색으로 표시된 가용성 C-말단 GFP 태그 disc one을 발현하는 수용 세포에 의해 섭취되어, disc one 단백질 응집체의 침투성을 결정합니다. MRFP 태그가 붙은 전장 disc one으로 구성된 agro zone은 NLF 세포에서 정제되었으며, 이 프로토콜에 설명된 대로 수용 SH SY five Y 세포에 적용되었습니다. 여기에서 보는 바와 같이, A-M-R-F-P 태그 disc one acrosome이 가용성 GFP 태그 C-말단 disc one을 발현하는 인간 신경모세포종 SH SY five Y 세포로 침투하였습니다.또한, MRFP 태그가 붙은 disc one asome은 용해성 GFP 태그 disc one을 불용성 응집체로 끌어들일 수 있었습니다. DIA light로 표지된 재조합 disc one의 침습성을 결정하기 위해, 여기에서 보는 바와 같이 용해성 GFP disc one을 발현하는 SH SY five Y 신경모세포종 세포에 이를 처리하였습니다. 빨간색으로 표시된 재조합 disc one 단백질 말터가 수용 세포로 침습하였습니다. 노란색 점은 용해성 GFP 태그 C-말단 disc one이 응집체로 끌어들여진 것을 나타냅니다. E. coli에서 발현 및 정제된 표지 재조합 disc one 또한 다량체 단백질을 쥐의 내측 전전두엽 피질에 입체 정위 주입했을 때 생체 내 뉴런에 대해 세포 침습성을 보였습니다. Z-stack 이미징을 통해 뉴런 핵 항체로 염색된 쥐의 피질 뉴런 내에 재조합 disc one 단백질이 존재함을 확인하였습니다.우리는 세포 침습 연구를 위한 disc one 응집체를 생성하는 두 가지 방법을 보여드렸습니다. 이 두 가지 방법 중 어느 것을 사용하더라도, 외래 DNA의 형질전환을 통한 재조합 유전자 발현이라는 잠재적인 혼란 변수 없이 disc one 응집체 섭취의 세포적 영향을 조사할 수 있습니다. 이러한 기술은 세포 내 in vitro 실험에서의 disc one 단백질 병증의 생물학적 영향을 조사하거나, 동물 모델에서의 뇌내 접종 또는 기타 투여를 통한 in vivo 실험에 적용될 수 있습니다.우리는 각 특정 단백질에 맞게 프로토콜을 약간 수정한다면, 이러한 기술들이 결과적으로 다른 단백질 응집체에도 적용될 수 있을 것이라고 확신합니다. 이 절차를 수행할 때, 공초점 현미경 이미지의 면밀한 분석을 위해 충분한 시간을 할애하십시오.

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