안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

이 절차의 전반적인 목표는 내부 정류기 칼륨 채널의 활성을 조절하는 새로운 화합물을 발견하는 것입니다. 이는 유도성 테트라사이클린(tetracycline) HK 2 9 3 세포를 먼저 도금하여 관심 KIR 채널을 384 웰 플레이트로 발현함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 독감이라는 형광 탈륨 리포터 염료를 세포에 2개로 주입하는 것입니다.

다음으로, 비혼입 염료를 세포에서 세척하고 차량 제어 또는 테스트 화합물을 포함하는 분석 버퍼로 교체합니다. 마지막 단계는 우물에 자극 완충액을 추가하여 탈륨 플럭스를 시작하는 것입니다. 궁극적으로 형광 플레이트 리더는 KIR 채널을 통한 탈륨 이온의 이동을 변화시키는 화합물을 식별하는 데 사용됩니다. 가난한.

수동 패치 클램프 전기 생리학과 같은 기존 기술에 비해 이 방법의 주요 장점은 조사자가 수백 개의 실험을 동시에 수행하고 매일 수천 개의 실험을 수행할 수 있다는 것입니다. 이 방법을 통해 연구자는 수천 개의 작은 분자 라이브러리를 스크리닝하여 내부 정류 칼륨 채널의 조절자를 발견할 수 있습니다.탈륨 플럭스 실험 하루 전에 세포를 해리하고 함께 제공된 원고에 설명된 대로 세포 현탁액의 밀도를 정량화합니다. 다음으로, 10% 투석된 FBS 플레이트 20, 000 단클론 세포를 포함하는 BH 배지를 사용하여 BD 순수 코트 Amin 코팅 384 웰 플레이트의 각 웰에 관심 있는 KIR 채널 유전자로 안정적으로 transfection한 다음 날 thermo multi drop combi 또는 다중 채널 피펫을 사용하여 현미경으로 플레이트를 검사하여 세포가 부착되어 웰 바닥에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.

그런 다음 ELX 4 0 5 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 세포 배양 배지를 HBSS 분석으로 교체합니다. 웰당 20마이크로리터의 버퍼. 그 후, 튜브를 잠시 원심 분리하여 50마이크로그램의 독감을 100마이크로리터의 무수 DMSO에 두 개의 분말에 용해시켜 오전 2:00 D 로딩 용액으로 독감을 준비합니다.

이제 염료에 부피 당 20 % 중량의 50 마이크로 리터를 추가합니다 Onic F1 27 DMSO 용액. 부드럽게 피펫팅하여 섞습니다. 그런 다음 오전 2:00에 150마이크로리터의 독감을 추가하고 F1 27-35밀리리터의 HBSS 분석을 추가하고 완충하고 부드럽게 혼합합니다.

다음으로, 이미 20마이크로리터의 HBSS 분석이 포함된 각 웰에 20마이크로리터의 염료 로딩 버퍼를 추가합니다. 완충기. 세포에 염료가 로딩되는 동안 약 1시간 동안 실온에서 세포를 배양합니다. 0.5g의 중탄산나트륨을 50ml의 5 x 탈륨 자극 완충액에 갓 용해시켜 탈륨 자극판을 준비합니다.

그런 다음 50 마이크로 리터의 용액을 폴리 프로필렌 384 웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다 세포가 오전 2:00에 독감으로 적재 된 후. ELX 4 0 5 마이크로플레이트 와셔로 플레이트를 세척합니다. 다음으로, 20마이크로리터 또는 40마이크로리터의 HBSS 분석을 추가합니다. 버퍼를 각 웰로 다시 버퍼링하면 플레이트가 이제 실험을 위한 준비가 된 것입니다.

탈륨 및 세포 플레이트를 Hema Matsu 기능성 약물 스크리닝 시스템 또는 액체 분주 기능이 통합된 동급의 동요 이미징 플레이트 리더에 로드하고 flu oh four와 같은 플루오레세인 기반 염료에 적합한 필터를 사용합니다. 그 후, 40마이크로리터의 HBSS 분석 완충액을 포함하는 세포 플레이트의 해당 웰에 10마이크로리터의 5X 탈륨 시리즈를 추가하는 단일 추가 프로토콜을 설정합니다. 그런 다음 최소 10초 동안 1Hz 샘플링 주파수에서 기준선 형광을 기록합니다.

well-well 형광은 최적의 cell plating, washing 및 d loading 조건이 설정되면 플레이트 전체에 걸쳐 균일하고 안정적이어야 합니다. 그 동안, 통합 384 채널 피펫터를 사용하여 탈륨 자극 버퍼를 각 웰에 동시에 추가하고 최소 2분 동안 기록을 계속하여 탈륨으로 인한 형광 증가의 속도와 피크가 오프라인 분석을 위해 캡처되도록 합니다. 다음 일련의 실험에서는 384웰 플레이트의 각 열과 행의 다른 모든 웰에 대조군 억제제를 도금하여 분석의 균일성과 재현성을 평가하고 DMSO를 차량 대조군으로 다른 웰에 추가합니다.

멀티채널 피펫터를 사용합니다. 웰당 80마이크로리터 및 0.1% DMSO 비히클에서 이전에 측정된 농도로 타겟 KIR 채널의 억제제를 384웰 폴리프로필렌 플레이트에 피펫팅하여 복합 DMSO 플레이트를 만듭니다. 이것은 잘 A, 1에서 시작하여 웰 B, 2, 이런 식으로 웰 B 24까지 알려진 억제제를 추가함으로써 수행됩니다.

웰 A 24에서 시작하는 DMSO를 사용하여 이 절차를 반복합니다. 이제 세포, 화합물 및 탈륨 자극 플레이트를 플레이트 리더에 로드합니다. 그런 다음 20마이크로리터의 HBSS 분석 완충액이 포함된 세포판의 해당 웰에 2개의 X 농도 화합물 시리즈 20마이크로리터를 추가하도록 2개의 추가 프로토콜을 설정합니다.

화합물을 세포 플레이트에 추가하고 실온에서 최대 20분 동안 배양합니다. 기준선 독감을 최소 10초 동안 두 번의 형광으로 기록합니다. 그런 다음 10마이크로리터의 5 x 탈륨 완충액을 세포 플레이트의 각 웰에 추가합니다.

이후 3일 동안 실험을 반복하여 결과의 재현성을 확인합니다. DMSO 및 약물 처리 세포에서 탈륨 플럭스를 사용하여 Z 프라임 값을 계산합니다. 우물의 두 모집단 간의 우물에서 우물 간 변동성에 대한 통계적 측정은 P와 N의 평균과 표준 편차를 기반으로 이 공식을 사용하여 Z 프라임을 계산하며, 여기서 P는 억제되지 않은 플럭스 값이고 N은 완전히 억제된 플럭스 값입니다.

3일 동안 ZPrime 값이 0.5 이상인 분석은 고처리량 스크리닝에 적합한 것으로 간주됩니다. 이 그림은 다양한 유형의 실험에 사용되는 세포 도금 맵의 몇 가지 예입니다. un induced 또는 tetracycline induced cell을 포함하는 well의 위치는 서로 다른 색상으로 표시됩니다.

이 그림은 분석 개발 및 화합물 스크리닝을 위한 최적의 탈륨 농도를 결정하는 데 사용되는 소스 플레이트 맵을 보여줍니다. 색상 구배는 100%에서 0.002%탈륨 범위의 3중 희석 계열을 나타내며, 다음은 낮은 탈륨 플럭스 값에서 높은 탈륨 플럭스 값을 나타내는 차가운 색에서 뜨거운 색의 대표적인 형광 강도 맵입니다. 탈륨 CRC에 대한 4개의 매개변수 로지스틱 함수가 피팅된 여기에 표시된 셀 도금 맵은 15% 탈륨의 EEC 80 값을 결정하는 데 사용됩니다.

이 그림은 분석의 DMSO 허용 오차를 결정하는 데 사용되는 소스 플레이트 맵을 보여줍니다. 열 1과 24에는 분석 버퍼만 포함되어 있는 반면, 색상 구배는 10%에서 0.01%DMSO 범위의 2중 희석 시리즈를 나타내며, 다음은 더 진한 파란색으로 표시된 낮은 탈륨 플럭스 값을 가진 대표적인 형광 강도 맵입니다. 표시된 농도의 DMSO를 포함하는 우물에서 기록된 평균 탈륨 플럭스 값이 여기에 요약되어 있습니다.

이제 이 그림은 KIR 채널의 알려진 억제제에 대한 농도 반응 곡선을 설정하는 데 사용되는 소스 플레이트 맵을 보여줍니다. 각 화합물은 다른 색상으로 표시되며 일반적으로 3중 희석 시리즈로 도금됩니다. 대표적인 형광 강도 맵이 여기에 나와 있으며, 이 그림은 개발 및 최적화 후 탈륨 플럭스 바이인 억제제의 용량 의존적 억제를 보여줍니다.

탈륨 플럭스 분석은 다양한 일상적인 약리학 분석을 수행하는 데에도 사용할 수 있습니다. 탈륨 플럭스 분석은 이전에 전압 및 결찰된 칼륨 채널, 비선택적 양이온 채널 및 칼륨 수송체와 함께 사용하도록 조정되었습니다. 텔륨으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 사용 및 적절한 폐기물 처리와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.