Name: 안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 학습하세요 안쪽 정류기 칼륨(Kir) 채널 활성을 측정하는 정량적 형광 분석법을 개발하고 검증하는 방법을. 이 고처리량 검사법은 신경과학 및 약리학 연구에서 새로운 치료제 후보 화합물을 발굴하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 건강 보조금 1R21NS073097-01과 1R01DK082884 (JSD)과 국립 연구소 부여 PIER11VCTR에 대한 재단의 국립 연구소에서 자금에 의해 지원되었다.

<ol><li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).</li>
<li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K%2B+channels%3A+recent+advances+and+future+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757(2010).</li>
<li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213(2007).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291(1998).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin%3A+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).</li>
<li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain%3A+a+Mount+Everest+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764(2010).</li>
<li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thallium-sensitive%2C+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671(2004).</li>
<li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094(2009).</li>
<li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1%2C+the+renal+outer+medullary+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).</li>
<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
<li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

데이터 치료 : 일단 데이터가 분석에 일반적인 단계는 실험, F 0 초에 초기 값으로 각도의 형광 반응, F를 정규화, 포함한다 수집하고 있습니다. 이것은 일반적으로 &quot;정적 비율&quot;로 지칭하고 &quot;F / F 0&quot;상징합니다. F 0 표시기 염료에 의해 ​​지배되는 경우에는 정적 비율 작업이 실질적으로 같은 조명, 신호 컬렉션에 disuniformities 등 여러 요인에 대한 해결됩니다 그리고 핸드폰 번호. 배경이 적절하게 고정 비율을 계산 이전에 처리 할 수​​ 있습니다하지 않는 한 염료 신호가 약한 또는 시스템의 배경 형광 또는 반사가 높은 경우, 정적 비율은 적용되지 않습니다. 데이터 정규화 후 활동을 수량화하고 조회를 선택하는 데 사용됩니다 하나의 값으로 형광 파형을 줄이기 위해 일반적입니다. 가장 일반적으로이 문제는 데이터를 맞는하여 수행됩니다TL의 추가 + e...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> 테트라 사이클린-inducible 표현 벡터 </td></tr><tr><td> T-렉스 - HEK293 세포 </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> 테트라 사이클린-inducible 세포 라인 </td></tr><tr><td> Lipofectamine LTX / 플러스 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Transfection 시약 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11550 </td><td> 세포 배양 미디어 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11,965 </td><td> 세포 배양 미디어 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> 세포 배양 미디어 </td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> 세포 배양 미디어 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15,140 </td><td> 세포 배양 미디어 </td></tr><tr><td> 무료 HBSS - 이가의 </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> 셀 세척 </td></tr><tr><td> 트립신 - 0.25 % </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> 세포 분리 </td></tr><tr><td> 테트라 사이클린-HCL </td><td> 시그마 </td><td> T9823 </td><td> 유도 시약 </td></tr><tr><td> Dialyzed FBS </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S12650 </td><td> 도금 미디어 </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> 형광 염료 </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> 염료로드 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14,175 </td><td> 검정 버퍼 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15,630 </td><td> 검정 버퍼 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 시그마 </td><td> S6297 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 시그마 </td><td> M2643 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> 카소 4 • 2H 2 O </td><td> 시그마 </td><td> C3771 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> D-포도당 </td><td> 시그마 </td><td> G7528 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> 탈륨 황산 </td><td> 올드리치 </td><td> 204625 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 </td><td> H4034 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 시그마 </td><td> D4540 </td><td> 용제 </td></tr><tr><td> 여덟 채널 전자 pipettor </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> 384에서 셀 도금 -잘 접시 </td></tr><tr><td> BD PureCoat 아민 - 코팅 384 잘 접시 </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> 검정 microplates </td></tr><tr><td> 에코는 384 자 폴리 프로필렌 microplate (384PP)를 자격 </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> 합성 소스 microplates </td></tr><tr><td> 384도 폴리 프로필렌 microplates </td><td> Greiner 바이오 하나 </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop 콤비 시약 디스펜서 </td><td> 열 과학 </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 microplate 와셔 </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> 자동 셀 세척 </td></tr><tr><td> 액체 처리기를 반향 </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte 에코 550 </td><td></td></tr><tr><td> 브라보, 자동화 된 액체 처리 플랫폼 </td><td> 애질런트 테크놀로지스 </td><td> 표준 모델 </td><td></td></tr><tr><td> Hamama츠 FDSS 6000 </td><td> 하마 마츠 </td><td></td><td> 운동 이미징 플레이트 판독기 </td></tr></tbody></table> 표 1. 재료 및 시약의 목록입니다.

안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

안쪽 정류기의 칼륨 (Kir) 채널 가족의 특정 구성원은 고혈압, 심방 세동과 통증 1,2 등의 질환의 다양한에 대한 약물 목표를 postulated 있습니다. 대부분의 경우, 그러나, 자신의 치료 가능성이나 기본적인 생리 기능을 이해하는 방향으로 진행 좋은 약리 도구의 부족에 의해 느려졌습니다. 사실, 안쪽 정류기 제품군의 분자 약리학 훨씬 nanomolar 화성과 매우 선택적 펩타이드 독소의 변조기의 번호가 3 발견되었습니다 된 전압 개폐 칼륨 (KV) 채널의 S4 superfamily의 뒤에 느껴지있다. 벌 독이 독소의 tertiapin 및 파생 4,5 Kir1.1와 Kir3 채널의 강력한 억제제하지만, 펩티드는 실험적으로 therapeutically뿐만 아니라 제한된 용도의 antigenic 속성과 가난한 생체 이용률, 신진 대사 안정성과 조직 penetrance로 인해 수 있습니다. 강력한 개발향상된 약리 특성을 가진 선택적 작은 분자 프로브는 완전히 생리학과 Kir 채널 치료 가능성을 이해하는 열쇠가 될 것이다. 학술 과학자들은 더 나은 약리학 6 필요로하는 분자 표적 및 신호 전달 경로에 대한 프로브 발견 캠페인을 시작하기 위해 국립 보건원에서 지원하는 분자 도서관 프로브 제작 센터 네트워크 (MLPCN (주) NIH) 공통 기금은 기회를 만들었습니다. MLPCN는 연구자에게 산업 규모 검진 센터, 의약 화학, 정보학은 유전자와 유전자 네트워크의 기능을 명료하게하다하는 작은 분자 프로브를 개발 지원에 대한 액세스를 제공합니다. MLPCN에 항목을 얻을의 중요한 단계는 높은 처리량 검사 (HTS)에 대한 의무입니다 강력한 대상 또는 경로 별 분석의 개발입니다. 여기, 우리는 형광 기반의 탈륨 (TL +) 자속 assa을 개발하는 방법에 대해 설명합니다높은 처리량 화합물 심사 7,8,9,10에 대한 Kir 채널 기능의 y는. 분석은 K의 투자율 + K + congener TL +에 채널 기공을 기반으로합니다. 상업적으로 이용 가능한 형광 TL + 기자 염료가 모공을 통해 TL의 transmembrane 유량을 + 감지하는 데 사용됩니다. BTC, FluoZin-2 및 FluxOR 7,8 : TL + 자속 assays에 적합 적어도 세 상업적으로 이용 가능한 염료가 있습니다. 이 프로토콜은 FluoZin-2를 사용하여 분석 개발에 대해 설명합니다. 원래 개발 및 아연 표시로 판매했지만, FluoZin-2 전시 TL시 형광 방출 + 바인딩에 강력하고 복용 종속적 인 증가합니다. 우리는 FluxOR는 7,8 사용할 수 등 9,10 할 계속하기 전에 FluoZin-2와 협력하기 시작했습니다. 그러나, 분석 개발 단계는 세 염료에 본질적으로 동일하며, 사용자는 자신의 특정 N에 가장 적합한 어떤 염료 확인해야합니다eeds. 우리는 또한 MLPCN에 항목으로 간주 할 수에 도달해야합니다 검정의 성능 벤치 마크에 대해 설명합니다. TL +는 쉽게 대부분의 K + 채널을 permeates 때문에, 분석은 대부분의 K + 채널 대상에 적용해야합니다.

테트라 사이클린-inducible 표현 시스템의 사용은 내생 경로와 관심 Kir 채널을 통해 TL + 자속을 구별하기에 편리한 내부 통제를 제공합니다. 그림 1 쇼 실험의 다른 유형에 사용되는 셀 도금지도의 예. uninduced 또는 테트라 사이클린 - 유도 세포를 포함하는 우물의 위치는 서로 다른 색상으로 표시됩니다. 그림 2A는 분석 개발과 화합물 심사에 대한 최적의 TL + 농도를 결정하는 데 사용되는 소스 판지도를 보여줍니다. 색상 그라디언트는 100 %에서 0.002 % TL에 이르기까지 3 배 희석 시리즈를 나타냅니다 +. 대표 형광 강도의지도는 + 플럭스 값은 각각 낮은 - 투 - 높은 TL을 나타내는 멋진 - 투 - 따뜻한 색상으로, 그림 2B에 표시됩니다. 그림 1C에 표시된 셀 도금 맵이 실험에 사용되었다. t...

안쪽 정류기의 칼륨 (Kir) 높은 처리량 화합물 심사에 대한 채널의 활동을 측정하기위한 양적 형광 분석을 개발하고 검증하기위한 방법이 제공됩니다.

내향 정류 칼륨(Kir) 채널 패밀리의 특정 구성원들은 고혈압을 포함한 다양한 질환의 약물 표적일 것으로 추정됩니다.

이 절차의 전반적인 목표는 내향 정류성 칼륨 채널의 활성을 조절하는 새로운 화합물을 발견하는 것입니다. 이를 위해 먼저 관심 있는 KIR 채널을 발현하는 테트라사이클린 유도성 HK 2 9 3 세포를 384 웰 플레이트에 분주합니다. 두 번째 단계는 flu in two라고 불리는 형광 탈륨 리포터 염료를 세포에 로딩하는 것입니다.다음으로, 결합되지 않은 염료를 세포에서 세척하고, vehicle 대조군 또는 테스트 화합물이 포함된 분석 버퍼로 교체합니다. 마지막 단계는 thallium flux를 유도하기 위해 웰에 자극 버퍼를 첨가하는 것입니다. 최종적으로, 형광 플레이트 리더를 사용하여 KIR 채널을 통한 thallium 이온의 이동을 변화시키는 화합물을 식별합니다.Poor.수동 패치 클램프 전기생리학과 같은 기존 기술과 비교하여 이 방법의 주요 장점은 연구자가 수백 개의 실험을 동시에 수행하고 매일 수천 개의 실험을 진행할 수 있다는 점입니다. 이 방법을 통해 연구자는 수천 개의 소분자 라이브러리를 스크리닝하여 내향 정류 칼륨 채널의 조절제를 발견할 수 있습니다. 탈륨 플럭스 실험 하루 전, 동반된 원고에 설명된 대로 세포를 분리하고 세포 현탁액의 밀도를 정량화하십시오. 다음으로, 10% 투석 FBS가 포함된 BH 배지를 사용하여, Thermo Multi Drop Combi 또는 멀티 채널 피펫을 이용해 관심 있는 KIR 채널 유전자가 안정적으로 형질전환된 단클론 세포 20,000개를 BD Pure Coat Amin 코팅 384웰 플레이트의 각 웰에 분주하십시오. 다음 날, 현미경으로 플레이트를 관찰하여 세포가 웰 바닥에 부착되어 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오.그런 다음 ELX 4 0 5 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 세포 배양 배지를 웰당 20 µL의 HBSS 분석 버퍼로 교체합니다. 그 후, 50 µg의 flus in two 분말을 100 µL의 무수 DMSO에 녹이기 위해 튜브를 짧게 원심 분리하여 2:00 AM D 로딩 솔루션 내의 flus를 준비합니다.이제 20% weight per volume onic F1 27 DMSO 용액 50 µL를 염료에 추가합니다. 파이펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 2:00 AM onic F1 27 flus 150 µL를 35 mL의 HBSS assay buffer에 추가하고 부드럽게 혼합합니다.다음으로, 20 µL의 HBSS assay.Buffer가 이

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생물학

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