Name: 안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 학습하세요 안쪽 정류기 칼륨(Kir) 채널 활성을 측정하는 정량적 형광 분석법을 개발하고 검증하는 방법을. 이 고처리량 검사법은 신경과학 및 약리학 연구에서 새로운 치료제 후보 화합물을 발굴하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 건강 보조금 1R21NS073097-01과 1R01DK082884 (JSD)과 국립 연구소 부여 PIER11VCTR에 대한 재단의 국립 연구소에서 자금에 의해 지원되었다.

<ol><li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).</li>
<li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K%2B+channels%3A+recent+advances+and+future+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757(2010).</li>
<li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213(2007).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291(1998).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin%3A+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).</li>
<li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain%3A+a+Mount+Everest+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764(2010).</li>
<li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thallium-sensitive%2C+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671(2004).</li>
<li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094(2009).</li>
<li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1%2C+the+renal+outer+medullary+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).</li>
<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
<li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

데이터 치료 : 일단 데이터가 분석에 일반적인 단계는 실험, F 0 초에 초기 값으로 각도의 형광 반응, F를 정규화, 포함한다 수집하고 있습니다. 이것은 일반적으로 &quot;정적 비율&quot;로 지칭하고 &quot;F / F 0&quot;상징합니다. F 0 표시기 염료에 의해 ​​지배되는 경우에는 정적 비율 작업이 실질적으로 같은 조명, 신호 컬렉션에 disuniformities 등 여러 요인에 대한 해결됩니다 그리고 핸드폰 번호. 배경이 적절하게 고정 비율을 계산 이전에 처리 할 수​​ 있습니다하지 않는 한 염료 신호가 약한 또는 시스템의 배경 형광 또는 반사가 높은 경우, 정적 비율은 적용되지 않습니다. 데이터 정규화 후 활동을 수량화하고 조회를 선택하는 데 사용됩니다 하나의 값으로 형광 파형을 줄이기 위해 일반적입니다. 가장 일반적으로이 문제는 데이터를 맞는하여 수행됩니다TL의 추가 + e...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

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Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> 테트라 사이클린-inducible 표현 벡터 </td></tr><tr><td> T-렉스 - HEK293 세포 </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> 테트라 사이클린-inducible 세포 라인 </td></tr><tr><td> Lipofectamine LTX / 플러스 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Transfection 시약 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11550 </td><td> 세포 배양 미디어 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11,965 </td><td> 세포 배양 미디어 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> 세포 배양 미디어 </td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> 세포 배양 미디어 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15,140 </td><td> 세포 배양 미디어 </td></tr><tr><td> 무료 HBSS - 이가의 </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> 셀 세척 </td></tr><tr><td> 트립신 - 0.25 % </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> 세포 분리 </td></tr><tr><td> 테트라 사이클린-HCL </td><td> 시그마 </td><td> T9823 </td><td> 유도 시약 </td></tr><tr><td> Dialyzed FBS </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S12650 </td><td> 도금 미디어 </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> 형광 염료 </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> 염료로드 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14,175 </td><td> 검정 버퍼 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15,630 </td><td> 검정 버퍼 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 시그마 </td><td> S6297 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 시그마 </td><td> M2643 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> 카소 4 • 2H 2 O </td><td> 시그마 </td><td> C3771 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> D-포도당 </td><td> 시그마 </td><td> G7528 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> 탈륨 황산 </td><td> 올드리치 </td><td> 204625 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 </td><td> H4034 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 시그마 </td><td> D4540 </td><td> 용제 </td></tr><tr><td> 여덟 채널 전자 pipettor </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> 384에서 셀 도금 -잘 접시 </td></tr><tr><td> BD PureCoat 아민 - 코팅 384 잘 접시 </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> 검정 microplates </td></tr><tr><td> 에코는 384 자 폴리 프로필렌 microplate (384PP)를 자격 </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> 합성 소스 microplates </td></tr><tr><td> 384도 폴리 프로필렌 microplates </td><td> Greiner 바이오 하나 </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop 콤비 시약 디스펜서 </td><td> 열 과학 </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 microplate 와셔 </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> 자동 셀 세척 </td></tr><tr><td> 액체 처리기를 반향 </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte 에코 550 </td><td></td></tr><tr><td> 브라보, 자동화 된 액체 처리 플랫폼 </td><td> 애질런트 테크놀로지스 </td><td> 표준 모델 </td><td></td></tr><tr><td> Hamama츠 FDSS 6000 </td><td> 하마 마츠 </td><td></td><td> 운동 이미징 플레이트 판독기 </td></tr></tbody></table> 표 1. 재료 및 시약의 목록입니다.

안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

안쪽 정류기의 칼륨 (Kir) 채널 가족의 특정 구성원은 고혈압, 심방 세동과 통증 1,2 등의 질환의 다양한에 대한 약물 목표를 postulated 있습니다. 대부분의 경우, 그러나, 자신의 치료 가능성이나 기본적인 생리 기능을 이해하는 방향으로 진행 좋은 약리 도구의 부족에 의해 느려졌습니다. 사실, 안쪽 정류기 제품군의 분자 약리학 훨씬 nanomolar 화성과 매우 선택적 펩타이드 독소의 변조기의 번호가 3 발견되었습니다 된 전압 개폐 칼륨 (KV) 채널의 S4 superfamily의 뒤에 느껴지있다. 벌 독이 독소의 tertiapin 및 파생 4,5 Kir1.1와 Kir3 채널의 강력한 억제제하지만, 펩티드는 실험적으로 therapeutically뿐만 아니라 제한된 용도의 antigenic 속성과 가난한 생체 이용률, 신진 대사 안정성과 조직 penetrance로 인해 수 있습니다. 강력한 개발향상된 약리 특성을 가진 선택적 작은 분자 프로브는 완전히 생리학과 Kir 채널 치료 가능성을 이해하는 열쇠가 될 것이다. 학술 과학자들은 더 나은 약리학 6 필요로하는 분자 표적 및 신호 전달 경로에 대한 프로브 발견 캠페인을 시작하기 위해 국립 보건원에서 지원하는 분자 도서관 프로브 제작 센터 네트워크 (MLPCN (주) NIH) 공통 기금은 기회를 만들었습니다. MLPCN는 연구자에게 산업 규모 검진 센터, 의약 화학, 정보학은 유전자와 유전자 네트워크의 기능을 명료하게하다하는 작은 분자 프로브를 개발 지원에 대한 액세스를 제공합니다. MLPCN에 항목을 얻을의 중요한 단계는 높은 처리량 검사 (HTS)에 대한 의무입니다 강력한 대상 또는 경로 별 분석의 개발입니다. 여기, 우리는 형광 기반의 탈륨 (TL +) 자속 assa을 개발하는 방법에 대해 설명합니다높은 처리량 화합물 심사 7,8,9,10에 대한 Kir 채널 기능의 y는. 분석은 K의 투자율 + K + congener TL +에 채널 기공을 기반으로합니다. 상업적으로 이용 가능한 형광 TL + 기자 염료가 모공을 통해 TL의 transmembrane 유량을 + 감지하는 데 사용됩니다. BTC, FluoZin-2 및 FluxOR 7,8 : TL + 자속 assays에 적합 적어도 세 상업적으로 이용 가능한 염료가 있습니다. 이 프로토콜은 FluoZin-2를 사용하여 분석 개발에 대해 설명합니다. 원래 개발 및 아연 표시로 판매했지만, FluoZin-2 전시 TL시 형광 방출 + 바인딩에 강력하고 복용 종속적 인 증가합니다. 우리는 FluxOR는 7,8 사용할 수 등 9,10 할 계속하기 전에 FluoZin-2와 협력하기 시작했습니다. 그러나, 분석 개발 단계는 세 염료에 본질적으로 동일하며, 사용자는 자신의 특정 N에 가장 적합한 어떤 염료 확인해야합니다eeds. 우리는 또한 MLPCN에 항목으로 간주 할 수에 도달해야합니다 검정의 성능 벤치 마크에 대해 설명합니다. TL +는 쉽게 대부분의 K + 채널을 permeates 때문에, 분석은 대부분의 K + 채널 대상에 적용해야합니다.

테트라 사이클린-inducible 표현 시스템의 사용은 내생 경로와 관심 Kir 채널을 통해 TL + 자속을 구별하기에 편리한 내부 통제를 제공합니다. 그림 1 쇼 실험의 다른 유형에 사용되는 셀 도금지도의 예. uninduced 또는 테트라 사이클린 - 유도 세포를 포함하는 우물의 위치는 서로 다른 색상으로 표시됩니다. 그림 2A는 분석 개발과 화합물 심사에 대한 최적의 TL + 농도를 결정하는 데 사용되는 소스 판지도를 보여줍니다. 색상 그라디언트는 100 %에서 0.002 % TL에 이르기까지 3 배 희석 시리즈를 나타냅니다 +. 대표 형광 강도의지도는 + 플럭스 값은 각각 낮은 - 투 - 높은 TL을 나타내는 멋진 - 투 - 따뜻한 색상으로, 그림 2B에 표시됩니다. 그림 1C에 표시된 셀 도금 맵이 실험에 사용되었다. t...

안쪽 정류기의 칼륨 (Kir) 높은 처리량 화합물 심사에 대한 채널의 활동을 측정하기위한 양적 형광 분석을 개발하고 검증하기위한 방법이 제공됩니다.

내향 정류 칼륨(Kir) 채널 패밀리의 특정 구성원들은 고혈압을 포함한 다양한 질환의 약물 표적일 것으로 추정됩니다.

이 절차의 전반적인 목표는 내향 정류성 칼륨 채널의 활성을 조절하는 새로운 화합물을 발견하는 것입니다. 이를 위해 먼저 관심 있는 KIR 채널을 발현하는 테트라사이클린 유도성 HK 2 9 3 세포를 384 웰 플레이트에 분주합니다. 두 번째 단계는 flu in two라고 불리는 형광 탈륨 리포터 염료를 세포에 로딩하는 것입니다.다음으로, 결합되지 않은 염료를 세포에서 세척하고, vehicle 대조군 또는 테스트 화합물이 포함된 분석 버퍼로 교체합니다. 마지막 단계는 thallium flux를 유도하기 위해 웰에 자극 버퍼를 첨가하는 것입니다. 최종적으로, 형광 플레이트 리더를 사용하여 KIR 채널을 통한 thallium 이온의 이동을 변화시키는 화합물을 식별합니다.Poor.수동 패치 클램프 전기생리학과 같은 기존 기술과 비교하여 이 방법의 주요 장점은 연구자가 수백 개의 실험을 동시에 수행하고 매일 수천 개의 실험을 진행할 수 있다는 점입니다. 이 방법을 통해 연구자는 수천 개의 소분자 라이브러리를 스크리닝하여 내향 정류 칼륨 채널의 조절제를 발견할 수 있습니다. 탈륨 플럭스 실험 하루 전, 동반된 원고에 설명된 대로 세포를 분리하고 세포 현탁액의 밀도를 정량화하십시오. 다음으로, 10% 투석 FBS가 포함된 BH 배지를 사용하여, Thermo Multi Drop Combi 또는 멀티 채널 피펫을 이용해 관심 있는 KIR 채널 유전자가 안정적으로 형질전환된 단클론 세포 20,000개를 BD Pure Coat Amin 코팅 384웰 플레이트의 각 웰에 분주하십시오. 다음 날, 현미경으로 플레이트를 관찰하여 세포가 웰 바닥에 부착되어 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오.그런 다음 ELX 4 0 5 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 세포 배양 배지를 웰당 20 µL의 HBSS 분석 버퍼로 교체합니다. 그 후, 50 µg의 flus in two 분말을 100 µL의 무수 DMSO에 녹이기 위해 튜브를 짧게 원심 분리하여 2:00 AM D 로딩 솔루션 내의 flus를 준비합니다.이제 20% weight per volume onic F1 27 DMSO 용액 50 µL를 염료에 추가합니다. 파이펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 2:00 AM onic F1 27 flus 150 µL를 35 mL의 HBSS assay buffer에 추가하고 부드럽게 혼합합니다.다음으로, 20 µL의 HBSS assay.Buffer가 이미 들어 있는 각 웰에 20 µL의 염료 로딩 버퍼(dye loading buffer)를 추가합니다. 세포가 염료를 흡수할 수 있도록 상온에서 약 1시간 동안 배양합니다. 0.5 g의 탄산수소나트륨을 50 mL의 5x thallium stimulus buffer에 새로 녹여 thallium 자극 플레이트를 준비합니다.그 다음, 폴리프로필렌 384 웰 플레이트의 각 웰에 용액 50 µL를 첨가합니다. 세포에 형광 물질이 로딩된 후, ELX 405 마이크로플레이트 워셔를 사용하여 플레이트를 세척합니다. 이어서, 각 웰에 HBSS assay Buffer 20 µL 또는 40 µL를 다시 첨가하면 실험 준비가 완료됩니다.탈륨 플레이트와 세포 플레이트를 액체 분주 기능이 통합된 Hema Matsu 기능적 약물 스크리닝 시스템 또는 이에 상응하는 키네틱 이미징 플레이트 리더에 로드하고, flu oh four와 같은 플루오레신 기반 염료에 적합한 필터를 사용하십시오. 그 후, 40 µL의 HBSS 분석 버퍼가 포함된 세포 플레이트의 해당 웰에 5X 탈륨 시리즈 10 µL를 첨가하는 싱글 애드(single add) 프로토콜을 설정하십시오. 그런 다음 1 Hz 샘플링 빈도로 최소 10초 동안 기저 형광을 기록하십시오.최적의 세포 플레이팅, 세척 및 로딩 조건이 설정되면 플레이트 전체에서 웰 간의 형광이 균일하고 안정적으로 나타나야 합니다. 그동안 통합된 384채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 탈륨 자극 버퍼를 동시에 첨가하고, 오프라인 분석을 위해 탈륨으로 유도된 형광 증가의 속도와 피크가 캡처될 수 있도록 최소 2분 동안 기록을 계속하십시오. 다음 일련의 실험에서는 384웰 플레이트의 각 열과 행의 매 두 번째 웰마다 대조군 억제제를 플레이팅하고, 나머지 웰에는 용매 대조군으로 DMSO를 첨가하여 분석의 균일성과 재현성을 평가하십시오.멀티채널 피펫을 사용하십시오. 이전에 결정된 농도의 타겟 KIR 채널 억제제 80 µL와 0.1% DMSO 용매를 384-웰 폴리프로필렌 플레이트에 분주하여 화합물 DMSO 플레이트를 제작합니다. 이는 A1 웰부터 시작하여 B2 웰까지 교대로, B24 웰까지 알려진 억제제를 추가함으로써 수행합니다.B1 웰부터 A24 웰까지 DMSO를 사용하여 이 절차를 반복합니다. 이제 세포 플레이트, 화합물 플레이트 및 thallium 자극 플레이트를 플레이트 리더에 로드합니다. 그런 다음 20 µL의 HBSS 분석 버퍼가 들어 있는 세포 플레이트의 해당 웰에 2X 농도의 화합물 시리즈 20 µL를 추가하는 투여 프로토콜을 설정합니다.화합물을 세포 플레이트에 첨가하고 실온에서 최대 20분 동안 배양합니다. 두 가지 형광의 기저 형광 값을 최소 10초 동안 기록합니다. 그 다음, 세포 플레이트의 각 웰에 5배 농도의 탈륨 버퍼 10 µL를 첨가합니다.결과의 재현성을 확립하기 위해 3일 연속으로 실험을 반복합니다. DMSO 내의 thallium flux와 약물 처리된 세포를 사용하여 Z prime 값을 계산합니다. 두 웰 집단 간의 웰 간 변동성에 대한 통계적 척도인 Z prime은 P와 N의 평균 및 표준편차를 기반으로 하며, 여기서 P는 억제되지 않은 flux 값이고 N은 완전히 억제된 flux 값입니다.3일의 서로 다른 날짜에 측정된 ZPrime 값이 0.5 이상인 분석법은 고속 대량 스크리닝에 적합한 것으로 간주됩니다. 이 그림들은 다양한 유형의 실험에서 사용되는 세포 플레이팅 맵의 몇 가지 예시입니다. 유도되지 않았거나 tetracycline으로 유도된 세포가 포함된 웰의 위치는 서로 다른 색상으로 표시되어 있습니다.이 그림은 분석법 개발 및 화합물 스크리닝을 위한 최적의 탈륨 농도를 결정하는 데 사용된 소스 플레이트 맵을 보여줍니다. 색상 그라데이션은 100%에서 0.002% 탈륨까지의 3배 희석 시리즈를 나타내며, 여기에는 낮은 탈륨 flux 값에서 높은 값까지를 나타내는 cool-to-hot 색상의 대표적인 형광 강도 맵이 제시되어 있습니다. 탈륨 CRC에 4-파라미터 로지스틱 함수를 피팅하여 보여주는 세포 플레이팅 맵은 15% 탈륨의 EEC 80 값을 결정하는 데 사용됩니다.이 그림은 분석법의 DMSO 내성을 결정하는 데 사용된 소스 플레이트 맵을 보여줍니다. 1번과 24번 열에는 분석 버퍼만 포함되어 있으며, 색상 그라데이션은 10%에서 0.01% DMSO까지의 2배 희석 시리즈를 나타냅니다. 여기에는 대표적인 형광 강도 맵이 제시되어 있으며, 낮은 thallium flux 값은 더 진한 파란색으로 표시됩니다. 표시된 DMSO 농도가 포함된 웰에서 기록된 평균 thallium flux 값이 여기에 요약되어 있습니다.이제 이 그림은 KIR 채널의 기지 억제제에 대한 농도 반응 곡선을 설정하는 데 사용된 소스 플레이트 맵을 보여줍니다. 각 화합물은 서로 다른 색상으로 표시되며, 일반적으로 3배 희석 시리즈로 플레이트에 분주됩니다. 여기에 대표적인 형광 강도 맵이 제시되어 있으며, 이 그림은 개발 및 최적화 이후 억제제에 의한 탈륨 플럭스의 용량 의존적 억제를 보여줍니다.탈륨 플럭스 분석법은 다양한 일상적인 약리학 분석을 수행하는 데에도 사용될 수 있습니다. 탈륨 플럭스 분석법은 이전에 전압 및 리간드 작동성 칼륨 채널, 비선택적 양이온 채널, 그리고 칼륨 수송체에 적용하여 사용한 바 있습니다. 탈륨을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑 착용 및 적절한 폐기물 처리와 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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여기, 우리는 순진 primed pluripotent 전환의 키나제 조절기에 대한 목표로 작은 분자 화면을 수행하는 양적 및 확장 프로토콜을 제시한다.

높은 처리량 억제제 스크리닝에 의한 배아 줄기 세포의 다 능성을 조절하는 키나제를 확인하는 간단한 방법

니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합 된 ATPase 분석제는 소분자 미오신 억제제의 반고 처리량 스크리닝에 적응되었다. 이 운동 분석은 384웰 마이크로플레이트 형식으로 실행되며 총 반응량은 웰당 20 μL에 불과합니다. 이 플랫폼은 거의 모든 ADP 생산 효소에 적용되어야 합니다.

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

이 프로토콜은 막 전위의 변화를 측정하여 전기적 막 단백질을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 분석은 상피 세포주에서 내인성으로 발현되는 여러 이온 채널의 기능적 판독을 위한 플랫폼을 제공합니다.

두 개의 상피 세포주에서 두 개의 내인성 이온 채널에 대한 고처리량 기능 연구를 위한 막 전위의 형광 기반 분석

본 프로토콜은 뉴런 K-Cl 공동 수송체 KCC2의 기능 및 활성을 연구하기 위한 웨스턴 블로팅 기술의 적용을 강조합니다. 상기 프로토콜은 웨스턴 블로팅을 통한 키나아제 조절 부위 Thr906/1007에서의 KCC2 인산화의 조사를 기술한다. 또한 KCC2 활성을 확인하는 추가 방법이이 텍스트에서 간략하게 강조 표시됩니다.

웨스턴 블로팅을 이용한 뉴런 K-Cl 공동수송체 KCC2의 기능 및 활성 연구

이 프로토콜은 인간 호중구에서 β2 인테그린 활성화를 억제하는 저분자 약물을 식별하기 위한 유세포 분석 기반의 고처리량 스크리닝 방법을 설명합니다.

인테그린 억제 약물 스크리닝을 위한 유세포 분석 기반 고처리량 기법

이온 채널의 약리학적 표적화는 고형 종양을 치료하는 유망한 접근 방식입니다. 암세포에서 이온 채널 기능을 특성화하고 암 생존력에 대한 이온 채널 조절제의 효과를 분석하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다.

암세포의 이온 채널 스크리닝

학습하세요 안쪽 정류기 칼륨(Kir) 채널 활성을 측정하는 정량적 형광 분석법을 개발하고 검증하는 방법을. 이 고처리량 검사법은 신경과학 및 약리학 연구에서 새로운 치료제 후보 화합물을 발굴하는 데 활용됩니다.

안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

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