Name: 인간 Neuroendocrine 종양 치료의 연구를위한 3 차원 모델로 인간 Neuroendocrine 종양 세포 라인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 학습하세요 아가로스 오버레이 플랫폼을 이용한 신경내분비 종양 3D 스페로이드 배양법을 통해 약물 효과를 평가하는 방법을 배우세요. 이 기술은 신경내분비 종양 연구와 신약 개발에 활용됩니다.

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우리는 진심으로 MATLAB 프로그램과 뉴저지 조직 병리학 시설 및 현미경 시설의 암 연구소와 그녀의 도움 박사 Wenjin 첸 감사드립니다. 우리는 또한 그들의 의견과 제안을 검토 감사합니다. 이 연구는 레이몬드와 베벌리 Sackler 학술 진흥 재단에 의해 지원됩니다.

1. 1퍼센트 아가로 오스 코팅 24 잘 플레이트의 작성 <ol><li> 아가로 오스 멸균을 위해 250-500 ML 병을 및 압력솥 100 ML 탈이온수에 1g 아가로 오스 (RPI, A20090-500)을 추가 (121 ° C, 15 PSI, 압력솥 머신에서 15 분). 70 ° C의 물 목욕으로 소독 아가로 오스와 병을 전송합니다. 아가로 오스는 그것이 약 한 시간 걸립니다 70 ° C로 냉각하면 금방 부어받을 준비가되어 있습니다. 항상 아가로 오스 멸균을 유지하시기 바랍니다. </li><li> 24 잘 평면 바닥 접시 (팔콘, 353,047)을 구하는, 접시는 위상 대비 현미경으로 몇 군데있다면 24도 평면 바닥 플레이트 모든 종류의 일을합니다. </li><li> biosafety 캐비닛하고 잘 균일하게 커버하게 잘 주변에 소용돌이 아가로 오스를에서 Eppendorf 중계기를 피펫으로 각각 잘으로 아가로 오스 200 μl를 분배. 아가로 오스 200 μl가 spheroids는 일관된 구면 모양을 형성할 수 있도록 오목한 표면을 형성하는 것이 바람직하다. 미만 200 μl 아가로 오스하지 않을 수물론 전체를 커버하지만, 200 개 이상의 μl 아가로 오스는 오목한 표면 위에 성장 spheroids를 형성하지 않을 수 있습니다 구면 모양을 형성하지 않을 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스 - 코팅된 24-잘 번호판은 약 10 분에서 사용할 준비가 된 것입니다. (선택 사항) 이전 시딩 세포에 배지와 아가로 오스를 평형하는 매체의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 또는 아가로 오스가 완전히 경화 후, 각도에 100 μl 성장 매체를 추가하고 멸균 씰링 테이프 (Nunc, 236,366)로 번호판을 봉인. 이 번호판은 최대 1 주일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 단일 세포 현탁액의 준비 <ol><li> 모든 실험은 biosafety 캐비닛에 표준 무균 기술을 사용하여 수행되며 명시하지 않는 한 모든 문화는 공기의 5 % CO 2와 37 ° C humidified 인큐베이터 재배하고 있습니다. </li><li> 인간의 췌장 NET 봉-1 세포 10% 태아 소 혈청 (FBS, Invitrogen과 DMEM/F12 (Invitrogen, 10565)에 보관됩니다100mm에서 16000-044) 중간 X 20mm 무균 조직 배양 접시 (코닝, 430,167). </li><li> 단일층 봉-1 세포가 70~80%가 confluency 도달하면 매체가 제거됩니다. 세포는 37시 5 분 인큐베이션 1 개 ML TrypLE (Invitrogen, 12604)을 추가 ° C를하여 두 번 PBS로 씻어, 그리고 요리에서 dislodged됩니다 TrypLE는 트립신과 비슷하지만, 15 안정적입니다 - 30 ° C뿐만 아니라 4에 ° C. 모든 세포는 접시에서 분리되었는지 확인하기 위해 현미경으로 확인합니다. </li><li> trypsinized 전지 9 ML 성장 매체를 추가하고 심지어는 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 몇 번 아래로 조직을 피펫하고 피펫을 사용합니다. </li><li> 세포를 필터링하기 위해 70 μm의 세포 스트레이너 (피셔, 22363548)를 사용합니다. </li><li> 세포를 수집하여 구아바 PCA-96베이스 시스템 (Millipore)를 사용하여 셀 카운트를 수행합니다. </li><li> 10% FBS 성장 매체와 페놀없는 DMEM/F12에 ML 5,000 세포 현탁액을 준비합니다. </li></ol> 3. 회전 타원체 문화 <ol><li> 싱글의 중첩 200 μl셀 아가로 오스 코팅 24 잘 판에 현탁액과 증발을 방지하기 위해 멸균 씰링 테이프로 24 잘 번호판을 봉인. </li></ol> 참고 : - 도금되는 세포의 숫자는 하루에 6 spheroids의 크기에 따라 경험적으로 결정되어야하며 spheroids의 300-400 μm의 직경은 약물 치료를 시작하기위한 이상적인 크기는 될 겁니다; 1000 봉-1과 H727 세포 도금있다. - 3D 세포의 생존 능력에 대해 10 일째 (데이터 준비 원고, 보이지 않음)에 떨어지기 시작하기 때문에 우리는 6 일 후에 약물 치료를 시작하지 않는 것이 좋습니다. <ol start="2"><li> 공중에 5 % CO 2와 37 ° C humidified 인큐베이터에서 하룻밤 미만 40 RPM의 매우 느린 교반시 궤도 흔드는에 많이-1 세포와 위 아가로 오스 코팅 24 잘 접시를 놓습니다. 그런 문화가 성장을 유지하기 위해 안정적인 플랫폼으로 이러한 번호판을 이동합니다. </li><li> 상기 플레이트의 각도 200 μl 성장 매체를 추가하십시오의 삼일마다. spheroids 방해하지 마십시오. 잘 사이드로 피펫 팁을 만진하고 잘으로 매체 흐름을 실망시키는하여 각 우물의 벽을 통해 매체를 추가해보십시오. </li><li> 현미경으로 24 잘 접시의 회전 타원체 형성을 모니터링합니다. </li></ol> 4. 약물 치료 <ol><li> spheroids 하루 6 직경 300-400 μm의 주위에 도달하면 3D spheroids 마약으로 취급됩니다. 이것은 약물 치료에 대한 당일 0으로 표시된됩니다. </li><li> 일 6, 접시의 각 우물은 매체의 주위에 400 μl가 포함되어 있습니다. 8시 정도 복제는 15 ML 원뿔 튜브, 5 ML 성장 매체에 제약 주식에서 만들어진 약물 치료는 치료의 각 복용량의 각도, 3 배 시리얼 dilutions의 1X 최종 농도에 있는지 확인합니다. </li><li> 24 잘 플레이트의 각 행에에 spheroids는 자동차, 투여량 1, 2, 3, 4와 5로 분류됩니다. 4 (보고 한 24도 접시에 트리 트먼트의 각 복용량에 대한 복제가 있습니다 <stroNG&gt; 표 1). 우리는 보통 적어도 최소한 8을 만들어이 치료의 각 복용량에 대해 복제이 24도 접시에 3D spheroids 취급. </li><li> 4에서 5 분, 800 rpm으로 24도 플레이트를 던가 ° 씰링 테이프에있는 모든 condensations가 잘 들어갈 있는지 확인하기 위해 C #. 3D spheroids의 부동 기능으로 인해 각 음의 매체는 spheroids의 교란을 피하기 위해 제거되지 않습니다. </li><li> 조심스럽게 각 우물의 벽을 따라 적절한 우물에 각 복용량의 위에 만들어진 트리 트먼트 200 μl를 추가합니다. </li><li> 씰링 테이프로 24 잘 번호판을 밀봉하고 37 년에 문화를 품어 ° C 공기에 5 % CO와 humidified 보육 2. </li><li> 필요한 경우 72-96 시간 이후에 치료의 각 복용량과 각도에 spheroids를 후퇴했습니다. </li></ol> 5. 모니터 3D 회전 타원체의 문화 <ol><li> t의 각도에 약물 치료 후 각각 선정 시점 (0, 24, 48, 72 HR)에서, spheroids그는 24 잘 플레이트는 5 배 목표를 사용하여 자이스 혈구 Axiovert 200/M-based 위상 대비 현미경으로 몇 군데있다. </li></ol> 참고 : 이미지가 μm의 및 픽셀 사이의 보정 스케일링과 함께하는 가벼운 현미경으로 촬영하실 수 있습니다. spheroids 빠르게 10X 목적으로 이미징 필드를 자라다 때문에 5 배 목표는 이상적입니다. <ol start="2"><li> 회전 타원체 분석 원시 이미지로 자이스 혈구 AxioVision 4.8.2 소프트웨어를 사용하여 수동으로 수행할 수 있습니다. </li><li> 또는 사용자 정의 개발된 MATLAB 프로그램은 자동 / 세미 자동으로 spheroids의 크기를 추정하는 데 사용됩니다. 자동 프로그램은 정확하게 주어진 이미지 회전 타원체의 윤곽을 찾아 자동으로 주요 (L)과 부 (W) 도끼를 측정하기위한 적극적인 윤곽 알고리즘 4 구현합니다. 동일한 알고리즘의 반자동 버전은 사용자가 강력한 유물이 존재하는 경우 프로그램을 시작하는 데 도움이 있습니다. 모든 이미지의 TIFF 또는 JPEG 파일 형식으로 내보낼해야프로그램에서 읽을 수있는 RAW 이미지. 회전 타원체의 부피는 0.5 X 패 X 승 2로 추정된다. </li></ol> 6. NET 3D Spheroids의 HistoGel-퍼가기 <ol><li> 10-24 spheroids은 2 시간을위한 포르말린 10 % 해결, 두 번 PBS로 씻어, 24 잘 접시에서 수집한 50 % 씻어 15 분 70 % 에탄올 두 번 각각, 그리고 HistoGel의 삽입을위한 준비가되어 있습니다. 양자 택일로, 그들은 몇 달 동안 4 ° C에서 70 % 에탄올에 보관하실 수 있습니다. </li><li> 추운 HistoGel (써모 과학, HG-4000-012)의 튜브를 물로 채워진 비커에 들어가게된다. 비커는 1 분 전자 레인지에 가열하거나 겔이 완전히 다 녹아 버렸어요 때까지 다음, 항상 같은 물이 채워진 비커에 보관됩니다. </li><li> 위에서 70 % 에탄올에 spheroids은 이쑤시개를 사용하여 생검 cryomold (조직 - 테크, 사쿠라 Finetek, 4565)로 전송됩니다. 모든 spheroids 전송하고 있는지 확인하십시오. spheroids은 바이오 아래로 가라 앉 히 잠시 앉아서PSY는 cryomold. Kimwipes와 생검 cryomold에있는 액체를 제거하고 한편 매우 부드럽게 일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 생검 cryomold 하단의 중앙에 spheroids 밀어 봅니다. 이 단계는 해부 현미경으로해야 할 일이 쉬울 수도 있습니다. </li><li> 예열 HistoGel의 박막 층을 생검 cryomold 하단의 spheroids를 안정화하기 위해 생검 cryomold에 추가됩니다; 한편, 이쑤시개 매우 부드럽게 생검 cryomold 하단의 중앙에 spheroids을 유지하는 데 사용됩니다. 생검 cryomold 하단에 spheroids 안정화를 위해 충분 너무 HistoGel를 추가하지만,하지 마십시오. </li><li> spheroids / HistoGel는 상온에서 혹은 HistoGel가 경화되어 때까지 1-2 분 동안 앉아 보자. 그런 다음 예열 HistoGel와 생검 cryomold의 나머지 부분을 채운다. </li><li> 그것이 약 10 분 동안 상온에서 응고하도록 허용합니다. </li><li> 직전 생검 cryomold, 숨기려에서 spheroids / HistoGel 블록을 보여주고로그대로 spheroids / HistoGel 블록 터지는 도움 1 분, 대해 4 ° C에서이 있어요. spheroids / HistoGel 블록 후 바이오 랩의 조각 (Surgipath, 01090)에 포장해서 조직 및 생검 카세트 (피셔 과학, 15-182-701D)에 투입된다. 조직 및 생검 카세트는 70 %의 에탄올과 컨테이너에 저장됩니다. 그런 다음 파라핀에 삽입을위한 일상적인 조직 처리 절차는 다음에있다. 5 </li><li> 파라핀 블록은 3 μm의 두께 계층 슬라이드로 sectioned 될 수 있습니다. 슬라이드는 histological 변경 사항을 결정하기 위해 hematoxylin과 eosin 물들일 수 있으며 immunohistochemical 염색법에 사용할 수 있습니다. </li></ol> 7. 대표 결과 인간의 췌장 neuroendocrine 종양 세포 라인 봉-1 (Kjell Oberg, 웁살라 대학, 스웨덴에 의해 Verto 연구소 제공), QGP-1 (일본어 보건 과학 재단, 오사카, 일본), 그리고 인간의 폐 neuroendocrine 종양 세포 라인 H727은 (ATCC)했다 agaros에 성장전자 코팅 24 잘 판. 그림 1에 보이는 것처럼, 세 개의 셀 라인은 서로 다른 형태로 표시됩니다. 봉-1과 H727 세포는 3D spheroids을 형성했다. 현미경, H727 세포가 많이-1 세포 친밀해 더 컴팩트 spheroids을 보여주었다. 우리는 H727 세포가 세포 - 세포 부착을위한 증가된 용량을 가지고 있고 결과로 꽉 분기점을 형성한다는 가설. QGP-1 세포가 spheroids으로 간주되지 않는 대형 포도와 같은 다공성 대중을 보여줍니다. 최근 췌장 neuroendocrine 종양 연구의 상승 관심 때문에 많이-1 세포 숫자의 나머지를 위해 사용됩니다. 아가로 오스 코팅 24 - 잘 접시 봉-1 세포를 퍼뜨리고 후, 다세포 spheroids 형성은 일반적으로 3 회 또는 4 회 하루에 의해 발생 spheroids는 6 일 당일에 의한 라운드 게임이된다. 양분과 산소의 제한으로 인해 spheroids의 치밀한 코어의 세포가 하루 10 시쯤에 그리고 그날 17 일까지 죽기를 시작 spheroids 인해 큰 규모 정도의를 분해하기 시작나에게 사건 괴사성 코어의 방출을. spheroids는 일반적으로 직경이 1,000 μm의 최대 성장할 수 있습니다. 그림 2 봉-1 3D spheroids의 형성, 성장과 붕괴의 섹션을 보여줍니다. spheroids가 300-400 μm의 주위와 세포가 높은 생존을 (준비 원고) 보관있을 때 약물 치료가 시작되었다. 6 일 3D spheroids는 약물 치료를위한 시작 지점으로 선정되었다. 그것은 히스톤 deacetylase 억제제는 NET 세포에 antiproliferative 및 proapoptotic 효과를 보여준 것으로보고되었습니다. 6 우리는 (TSA) 3D NET spheroids에 대한 약물 치료의 효과를 설명하기 위해 예를 들어 있습니다. 그림 3A가 보여주는 히스톤-deacetylase 억제제-Trichostatin 선택 TSA. 그림 3B의 치료시 3D spheroids의 형태 TSA (시그마, T8552) 치료시 3D spheroids의 볼륨을 보여줍니다. 각각 회전 타원체의 크기는 cus에 의해 자동으로 추산되었다MATLAB 컴퓨터 프로그램을 탐 - 개발 4. 수동 그리기 단계가 주어진 이미지에 가까운 가장자리에 있었다 spheroids을 취득할 수 있도록 추가되었습니다. 최소한 8 spheroids는 각 시점에서 TSA 치료의 선량에 따라 측정되었다. 각 3D 회전 타원체의 부피는 0.5 X 길이 X 폭 2로 계산되었다. 마찬가지로 차량에 대한 상대 그림 3A 및 3B에서 볼 수있는 그림에 표시된 TSA의 복용은 많이-1 3D spheroids의 성장 억제 어느 정도 보여주었다. 그중 125 nm의 및 TSA 250 NM의 농도가 가장 강력하게 3D spheroids의 성장을 억압하고 96 시간의 시점에서 세포 죽음으로 이끌었습니다. NET 3D spheroids의 조직학을 이해하기 위해서는 H &amp; E와 immunohistochemical (IHC) 염색법 17 일간 배양해되었던 3D spheroids에서 수행되었다. 그림 4A가 중요있는 HistoGel 삽입을위한 3D spheroids을 처리하는 방법을 보여줍니다 3D spher의 파라핀의 삽입을위한 단계<html> oids. 그림 4B는 H &amp; E 염색법, 죽습 caspase-3 (apoptotic 세포에 대한 표지)와 KI-67 immunohistochemical 염색법 (세포 proliferating위한 마커) 3D spheroids에 대한 항체, 17 일 동안 배양해되었습니다 보여줍니다 . 3D spheroids의 핵심 내의 세포가 대부분 괴사성 / apoptotic이며 외부 레이어 세포 적극적 proliferating 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. NET 3D Spheroids의 형태론. 세 인간 neuroendocrine 종양 세포 라인에서 3D spheroids는 아가로 오스 코팅 24 - 잘 접시에 형성된다. 1000 봉-1, H727 및 QGP-1 세포는 아가로 오스 코팅 24 - 잘 접시에 놓는 및 프로토콜에 대한 상세한으로 정상 생리 상태로 성장했다. 이들은 10 일 동안 배양해되었다 QGP-1 봉-1과 H727 또는 셀 집계를위한 3D spheroids의 이미지입니다. 18/4218fig2.jpg &quot;고도 =&quot;그림 2 &quot;/&gt; 그림 2. 봉-1 3D Spheroids의 성장 현황 봉-1 차원 spheroids의 성장 추적 :. 형성, 성장 및 3D spheroids의 붕괴. 프로토콜에 설명된 바와 같이, 1000 봉-1 세포는 아가로 오스 코팅 24도 강판에 도금하고 있습니다. 세포가 하룻밤 생리적 상태 궤도 흔드는 10 % FBS와 표준 DMEM/F12 매체 재배 후 안정적인 플랫폼을 이동하고 동일한 조건으로 재배. 3D 세포 추적 성장은 도금 후 처음 5 시간 동안 이미징 세포 매 시간마다 다음 다음 자이스 혈구 Axiovert있는 모든 1-3일는 5 배 목표를 사용하여 위상 콘트라스트 현미경 200/M-based되었다. 첫번째 대중으로 집계 세포는 다음 다세포 집계, 작은 spheroids, 크고 spheroids, 결국 spheroids, 부스러질를 형성하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 봉-1에 대한 TSA 트리 트먼트3D Spheroids. () TSA 처리시 3D spheroids의 이미지. 치료 그룹 : V - 차량 (0.0025 % DMSO), D1-복용량 1 (15.625 NM TSA), D2-선량 2 (31.25 NM TSA); D3 : 투약 3 (62.5 NM TSA); D4 : 약을 사 (125 nm의 TSA ); D5 : 복용량 5 (250 nm의 TSA). 치료 시간 : 0 H - 시점 6 일 3D spheroids에서 시작 치료하는, 치료 시작 후 24 H, 48 H 72 H와 96 H가 시간이 포인트입니다. 3D spheroids는 각 시점 이전과에서 몇 군데 있었다. TSA 처리시 3D spheroids의 (B) 성장. ()의 3D spheroids의 주요 (L)과 부 (W) 도끼는 트리 트먼트의 각 시점 (0, 24, 48, 72 및 96 시간)에서 Matlab 프로그램에 의해 자동으로 추산되었다. 3D spheroids의 볼륨은 0.5 X 패 X 승 2로 추정되었다. 그래프의 회전 타원체의 부피는 8의 평균은 복제 였고 오류 막대는 8 개의 복제에 기반을 계산했다. <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/4218/4218table1.jpg" /> 표 1.24 잘 접시 약물 치료의 레이아웃 <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig4A.jpg" alt="그림 4A" /> 그림 4A. HistoGel 임베딩위한 3D Spheroids을 처리하는 방법 삽화. HistoGel 삽입과 3D spheroids () HistoGel 삽입을위한 3D spheroids을 처리하는 방법의 개요 immunohistochemical 염색법을위한 3D spheroids을 처리하는 방식입니다. 3D spheroids는 생검 cryomold에서 같은 수준의 다음 HistoGel / spheroids 블록이 바이오 - 랩 파란색으로 포장해서 파라핀의 삽입을위한 노란색 생검 카세트 안으로 옮겨졌 다 참석해야 HistoGel에 캡슐되었다. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig4B.jpg" alt="그림 4B" /> 그림 4B. H &amp; E 염색법과 요일-17 3D Spheroids의 Immunohistochemical 염색법. (B) H &amp; E 염색법, Immunohistochemical KI-67 염색법과 17 일 3D spheroids 중 죽습 Caspase-3. Paraffin - 임베디드 sectioned 슬라이드 deparaffinized 있었고, 항원 검색은 CCI를 (셀 컨디셔닝 솔루션, Verana 의료 시스템, # 711-065-152)를 사용하여 수행되었다. 토끼 polyclonal KI-67 항체 (Abcam. # Ab833)은 죽습 Caspase 3 항체 (셀 시그널링 기술, # 9661)는 상온에서 1 시간 동안 각각 1:75과 1:200의 농도에 적용되었다. 안티 토끼 이차 항체가 (잭슨 Immunolab, # 711-065-152) chromogenic 탐지 키트 DABMap (Ventana 의료 장비, # 760-124)에 의해 다음, 실온에서 1 시간 동안 1:500에서 적용되었다. 슬라이드는 Hematoxylin과 탈수로 counterstained 및 크실렌에서 coverslipping 전에 지워집니다.

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우리는 아가로 오스 코팅 24 잘 접시를 사용하여 인간의 neuroendocrine 종양 세포에서 3D 다세포 회전 타원면을 형성하는 단순하고 신뢰성 및 재현성 방법을 증명하고있다. 이 기법의 성공은 균일한 크기와 세포의 고정된 숫자부터 6 일에 의해 균일한 형태와 단일 회전 타원체를 얻을 수있는 능력입니다. 주요 단계는 도금 후 첫 16-24 시간 NET을 세포와 접시의 느린 교반이다. 이 방법에 또한 적용될 수있는 일반적인 인간 유방암 세포주 MCF-7 인간 결장 선암 세포주 HT-29 인간이 아닌 작은 세포 폐 암종 세포주 H1299과 인간의 배아 신장 세포 라인 HEK-293. 그들은 모두 치료 약물 검사 (데이터가 표시되지 않음)을위한 유니폼과 소형 3D spheroids를 형성할 수 있습니다. 여러 가지 방법이 3D spheroids을 생성에보고되지만, 7-10 방법은 전문 번호판이나 시약이 필요없는 여기에보고하기 때문에 간단하고 비용 효율적입니다. 우리 게시되지 않은 데이터 demonstrat단일층 2D 세포에 비해 아가로 오스에 성장 NET 3D spheroids은 기하학적 및 molecularly 생체내 NET 이종 이식 종양에를 모방하는 전자. 이것은 다른 인간의 암 세포 라인에서 만든 3D spheroids에 대해보고되었습니다 것과 유사합니다. 차원 세포 배양 모델의 11,12 제한이 완전히 어떤 약물이나 치료 치료의 생체내 효능으로 테스트를 대체할 수 없다는 것입니다 때문에 3D spheroids이 측면에서 생체내 종양의과 다를있는 avascular 종양 같다. 그럼에도 불구하고,이 방법은 몇 가지 측면에서 생체내의 체외에서부터 NET 치료 약물의 간격과 평가를 해소하는 데 도움이됩니다. 다세포 spheroids에 Immunofluorescence 염색법은 큰 크기와 기하학 부동 3D spheroids과 공촛점 현미경의 한계로 인해 수행하는 것은 매우 어렵습니다. 여기 파라핀을 위해 HistoGel의 삽입을 처리하는 방법을 보여줍니다3D spheroids의 일련 sectioned 슬라이드 immunohistochemical 염색법을 허용, 삽입. 게다가, 우리의 맞춤 개발된 MATLAB 프로그램은 정확하고 reproducibly, spheroids의 크기를 추정 효율적으로 약물 효능을 모니터링하는 데 도움 및 NET 환자를위한 약물의 개발에 높은 처리량 화면에 통합될 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 미디어 </td><td> Gibco </td><td> 10565-018 </td><td></td></tr><tr><td> TrypLE </td><td> Gibco </td><td> 12,604 </td><td></td></tr><tr><td> 24 잘 접시 </td><td> 매 </td><td> 353,047 </td><td></td></tr><tr><td> 70 MM 셀 스트레이너 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 22363548 </td><td></td></tr><tr><td> 멸균 씰링 테이프 </td><td> Nunc </td><td> 236,366 </td><td></td></tr><tr><td> Trichostatin </td><td> 시그마 </td><td> T8552 </td><td></td></tr><tr><td> 궤도 흔드는 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 11-402-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

인간 neuroendocrine 종양 치료의 연구를위한 3 차원 모델로 인간 neuroendocrine 종양 세포 라인

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine 종양 (그물) 년 당 100, 000 개인마다 두 아이의 발병률과 함께 드문 종양이며, 그들은 모두 인간의 malignancies의 0.5 %를 차지. 1화된 질환으로 제시 환자의 소수를위한 수술 이외 있습니다 체계적인 치료가 거의 없거나 전혀없는 생존 혜택을 누릴 수 있습니다. 그러므로, 더 나은 그물의 생물학을 이해하고, 특히 nonresectable 또는 전이성 neuroendocrine 종양 환자에 대한 새로운 치료 표적을 정의할 수있는 좋은 필요가있다. 3 차원 세포 배양은 생체내 종양 조직 조직과 microenvironment에를 모델링에서의 관련으로 인해 약물 검사를위한 인기있는 방법으로 부상하고 있습니다. 2,3 3D 다세포 spheroids 직접 차원에서 진행하는 것보다 더 신속하고 저렴하게 유용한 정보를 제공할 수 동물의 세포 배양 실험 (murine) 모델. NET 팻위한 새로운 치료제의 발견을 촉진하려면ients, 우리는 인간 NET 세포 라인을 사용하여 체외 3D 다세포 spheroids 모델을 개발했습니다. NET 세포가 아닌 접착제 아가로 오스 코팅 24도 강판에 도금 및 도금 후 16-24 시간에 대한 아주 느린 교반와 생리적 조건 (5 % CO 2, 37 ° C)에서 incubated됩니다. 세포가 3 회 또는 4 번째 날에 시작 다세포 spheroids를 형성하고 있습니다. spheroids는 약물 치료가 시작되는 시점에서 6 일 당일에 의한보다 구형이된다. NET spheroids에 대한 약물 치료의 효능은 위상 콘트라스트 조명 현미경으로 spheroids의 형태, 모양과 크기를 기반으로 감시하고 있습니다. spheroids의 크기는 활성 등고선 알고리즘을 기반으로하는 사용자 정의 개발 MATLAB 프로그램을 사용하여 자동으로 추정된다. 더 나아가, 우리는 표준 histological 및 immunohistochemical 기법의 사용을 허용, 이러한 3D spheroids에 HistoGel 삽입을 처리하는 간단한 방법을 보여줍니다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 이것은 치료 약물의 효과를 검토 NET 세포 라인을 사용하여 3D spheroids을 생성에 대한 최초의 보고서이다. 우리는 또한 이러한 3D spheroids에서 조직학을 수행하고, NET spheroids의 성장과 증식에 단일 약물의 효과의 예를 표시했습니다. 우리의 결과는 NET spheroids은 NET 생물학 및 약물 개발에 대한 연구를위한 귀중한 것을 지원합니다.

우리는 neuroendocrine 암 세포 라인을 사용하여 3D 다세포 spheroids를 성장하는 간단한 아가로 오스 오버레이 플랫폼을 소개합니다. 이 방법은 neuroendocrine 종양 세포에 치료 약물의 효과를 시험하는 매우 편리한 방법을 제공합니다. 그것은 또한 우리가 암 치료를 위해 인간 neuroendocrine 종양의 spheroids을 설정하는 데 필요한 도움을 수 있습니다.

인간 Neuroendocrine 종양 치료의 연구를위한 3 차원 모델로 인간 Neuroendocrine 종양 세포 라인

신경내분비종양(NETs)은 연간 100,000명당 2명의 발생률을 보이는 희귀 종양으로, 전체 인간 ...의 0.5%를 차지합니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 균일한 3차원 신경내분비 종양 스페로이드를 제작하는 쉽고 간단한 방법과, 이러한 스페로이드의 조직학적 연구를 위해 HistoGel 임베딩을 처리하는 간단한 방법을 개발하는 것입니다. 이는 24웰 플레이트를 에어로졸로 고르게 코팅한 후, 단일 세포 현탁액 상태의 인간 신경내분비 종양 세포를 분주함으로써 달성됩니다. 이후 플레이트를 인큐베이터 내 오비탈 쉐이커에서 40 RPM 미만의 속도로 하룻밤 동안 배양한 다음, 인큐베이터의 안정적인 선반으로 옮깁니다.구형체(Spheroid)는 3일 또는 4일째에 형성되며, 조직학적 연구를 위해 위상차 현미경으로 이들의 성장과 무결성을 모니터링합니다. 3D 스테로이드는 일반적인 파라핀 처리 전에 가온된 HistoGel에 매립하며, 위상차 현미경으로 촬영한 이미지를 통해 신경내분비 종양 3D 스테로이드의 성장을 보여주는 결과를 얻습니다. 3D 스테로이드의 조직학적 분석은 3D 스테로이드의 파라핀 블록 절편에 대해 H&E 염색 및 면역조직화학 염색을 실시하여 분석합니다.기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 단순하고 쉽고 신뢰할 수 있으며 비용 효율적이라는 점입니다. 이 방법은 신경내분비 종양 환자를 위한 치료제를 신속하게 식별하도록 도움으로써 신약 개발 분야의 연구를 촉진할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 초기에는 크기와 모양이 균일한 3D 오가노이드를 배양하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.이 과정의 핵심은 24-well plate가 agros로 균일하게 코팅되도록 하고, 단일 세포 현탁액이 잘 분산되어 정확한 농도를 유지하도록 하는 것입니다. 3D 스테로이드의 조직학적 구조를 이해하기 위해서는 파라핀 처리와 면역 화학 염색을 수행해야 합니다. 3D 스테로이드의 조직 임베딩은 핵심 단계이며, 이는 오늘 후반부에 시연될 예정입니다. 24-well plate 코팅용 1% agros를 준비하려면, 250~500 mL 병에 deionized water 100 mL와 agros 1 g을 넣고 오토클레이브로 agros를 멸균하십시오.병을 70 °C 항온수조에 넣고 약 1시간 동안 유지합니다. 에어로졸이 70 °C로 냉각되는 동안, 에어로졸은 항상 멸균 상태로 유지되어야 합니다. 생물안전작업대(BSC) 내에서 리피터 피펫을 사용하여 24-웰 플레이트의 각 웰에 에어로졸 200 µL씩 분주합니다.본 프로토콜에는 평평한 바닥의 웰 플레이트를 사용하십시오. 위상차 현미경으로 이미징이 가능한 플레이트라면 어떤 종류의 24웰 평평한 바닥 플레이트라도 사용할 수 있습니다. 에어로젤이 웰 전체에 고르게 덮이도록 웰 내부에서 에어로젤을 회전시키십시오. 스페로이드가 일정한 구형을 형성할 수 있도록 오목한 표면을 만드는 데는 200 µL의 에어로젤이 가장 적합합니다.약 10분 후면 에어로스(aeros)가 코팅된 24웰 플레이트를 사용할 수 있습니다. 본 실험에 사용된 Bon-1 세포는 인간 췌장 신경내분비종양(NET) 세포로, 10% FBS가 포함된 D-M-E-M-F 12 배지를 사용하여 37 °C, 5% CO2 조건의 습윤 인큐베이터 내 멸균 조직 배양 접시에서 배양되었습니다. 단층의 Bon-1 세포가 70~80% 합류도(confluency)에 도달하면, 생물안전작업대(biosafety cabinet)에서 단일 세포 현탁액을 준비합니다.배지를 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 1 mL의 TrypLE을 첨가하고 37 °C에서 5분 동안 배양하여 디쉬로부터 세포를 떼어냅니다. 현미경으로 모든 세포가 디쉬에서 분리되었는지 확인한 후, 트립신에 9 mL의 성장 배지를 첨가합니다.안구 세포를 파이펫으로 수차례 위아래로 섞어 균일한 단일 세포 현탁액이 되도록 합니다. 70 micron 세포 스트레이너를 사용하여 세포를 여과합니다. 여과된 세포를 수집하여 세포 수를 측정하고, 10% FBS가 포함된 D-M-E-M-F 12 성장 배지에서 mL당 5,000 cells의 현탁액을 준비합니다.분주할 세포 수는 6일째 구체의 크기에 따라 경험적으로 결정해야 합니다. 이상적으로는 구체의 직경이 300에서 400 µm 사이가 되도록 하는 것이 좋습니다. 이러한 이유로, 본 실험에서는 웰당 200 µL의 부피에 1,000개의 세포를 분주합니다.본 절차를 시작하려면, 이전에 준비한 aero 코팅 24웰 플레이트의 각 웰에 단일 세포 현탁액 200 µL를 얹고, 증발을 방지하기 위해 멸균 실링 테이프로 24웰 플레이트를 밀봉하십시오. BON-1 세포가 담긴 aero 코팅 24웰 플레이트를 5% CO2가 포함된 37 °C 습윤 인큐베이터 내의 오비탈 쉐이커에 놓고 매우 느린 속도로 교반하며 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날 아침에 플레이트를 안정적인 플랫폼으로 옮기고, 인큐베이터 내에서 3일마다 배양을 유지하십시오.플레이트의 각 웰에 성장 배지 200 µL를 추가합니다. 오가노이드(phe)가 흐트러지는 것을 방지하기 위해, 피펫 팁을 웰의 벽면에 대고 배지가 벽면을 타고 웰 내부로 흘러 들어가게 합니다. 현미경으로 24 웰 플레이트 내의 OID 형성을 관찰합니다. 3D 스테로이드의 약물 처리는 배양 6일 차에 시작합니다.스페로이드의 직경이 약 300에서 400 µm가 되었을 때를 6일 차의 약물 처리 기준일인 0일 차로 지정합니다. 약물 처리가 각 웰에서 1x 최종 농도가 되도록 플레이트의 각 웰에 약 400 µL의 배지를 넣습니다. 각 처리 용량에 대해 원하는 농도의 3배 농도로 조제하며, 15 mL 원추형 튜브에 5 mL의 성장 배지와 적절한 양의 약물 스톡을 희석하여 8개의 반복 실험군에 충분한 양을 준비합니다. 24웰 플레이트의 각 행에 있는 PHE는 vehicle, dose 1, 2, 3, 4 및 5로 구분됩니다. 각 24웰 플레이트에는 처리 용량별로 4개의 반복 실험군이 있습니다.일반적으로 3D phe는 최소 2개의 24-well 플레이트에서 처리하며, 이를 통해 각 처리 용량당 최소 8개의 반복 실험군을 확보합니다. 각 well에 처리제를 첨가하기 전, 3D 스테로이드의 부유 특성으로 인해 천장 테이프에 맺힌 모든 응결수가 well 내부로 들어갈 수 있도록 24-well 플레이트를 스핀 다운(spin down)합니다. 원심분리 후 각 well의 배지는 제거하지 않습니다.구형체를 자극하지 않도록, 각 처리 농도별로 200 µL씩 각 웰의 벽면을 따라 조심스럽게 분주합니다. 24-웰 플레이트를 실링 테이프로 밀봉하고, 5% CO2가 포함된 37 °C 습윤 배양기에서 배양합니다. 약물 처리 후 설정한 각 시점마다 위상차 현미경으로 3D 스테로이드 배양물을 관찰합니다.PHE는 10 x 대물렌즈를 사용할 경우 이미징 시야를 빠르게 벗어나므로 5 x 대물렌즈가 이상적입니다. HistoGel 처리 전, 각 시점마다 각 웰에 있는 스테로이드를 이미징합니다. 임베딩을 위해 24-웰 플레이트에서 3D 스테로이드를 수집하고 10% Formin으로 고정합니다.차가운 HistoGel 튜브를 물이 담긴 비커에 넣습니다. 비커를 전자레인지에서 1분 동안 또는 겔이 완전히 액화될 때까지 가열합니다. 실험 절차가 진행되는 동안 튜브를 해당 수조 비커에 계속 넣어 둡니다.일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 모든 스테로이드를 생검용 cryo mold로 옮깁니다. 스테로이드가 생검용 cryo mold 바닥으로 가라앉을 때까지 1분 동안 그대로 둡니다.킴와이프스(Kim wipes)를 사용하여 생검 냉동 몰드(biopsy cryo mold) 내의 액체를 제거하십시오. 이쑤시개를 이용해 스테로이드를 생검 냉동 몰드 바닥의 중앙으로 매우 조심스럽게 밀어 넣습니다. 그다음, 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)을 사용하여 스테로이드가 생검 냉동 몰드의 중앙에 유지되도록 매우 부드럽게 조절하십시오.따뜻하게 데운 HistoGel을 생검 cryo mold에 얇게 도포합니다. HistoGel을 너무 많이 넣지 마십시오. 스테로이드를 중앙에 고정시킬 수 있을 만큼의 양만 사용하십시오.HistoGel 내의 스테로이드를 실온에서 1~2분 동안 또는 HistoGel이 응고될 때까지 둡니다. 생검 cryo mold의 나머지 부분을 따뜻하게 데운 HistoGel로 채우고, 실온에서 약 10분 동안 응고되도록 합니다. 이 OIDs HistoGel 블록을 생검 cryo mold에서 꺼내기 직전에 수행하십시오.크라이오 몰드를 얼음 위에 1분 동안 둔 다음, 온전한 상태의 스테로이드 HistoGel 블록을 꺼냅니다. 블록을 바이오 랩으로 감싸 조직 및 생검 카세트에 넣습니다. 조직 및 생검 카세트를 70%ethanol이 들어있는 용기에 보관하십시오.그 후, aeros 코드가 표시된 24웰 플레이트에서 배양된 경우 파라핀 매립을 위한 일반적인 조직 처리 절차를 수행합니다. 여기서 보는 바와 같이, 서로 다른 신경내분비 세포주들은 각기 다른 형태를 나타냅니다. 인간 췌장 신경내분비 세포주 BON-1과 인간 폐 신경내분비 세포주 H 7 27은 3D 스페로이드를 형성했습니다.이와 대조적으로, qgp one의 경우입니다. 인간 췌장 망상 세포는 스테로이드로 간주되지 않는 커다란 포도 송이 모양의 다공성 덩어리를 형성합니다. agros가 코팅된 24웰 플레이트에 세포를 파종한 후, 일반적으로 3일 또는 4일째에 다세포 스테로이드 형성이 일어나며, 6일째가 되면 스테로이드의 형태가 더 둥글게 변합니다.영양분과 산소의 제한으로 인해, 스테로이드의 밀집된 핵 내에 있는 세포들은 약 10일경부터 사멸하기 시작하며, 17일경에는 스테로이드가 붕괴되기 시작합니다. 거대한 크기 또는 일부 사례에서의 괴사성 코드(necrotic cord) 배출로 인해, 스테로이드는 일반적으로 직경 1000 microns까지 성장할 수 있습니다.본 실험에서는 트리코스타틴 A(TSA)인 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 처리를 위한 시작점으로 6일 차 3D 오가노이드를 선정하였습니다. 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제는 신경 세포에 대해 증식 억제 및 전-세포사멸 효과를 나타내는 것으로 이전에 보고된 바 있습니다. 이 이미지들은 처리 시작 시점과 처리 24, 48, 72, 96시간 후의 3D 오가노이드 형태 변화를 추적한 것입니다.V는 DMSO인 용매(vehicle) 처리를 나타냅니다. D1에서 D5는 TSA 용량을 점진적으로 증가시켜 처리한 것을 나타냅니다. 각 개체의 OID 크기는 자체 개발한 MATLAB 컴퓨터 프로그램에 의해 자동으로 추정되었습니다.각 시점별 TSA 처리 용량당 최소 8개의 sph를 측정하였으며, 그 결과는 대조군(vehicle) 대비 이 그래프에 표시되었습니다. 모든 용량의 TSA가 3D OID에서 어느 정도의 성장 억제를 나타냈습니다. 125 nM 및 250 nM의 TSA 농도에서 3D 스테로이드의 성장이 강력하게 억제되어 최종 3D 스테로이드의 조직학적 특성을 파악할 수 있었습니다.17일 동안 배양한 3D 스테로이드에 대해 H and e 염색 및 면역조직화학 염색을 수행하였습니다. KI 67은 증식하는 세포의 마커이며, cleaved caspase three는 세포 사멸 세포의 마커입니다. 결과에 따르면 3D 스테로이드의 외층 세포는 활발하게 증식하고 있는 반면, 중심부의 세포들은 대부분 괴사 또는 세포 사멸 상태인 것으로 나타났습니다.이 절차를 마친 후, 이러한 3D 스테로이드의 세포 생존율을 결정하기 위해 cell titer glow assay와 같은 추가 분석을 수행할 수 있습니다. 이 기술이 개발되면 96웰 플레이트로 확장하여 고속 스크리닝을 수행할 수 있으며, 이는 암 연구에서 치료제 발굴을 촉진할 것입니다.

human-neuroendocrine-tumor-cell-lines-as-three-dimensional-model-for

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

3 차원 Heterotypic<em&gt; 체외에서</em난소 암 개시 및 진행하는 동안 Stromal - 상피 조직의 상호 작용&gt; 모델링

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약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성

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