인간 Neuroendocrine 종양 치료의 연구를위한 3 차원 모델로 인간 Neuroendocrine 종양 세포 라인

다음 실험의 전반적인 목표는 균일한 3차원 신경내분비 종양 스페로이드를 제작하는 쉽고 간단한 방법과, 이러한 스페로이드의 조직학적 연구를 위해 HistoGel 임베딩을 처리하는 간단한 방법을 개발하는 것입니다. 이는 24웰 플레이트를 에어로졸로 고르게 코팅한 후, 단일 세포 현탁액 상태의 인간 신경내분비 종양 세포를 분주함으로써 달성됩니다. 이후 플레이트를 인큐베이터 내 오비탈 쉐이커에서 40 RPM 미만의 속도로 하룻밤 동안 배양한 다음, 인큐베이터의 안정적인 선반으로 옮깁니다.

구형체(Spheroid)는 3일 또는 4일째에 형성되며, 조직학적 연구를 위해 위상차 현미경으로 이들의 성장과 무결성을 모니터링합니다. 3D 스테로이드는 일반적인 파라핀 처리 전에 가온된 HistoGel에 매립하며, 위상차 현미경으로 촬영한 이미지를 통해 신경내분비 종양 3D 스테로이드의 성장을 보여주는 결과를 얻습니다. 3D 스테로이드의 조직학적 분석은 3D 스테로이드의 파라핀 블록 절편에 대해 H&E 염색 및 면역조직화학 염색을 실시하여 분석합니다.

기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 단순하고 쉽고 신뢰할 수 있으며 비용 효율적이라는 점입니다. 이 방법은 신경내분비 종양 환자를 위한 치료제를 신속하게 식별하도록 도움으로써 신약 개발 분야의 연구를 촉진할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 초기에는 크기와 모양이 균일한 3D 오가노이드를 배양하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.

이 과정의 핵심은 24-well plate가 agros로 균일하게 코팅되도록 하고, 단일 세포 현탁액이 잘 분산되어 정확한 농도를 유지하도록 하는 것입니다. 3D 스테로이드의 조직학적 구조를 이해하기 위해서는 파라핀 처리와 면역 화학 염색을 수행해야 합니다. 3D 스테로이드의 조직 임베딩은 핵심 단계이며, 이는 오늘 후반부에 시연될 예정입니다. 24-well plate 코팅용 1% agros를 준비하려면, 250~500 mL 병에 deionized water 100 mL와 agros 1 g을 넣고 오토클레이브로 agros를 멸균하십시오.

병을 70 °C 항온수조에 넣고 약 1시간 동안 유지합니다. 에어로졸이 70 °C로 냉각되는 동안, 에어로졸은 항상 멸균 상태로 유지되어야 합니다. 생물안전작업대(BSC) 내에서 리피터 피펫을 사용하여 24-웰 플레이트의 각 웰에 에어로졸 200 µL씩 분주합니다.

본 프로토콜에는 평평한 바닥의 웰 플레이트를 사용하십시오. 위상차 현미경으로 이미징이 가능한 플레이트라면 어떤 종류의 24웰 평평한 바닥 플레이트라도 사용할 수 있습니다. 에어로젤이 웰 전체에 고르게 덮이도록 웰 내부에서 에어로젤을 회전시키십시오. 스페로이드가 일정한 구형을 형성할 수 있도록 오목한 표면을 만드는 데는 200 µL의 에어로젤이 가장 적합합니다.

약 10분 후면 에어로스(aeros)가 코팅된 24웰 플레이트를 사용할 수 있습니다. 본 실험에 사용된 Bon-1 세포는 인간 췌장 신경내분비종양(NET) 세포로, 10% FBS가 포함된 D-M-E-M-F 12 배지를 사용하여 37 °C, 5% CO2 조건의 습윤 인큐베이터 내 멸균 조직 배양 접시에서 배양되었습니다. 단층의 Bon-1 세포가 70~80% 합류도(confluency)에 도달하면, 생물안전작업대(biosafety cabinet)에서 단일 세포 현탁액을 준비합니다.

배지를 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 1 mL의 TrypLE을 첨가하고 37 °C에서 5분 동안 배양하여 디쉬로부터 세포를 떼어냅니다. 현미경으로 모든 세포가 디쉬에서 분리되었는지 확인한 후, 트립신에 9 mL의 성장 배지를 첨가합니다.

안구 세포를 파이펫으로 수차례 위아래로 섞어 균일한 단일 세포 현탁액이 되도록 합니다. 70 micron 세포 스트레이너를 사용하여 세포를 여과합니다. 여과된 세포를 수집하여 세포 수를 측정하고, 10% FBS가 포함된 D-M-E-M-F 12 성장 배지에서 mL당 5,000 cells의 현탁액을 준비합니다.

분주할 세포 수는 6일째 구체의 크기에 따라 경험적으로 결정해야 합니다. 이상적으로는 구체의 직경이 300에서 400 µm 사이가 되도록 하는 것이 좋습니다. 이러한 이유로, 본 실험에서는 웰당 200 µL의 부피에 1,000개의 세포를 분주합니다.

본 절차를 시작하려면, 이전에 준비한 aero 코팅 24웰 플레이트의 각 웰에 단일 세포 현탁액 200 µL를 얹고, 증발을 방지하기 위해 멸균 실링 테이프로 24웰 플레이트를 밀봉하십시오. BON-1 세포가 담긴 aero 코팅 24웰 플레이트를 5% CO2가 포함된 37 °C 습윤 인큐베이터 내의 오비탈 쉐이커에 놓고 매우 느린 속도로 교반하며 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날 아침에 플레이트를 안정적인 플랫폼으로 옮기고, 인큐베이터 내에서 3일마다 배양을 유지하십시오.

플레이트의 각 웰에 성장 배지 200 µL를 추가합니다. 오가노이드(phe)가 흐트러지는 것을 방지하기 위해, 피펫 팁을 웰의 벽면에 대고 배지가 벽면을 타고 웰 내부로 흘러 들어가게 합니다. 현미경으로 24 웰 플레이트 내의 OID 형성을 관찰합니다. 3D 스테로이드의 약물 처리는 배양 6일 차에 시작합니다.

스페로이드의 직경이 약 300에서 400 µm가 되었을 때를 6일 차의 약물 처리 기준일인 0일 차로 지정합니다. 약물 처리가 각 웰에서 1x 최종 농도가 되도록 플레이트의 각 웰에 약 400 µL의 배지를 넣습니다. 각 처리 용량에 대해 원하는 농도의 3배 농도로 조제하며, 15 mL 원추형 튜브에 5 mL의 성장 배지와 적절한 양의 약물 스톡을 희석하여 8개의 반복 실험군에 충분한 양을 준비합니다. 24웰 플레이트의 각 행에 있는 PHE는 vehicle, dose 1, 2, 3, 4 및 5로 구분됩니다. 각 24웰 플레이트에는 처리 용량별로 4개의 반복 실험군이 있습니다.

일반적으로 3D phe는 최소 2개의 24-well 플레이트에서 처리하며, 이를 통해 각 처리 용량당 최소 8개의 반복 실험군을 확보합니다. 각 well에 처리제를 첨가하기 전, 3D 스테로이드의 부유 특성으로 인해 천장 테이프에 맺힌 모든 응결수가 well 내부로 들어갈 수 있도록 24-well 플레이트를 스핀 다운(spin down)합니다. 원심분리 후 각 well의 배지는 제거하지 않습니다.

구형체를 자극하지 않도록, 각 처리 농도별로 200 µL씩 각 웰의 벽면을 따라 조심스럽게 분주합니다. 24-웰 플레이트를 실링 테이프로 밀봉하고, 5% CO2가 포함된 37 °C 습윤 배양기에서 배양합니다. 약물 처리 후 설정한 각 시점마다 위상차 현미경으로 3D 스테로이드 배양물을 관찰합니다.

PHE는 10 x 대물렌즈를 사용할 경우 이미징 시야를 빠르게 벗어나므로 5 x 대물렌즈가 이상적입니다. HistoGel 처리 전, 각 시점마다 각 웰에 있는 스테로이드를 이미징합니다. 임베딩을 위해 24-웰 플레이트에서 3D 스테로이드를 수집하고 10% Formin으로 고정합니다.

차가운 HistoGel 튜브를 물이 담긴 비커에 넣습니다. 비커를 전자레인지에서 1분 동안 또는 겔이 완전히 액화될 때까지 가열합니다. 실험 절차가 진행되는 동안 튜브를 해당 수조 비커에 계속 넣어 둡니다.

일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 모든 스테로이드를 생검용 cryo mold로 옮깁니다. 스테로이드가 생검용 cryo mold 바닥으로 가라앉을 때까지 1분 동안 그대로 둡니다.

킴와이프스(Kim wipes)를 사용하여 생검 냉동 몰드(biopsy cryo mold) 내의 액체를 제거하십시오. 이쑤시개를 이용해 스테로이드를 생검 냉동 몰드 바닥의 중앙으로 매우 조심스럽게 밀어 넣습니다. 그다음, 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)을 사용하여 스테로이드가 생검 냉동 몰드의 중앙에 유지되도록 매우 부드럽게 조절하십시오.

따뜻하게 데운 HistoGel을 생검 cryo mold에 얇게 도포합니다. HistoGel을 너무 많이 넣지 마십시오. 스테로이드를 중앙에 고정시킬 수 있을 만큼의 양만 사용하십시오.

HistoGel 내의 스테로이드를 실온에서 1~2분 동안 또는 HistoGel이 응고될 때까지 둡니다. 생검 cryo mold의 나머지 부분을 따뜻하게 데운 HistoGel로 채우고, 실온에서 약 10분 동안 응고되도록 합니다. 이 OIDs HistoGel 블록을 생검 cryo mold에서 꺼내기 직전에 수행하십시오.

크라이오 몰드를 얼음 위에 1분 동안 둔 다음, 온전한 상태의 스테로이드 HistoGel 블록을 꺼냅니다. 블록을 바이오 랩으로 감싸 조직 및 생검 카세트에 넣습니다. 조직 및 생검 카세트를 70%ethanol이 들어있는 용기에 보관하십시오.

그 후, aeros 코드가 표시된 24웰 플레이트에서 배양된 경우 파라핀 매립을 위한 일반적인 조직 처리 절차를 수행합니다. 여기서 보는 바와 같이, 서로 다른 신경내분비 세포주들은 각기 다른 형태를 나타냅니다. 인간 췌장 신경내분비 세포주 BON-1과 인간 폐 신경내분비 세포주 H 7 27은 3D 스페로이드를 형성했습니다.

이와 대조적으로, qgp one의 경우입니다. 인간 췌장 망상 세포는 스테로이드로 간주되지 않는 커다란 포도 송이 모양의 다공성 덩어리를 형성합니다. agros가 코팅된 24웰 플레이트에 세포를 파종한 후, 일반적으로 3일 또는 4일째에 다세포 스테로이드 형성이 일어나며, 6일째가 되면 스테로이드의 형태가 더 둥글게 변합니다.

영양분과 산소의 제한으로 인해, 스테로이드의 밀집된 핵 내에 있는 세포들은 약 10일경부터 사멸하기 시작하며, 17일경에는 스테로이드가 붕괴되기 시작합니다. 거대한 크기 또는 일부 사례에서의 괴사성 코드(necrotic cord) 배출로 인해, 스테로이드는 일반적으로 직경 1000 microns까지 성장할 수 있습니다.

본 실험에서는 트리코스타틴 A(TSA)인 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 처리를 위한 시작점으로 6일 차 3D 오가노이드를 선정하였습니다. 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제는 신경 세포에 대해 증식 억제 및 전-세포사멸 효과를 나타내는 것으로 이전에 보고된 바 있습니다. 이 이미지들은 처리 시작 시점과 처리 24, 48, 72, 96시간 후의 3D 오가노이드 형태 변화를 추적한 것입니다.

V는 DMSO인 용매(vehicle) 처리를 나타냅니다. D1에서 D5는 TSA 용량을 점진적으로 증가시켜 처리한 것을 나타냅니다. 각 개체의 OID 크기는 자체 개발한 MATLAB 컴퓨터 프로그램에 의해 자동으로 추정되었습니다.

각 시점별 TSA 처리 용량당 최소 8개의 sph를 측정하였으며, 그 결과는 대조군(vehicle) 대비 이 그래프에 표시되었습니다. 모든 용량의 TSA가 3D OID에서 어느 정도의 성장 억제를 나타냈습니다. 125 nM 및 250 nM의 TSA 농도에서 3D 스테로이드의 성장이 강력하게 억제되어 최종 3D 스테로이드의 조직학적 특성을 파악할 수 있었습니다.

17일 동안 배양한 3D 스테로이드에 대해 H and e 염색 및 면역조직화학 염색을 수행하였습니다. KI 67은 증식하는 세포의 마커이며, cleaved caspase three는 세포 사멸 세포의 마커입니다. 결과에 따르면 3D 스테로이드의 외층 세포는 활발하게 증식하고 있는 반면, 중심부의 세포들은 대부분 괴사 또는 세포 사멸 상태인 것으로 나타났습니다.

이 절차를 마친 후, 이러한 3D 스테로이드의 세포 생존율을 결정하기 위해 cell titer glow assay와 같은 추가 분석을 수행할 수 있습니다. 이 기술이 개발되면 96웰 플레이트로 확장하여 고속 스크리닝을 수행할 수 있으며, 이는 암 연구에서 치료제 발굴을 촉진할 것입니다.