Name: 기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 학습하세요 piggyBac 트랜스포존 시스템을 이용한 기본 인간 T 세포의 안정적인 유전자 수정 방법입니다. 비바이럴 방식으로 장기간 유전자 발현이 가능하며, 면역치료 연구에 활용됩니다.

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SS는 TBMM 프로그램을 통해 그라드 교육 교부금에 HHMI 메드에 의해 부분적으로 지원됩니다. MHW는 재향 군인의 담당 부서에서 경력 개발 상 박사 부부 해롤드 M. Selzman의 관대 한 지원에 의해 부분적으로 지원됩니다. 이 작품은 NIH 림프종 포자 부여 P50CA126752와 NIH R01 DK093660에 의해 부분적으로 지원되었다.

일 0 1. 인간의 피에서 PBMCs의 절연 <ol><li> 오세영 - 헤파린 vacutainer 튜브에 venipuncture를 사용하여 신선한 인간의 피 20 ML를 수집합니다. </li><li> 믹스의 피와 1시 1분의 고급 RPMI 1640 (V / V) 비율입니다. </li><li> 50 ML의 원심 분리기 튜브 (25 ° C) 20 ML lymphoprep 매체를 추가 할 수 있습니다. lymphoprep 상단에 혈액 RPMI 1640 믹스 천천히 층 25-30 ML. </li><li> 브레이크없이 40 분 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 1X PBS (25 ° C)의 10 ML에 일회용 피펫을 사용하여 독특하고 퍼지 레이어를 모두 수집하고 1X PBS있는 50 ML에 볼륨을 가져. </li><li> 10 분에 450 XG에 원심 분리기. </li><li> 완전히 표면에 뜨는을 대기음 및 고급 RPMI 1640의 20 ML를 추가합니다. </li><li> 5 분 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 표면에 뜨는을 대기음. 5 NG / ML rhIL-15과 보충 완전한 T 세포 미디어 10 ML를 추가 37 ° C.에 prewarmed </li><li> 24 잘 조직 문화 코트에서 세포와 판의 수를 카운트/ 잘 완전한 T 세포 미디어 2 X 10 6 세포에서 에드 판은 5 NG / ML rhIL-15는 주변 우물에 멸균 물을 추가로 보충. 37 humidified 인큐베이터에서 하루 아침에 길러 ° C, 5 % CO 2. </li></ol> 1 일 2. T 세포를 자극을위한 안티 CD28 및 안티 3 번 CD 항체로 코팅 플레이트 <ol><li> 1 μg / ML 각각의 농도에서 살균 물에 안티 CD28 및 안티 3 번 CD 항체를 희석. </li><li> 비 코팅 조직 문화 24 잘 플레이트의 5 표시 우물 500 μl 각 항체 솔루션을 추가합니다. </li><li> 우물의 휴식 멸균 물을 추가합니다. 4 ° C 냉장고에서 수축 랩과 장소에 판을 넣어. </li></ol> 3. Unstimulated T 세포의 Nucleofection <ol><li> 37 번 Prewarm T 세포 미디어 ° C와 rhIL-15 5 NG / ML로 보충. Nucleofector 솔루션의 2.25 ML에 Nucleofector 보충 한 500 μl를 추가하여 완벽한 nucleofector 솔루션을 준비합니다. </li><li>liquot 5 μg transposon (Zeo-PT-CMV-eGFP)와 1.5 ML의 microfuge 관 transposase (pCMV-piggyBac)의 각. 참고 :이 최적의 유전자 전달을위한 transposase와 transposon의 DNA 금액을 최적화하고 최소화하기 위해 필요할 수 있습니다 세포 독성. plasmids 요청에 의해 저자에서 얻을 수 있습니다. </li><li> 50 ML 튜브에 24 잘 조직 배양 플레이트에서 수확 PBMCs. 셀의 개수를 계산합니다. 유동 세포 계측법 동안 제어 등의 사용이 X 10 6 세포를 저장합니다. </li><li> 400 XG, 5 분에서 15 ML 튜브와 원심 분리기에 7-10 X 10 6 세포를 추가 표면에 뜨는 및 손가락 제스처 펠릿 대기음. </li><li> 느슨하게 세포 펠렛에 대한 T 세포 완벽한 nucleofection 솔루션 100 μl를 추가합니다. </li><li> plasmids를 포함하는 관에 솔루션 세포 혼합물을 추가합니다. </li><li> nucleofection 큐벳의 맨 아래에 솔루션 휴대 플라스미드 혼합물을 추가합니다. 모든 거품을 소개하지 않도록주의하십시오. </li><li> 프로를 사용하여 셀을 Nucleofectg U-014 (Unstimulated T 세포, 인간, <a href="http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/" target="_blank">http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/</a> ). </li><li> 즉시 큐벳에 rhIL-15 prewarmed 미디어 500 μl를 추가합니다. rhIL15과 prewarmed 미디어의 1.5 ML과 24 잘 접시의 우물에 세포를 전송합니다. </li><li> 37 humidified 인큐베이터에서 하루 아침에 길러 ° C, 5 % CO 2. </li></ol> 2 일 4. T 세포의 특이 현상 자극 <ol><li> 수확 셀 및 셀 번호를 결정합니다. GFP 양성 세포의 빈도를 결정하는 유동 세포 계측법 0.5 X 10 6 세포를 따로 설정합니다. 컨트롤로 비 transfected PBMCs을 사용합니다. </li><li> 비 조직 배양 코팅 플레이트에서 CD3/28 항체 솔루션을 기음과 T 세포 미디어와 각 잘 씻어. </li><li> 전체 CTL 미디어 ML 당 0.5 X 10 6 세포에서 nucleofected 세포를 Resuspend5 NG / ML rhIL-15 보충. 2.0 ML 이외의 조직 문화 판의 4 우물에 nucleofected 셀의 각을 추가합니다. 잘 5 일에 0.5 X 10 6 비 nucleofected 셀을 추가합니다. </li><li> 37 humidified 인큐베이터에서 3 일 동안 배양 ° C, 5 % CO 2. </li></ol> 5 일 <ol><li> 비 코팅 조직 문화 판에서 자극 T 세포를 수확. </li><li> 0.7에서 24도 코팅 조직 배양 판에있는 셀을 카운트하고 replate X 10 5 NG / ML IL-15 6 세포 / T 세포 미디어 ML.주세요 </li></ol> 7 일 7. 유전자 발현 분석 <ol><li> 수확 세포와 반 인간 CD8 항체와 얼룩은 (또한 반에는 3 번 CD 및 안티 CD4를 사용할 수)와 %의 GFP 발현을위한 유동 세포 계측법을 분석합니다. </li></ol> 일 8 (선택 사항) 8. T 세포의 확장 <ol><li> transfection 후 일 8 일, T 세포는 T에 replated 할 수 있습니다더 확장 16도 당 0.7 X 10 6 세포 밀도에 IL-15과 셀은 미디어. </li></ol>

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<li>Vera, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J. Immunother. 33 (3), 305(2010).</li>
<li>Kahlig, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343(2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 설명 된 방법은 기본 인간 T 림프구의 안정적인 transgene의 수정이 가능합니다. 우리는 이전에 리포터 유전자 (4 개 이상의 주), 비 immunogenic 자살 유전자 입양 immunotherapy에 대한 키메라 항원 수용체를 (100 개 이상의 일), 표현하는 T 세포를 수정하는 piggyBac transposon 시스템의 사용을 테스트 한 그리고 면역 억제 약물 7,13-15에 대한 내성을 처리합니다. 입양 immunotherapy 및 기타 응용 프로그램을위한 T 세포의 비 바이러스 성 수정은 retroviral 전달보다 훨씬 저렴하기 때문에 더 많은 활용해야합니다. 새로운 활동적인 piggyBac 요소의 사용은 인간의 T 세포에게 9 수정 안정적인 transgene의 제조의 가능성이 높아집니다. 여기에 설명되지 않았지만, 하나는 잠재적 인 임상 응용 프로그램에 대한 안정적 transfected T 세포의 필요한 숫자를 얻을 수 있습니다...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> Lympholyte </td><td> Cedarlane </td><td> CL5015 </td><td></td></tr><tr><td> 고급 RPMI 1640 </td><td> LifeTechnologies </td><td> 12633020 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone 태아 소 혈청 </td><td> 피셔 과학 </td><td> SH3008803 </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX-I의 보충 </td><td> LifeTechnologies </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 IL-15 재조합 단백질 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8159 </td><td></td></tr><tr><td> EndoFree 플라스미드 맥시 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 12,362 </td><td></td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001S </td><td> &amp; NBSP; </td></tr><tr><td> 인간 T 세포 Nucleofector 키트 </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CD8-APC </td><td> 남부 생명 공학 </td><td> 9536-11 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 인간 3 번 CD </td><td> eBioscience </td><td> 16-0037-81 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 인간 CD28 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555725 </td><td></td></tr><tr><td> 24 잘 조직 문화 치료 플레이트 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 24 자 비 조직 문화 판을 치료 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 351147 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 전체 T 세포 미디어 구성 1X 고급 RPMI 1640 5 %의 열 Inactivated 태아 소 혈청 이 MM GlutamaxIM-I </td></tr></tbody></table>

기본 인간 t 세포 piggybac transposon 시스템 변경

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon 시스템은 원래 양배추 자벌레 나방의 1,2에서 파생, 자연적으로 활성화됩니다. 이 비 바이러스 시스템은 가장 일반적으로 하나가 piggyBac transposase 효소 및 유전자 전달 활동에 필요한 역 반복 요소 사이에 관심의 유전자를 (들) 숨겨 플라스미드 transposon을 표현으로 두 plasmids을 활용, 기반 플라스미드입니다. PiggyBac의 mediates 유전자 전송을 통해 transposase 관심의 대상 셀 (들)의 게놈에 transposon 세그먼트를 통합된다 &quot;잘라 내기 및 붙여 넣기&quot;메커니즘이 있습니다. PiggyBac 3-5 포유류의 곤충 1,2의 다양한 효율적인 유전자 전달 활동을 시연하고있다 7,8 차 인간의 T 세포를 포함 cells6 인간. 최근 활동적인 piggyBac의 transposase는 유전자 전달 효율을 향상 9,10 생성되었습니다. 인간 T 림프구는 임상 intere의 역할암 (11)의 입양 immunotherapy에 대한 ST. 참고 중, 잠자는 숲속의 미녀의 transposon 시스템을 사용하여 인간의 T 세포의 transposon 수정을 포함한 첫 번째 임상 실험은 12을 승인했습니다. 우리는 이전에 인간의 T 세포의 유전자 변형에 대한 비 바이러스 성 방법으로 piggyBac의 유틸리티를 평가하고 있습니다. 우리는 리포터 유전자와 비 immunogenic inducible 자살 유전자 7 인간의 T 세포의 유전자 변형에 효율이 piggyBac 발견했다. 게놈 통합 사이트의 분석은 13로 또는 알려진 proto-oncogenes 근처 통합 환경의 부족을 공개했다. 우리는 종양 항원 HER2에 대한 감독 키메라 항원 수용체를 수행하는 유전자 - 수정 세포 독성 T 림프구에 piggyBac 사용하고, 유전자 수정 된 T 세포가 orthotopic 마우스 모델에서 체외 및 생체 내 HER2-양성 종양 세포의 살인을 대상으로 중재 것을 발견 14. 우리는 또한 piggyBac을 사용한rapamycin은 15 활용 암 치료에 도움이 될 것 rapamycin에 강한 인간의 T 세포를 생성 할 수 있습니다. 여기, 우리는 유 전적으로 인간의 기본 T 세포를 수정 piggyBac을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 문화, 유전자 수정, 및 T 세포의 활성화에 이어 인간의 피에서 말초 혈 mononuclear 세포 (PBMCs)의 절연을 포함하고 있습니다. 이 보고서의 목적을 위해, T 세포는 유동 세포 계측법에 의한 유전자 발현의 분석 및 정량화를위한​​ 리포터 유전자 (eGFP)로 수정되었습니다. PiggyBac는 관심 유전자의 다양한 인간의 T 세포를 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 우리가 종양 항원 14 T 세포를 직접 할 수 piggyBac 사용했지만, 우리는 또한 7 필요한 경우 유전자 변형 세포를 제거하기 위해 inducible 안전 스위치를 추가 할 수 piggyBac 사용했습니다. piggyBac의 대형화물 용량은 유전자 전송을 사용하고 있습니다큰 rapamycin의 방지를 mTOR 분자 (15 KB) 15. 따라서, 우리는 목적으로 다양한 종류의에 대한 일차적 인간의 T 세포의 안정적인 유전자 변형에 대한 비 바이러스 방법론을 제시한다.

유전자 리포터 유전자 (eGFP)와 인간의 T 림프구를 수정의 단계를 보여주는 도식은 그림 1에 표시됩니다. 이러한 plasmids은 작성자의 요청시 이용 가능합니다. 리포터 유전자 (eGFP)와 유전자 변형 인간 T 림프구의 단계를 보여주는 schemtic은도 2의 바바리 수 있습니다. 그것은 그들에게, 분할 확장하고 문화에 전파하게하기 위해 T 세포를 활성화 할 필요가 있습니다. 수정 인간의 T 세포는 이후 배양 및 일 1 일 7 일 유전자 발현에 대한 유동 세포 계측법을 사용하여 분석 하였다. 표시는 그림 3에서 한 기증자의 결과입니다. 셀 셀 퀘스트 소프트웨어를 사용하여 allophycocyanin (APC) 복합 항 CD8, 4 형광 신호에 대한 필터 세트가 마련되어 FACSCalibur에 의해 eGFP (transgene)와 APC 형광에 대한 분석 물들되었습니다 (...

우리는 유전자 비 바이러스를 사용하여 transgene과 기본 인간의 T 세포를 수정하는 방법을 설명<em&gt; piggyBac</em&gt; transposon 시스템입니다. T 세포는를 사용하여 수정<em&gt; piggyBac</em&gt; transposon 시스템 전시 안정적인 transgene 표현.

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

piggyBac 트랜스포존 시스템은 배추흰나비(cabbage looper moth)에서 유래한 천연 활성 시스템입니다. 이 비바이러스성 시스템은 플라스미드 기반으로, 대부분...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 비바이러스성 트랜스포존 시스템을 사용하여 일차 인간 T 세포에 유전자를 안정적으로 도입하고 수정하는 것입니다. 먼저, 인간의 혈액을 채취한 후 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 분리합니다. 이어서 piggyBac 트랜스포존 시스템과 EGFP와 같은 목적 외래 유전자로 PBMC를 형질전환합니다. 그 다음, 배양액 내에서 T 세포가 증식하도록 자극합니다.그 다음 T 세포의 외래유전자 발현 여부를 분석합니다. 최종적으로, flow cytometry 분석을 통해 piggyback 트랜스포존 시스템으로 변형된 T 세포에서 외래유전자가 안정적으로 발현됨을 확인합니다. 인간 T 세포의 플라스미드 형질전환과 달리, 트랜스포존은 외래유전자를 안정적으로 통합시켜 장기적인 발현을 가능하게 한다는 장점이 있습니다.핵심은 분리 과정 중 및 핵산 도입 후 P BMC를 처리할 때 매우 구체적인 프로토콜을 따르는 것입니다. 당사는 먼저 다양한 유전자를 발현시키기 위한 배양된 인간 안정 세포주를 만들기 위해 이 방법을 구현했습니다. 이러한 접근 방식은 T세포를 어떻게 수정하여 기능을 향상시킬 수 있는지와 같은 면역학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 됩니다. 정맥 천자를 이용한 이 절차는 본 연구실의 대학원생인 sunon과 saha가 시연할 것입니다.신선한 사람 혈액 20 milliliters를 소듐 헤파린 vacutainer 튜브에 수집합니다. 혈액과 advanced RPMI 1640 배지를 1:1 비율로 혼합합니다. 그 다음 50 milliliter 원심분리 튜브에 lympho prep 배지 20 milliliters를 넣습니다.희석된 혈액 25 ~ 30 milliliters를 lympho prep 위에 천천히 층을 이루도록 붓고, 브레이크 없이 400 times G에서 40분 동안 원심분리합니다. 뚜렷한 층과 흐릿한 층을 모두 실온의 PBS 10 milliliters에 옮깁니다. PPBS를 사용하여 총 부피를 50 milliliters로 맞춥니다.그 다음 450 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 회수하고 상층액을 완전히 흡입해 제거한 후, 원심분리 후 20 mL의 advanced RPMI로 세포를 1회 세척합니다. 세포 펠렛을 5 ng/mL의 재조합 인간 IL-15가 첨가된 10 mL의 완전 T-세포 배지에 현탁합니다. 이제 세포 수를 측정한 후, 24웰 조직 배양 코팅 플레이트에 웰당 2 × 10⁶ cells로 분주합니다.그런 다음 주변의 모든 웰에 멸균수를 추가합니다. P BMCs를 37 °C, 5% CO2의 습윤 배양기에서 하룻밤 동안 배양합니다. anti-CD 28 및 anti-CD 3 항체를 멸균수로 희석하여 1 µg/mL 농도로 조절합니다.코팅되지 않은 24웰 조직 배양 플레이트의 표시된 5개 웰에 각 항체 용액 500 µL씩을 추가합니다. 그런 다음 나머지 웰에는 멸균수를 추가합니다. 플레이트를 랩으로 감싸 4 °C에 보관합니다.T-세포 배지를 37 °C에서 예열하고, 5 ng/mL의 recombinant human IL 15를 첨가합니다. 또한 신선한 complete nucleo effector solution을 준비합니다. 이제 1.5 mL fuge tube에 transposon과 transpose A를 각각 5 µg씩 분주합니다.최적의 유전자 전달을 위해 전이효소 A와 전이인자 DNA의 양을 최적화하는 것이 필요할 수 있습니다. 또한 세포 독성을 최소화하기 위해, 24웰 조직 배양 플레이트에서 PBM CS를 수확하여 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 세포 수를 센 후, 유세포 분석 시 대조군으로 사용할 2 × 10⁶ 개의 PBMC를 보관하십시오.다음으로, 700만에서 1,000만 개의 세포를 15 mL 튜브에 넣고 400 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고 펠렛을 가볍게 쳐서 풀어줍니다. 느슨해진 세포 펠렛에 T-cell complete nucle affection solution 100 µL를 첨가합니다.이제 용액 세포 혼합물을 플라스미드에 추가합니다. 그다음, 용액 세포 플라스미드 혼합물을 Nucleofection 큐벳 바닥에 넣습니다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 프로그램 U-014를 사용하여 세포를 Nucleofect 합니다.자극되지 않은 인간 T 세포의 경우, cells를 R-H-I-I-L 15가 첨가된 pre-war media 1.5 milliliters가 들어 있는 well로 옮기고, 핵이 영향받지 않은 unstimulated T cells를 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 세포를 수확한 후 세포 수를 결정하고, GFP 양성 세포의 빈도를 유세포 분석으로 결정하기 위한 대조군으로 transfection되지 않은 pbmc 0.5 × 10⁶개를 따로 분리하십시오. 그런 다음, non tissue culture coated plate에서 CD 3 28 항체 용액을 흡입하여 제거하고, 각 well을 T-cell media로 헹구어 재현탁하십시오.핵 영향 세포를 0.5 × 10⁶ cells/mL 농도로 조절합니다. 5 ng/mL의 rhIL-15가 첨가된 완전 CTL 배지 2.0 mL에 핵 영향 세포를 섞어, 비조직 배양 플레이트의 4개 웰에 각각 분주합니다.0.5 × 10⁶개의 비핵 영향을 받은 세포를 추가합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 조건의 습윤 배양기에서 3일 동안 배양합니다.5일 차에 코팅되지 않은 조직 배양 플레이트에서 자극된 T 세포를 수확합니다. 그다음 5 ng/mL의 IL 15가 포함된 T 세포 배지에서 0.7 × 10⁶ cells/mL 농도로 코팅된 24-웰 조직 배양 플레이트에 분주합니다. 세포를 수확한 후, GFP 발현율(%)을 확인하기 위해 CD8, CD3 또는 CD4에 대해 면역 염색을 수행하며, T 세포의 증식이 필요한 경우 유세포 분석기로 세포 준비물을 분석합니다.그 후 8일째에, 형질전환 후 인간 T 세포의 piggyback 매개 유전자 수정을 위해 IL 15가 포함된 T 세포 배지에서 웰당 0.7 × 10⁶ cells의 밀도로 세포를 플레이트에 분주합니다. 일차 인간 세포는 두 개의 플라스미드로 형질전환됩니다. 트랜스포스 플라스미드는 CMV 프로모터 하에서 piggyback 단백질의 지속적인 발현을 유도합니다.transpo 플라스미드에는 GFP 리포터와 유전자 전달에 필요한 piggyback 역반복 서열이 포함되어 있습니다. piggyback 트랜스포존 시스템으로 형질전환된 T 세포의 안정적인 GFP 트랜스진 발현은 FACS 분석을 통해 확인할 수 있습니다. 본 실험에서는 1일 차에 PC가 접합된 anti-CD8로 세포를 염색한 후 EGFP 및 APC 형광을 분석하였습니다.CD8 양성 세포의 76.4%에서 EGFP 발현이 검출되었습니다. 1일 차와 7일 차 사이의 EGFP 발현 감소는 모든 형질전환 세포에서 트랜스포존(transpose)의 안정적인 DNA 통합이 일어나지 않았기 때문일 가능성이 큽니다. 이제 PBMC를 분리하고 유전자를 안정적으로 도입하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.피기백 전이효소(piggyback transpose) 시스템을 이용하여 이들을 수정하십시오. 채혈 시에는 반드시 무균법을 사용하십시오. 세포 생존력을 유지하기 위해 신속하게 작업하십시오.이 절차 이후, T세포의 항원 특이성을 결정하기 위해 T세포 세포독성 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 향후 실험에서는 암 및 마우스 모델을 대상으로 T세포 기반 면역 요법을 위한 트랜스포존의 활용을 탐구할 예정입니다.

piggybac-transposon-system-modification-of-primary-human-t-cells

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을...

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

이 비디오는 계통 특이적 전사 인자의 이소성 발현에 의해 PiggyBac 전이 시스템으로 인간 iPSC를 transfection하여 운동 뉴런을 생성하는 절차를 보여줍니다.

인간 iPSC에서 PiggyBac Transposon-매개 유전자 편집: PiggyBac Transposon 시스템을 사용하여 인간 iPSC에 관심 유전자를 통합하는 절차

CD19 별 키메라 항원 수용체 (자동차)를 표현하는 T 세포는 우리의 첫번째 인 인간 유전자 치료 시험에서 B-세포 malignancies의 investigational 치료로 주입됩니다. 우리는을 사용하여 T 세포의 유전자 변형을...

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

이 연구에서는 비바이러스 기반 전이(transposon) 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포에서 유도 만능 줄기 세포를 생성합니다.

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

이 프로토콜 transcriptionally 규제 잠자는 미녀 시스템에 의해 인간 게놈에 관심사의 유전자의 안정적인 통합을 달성 하는 방법을 설명 합니다. 결함이 lentiviral 벡터, 인간의 세포, 생체 외에서 변환 및 불리고 세포에 분자 분석 결과의 통합의 준비 보고 됩니다.

효율적인 체 외에서 이항 메서드인 Transcriptionally 규제 자 아름다움 시스템 통합 결함이 Lentiviral 벡터에 포장 하 여

우리는 세포 효능의 주입 연구를 위한 충분한 수에 있는 관심 있는 유전자의 우수한 공동 발현을 가진 세포를 산출하는 rhesus macaque 말초 혈액 단핵 세포의 transduction 그리고 확장을 위한 9 일 프로토콜을 개략적으로 설명합니다.

중앙 메모리 표현형의 유지 보수와 함께 9 일 만에 1 차 T 세포의 전환 및 확장

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

우리는 잠자는 숲속의 미녀 (SB) 트랜스포존 시스템을 사용하여 색소 상피 유래 인자 (PEDF)를 코딩하는 유전자로 전기 천공함으로써 1 차 인간 색소 상피 세포를 형질 감염시키는 프로토콜을 개발했습니다. 성공적인 형질감염은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 면역블로팅 및 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 입증되었다.

잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 이용한 1차 인간 색소 상피 세포의 전기천공 기반 유전자 변형

여기서, 다양한 포유류(마우스, 쥐, 토끼, 돼지 및 소)로부터 일차 홍채 및 망막 색소 상피 세포를 분리하고 변형시키는 프로토콜이 제시된다. 이 방법은 전 생체 분석 및 인간에게 양도 할 수있는 생체 내 연구를위한 다양한 셋업에서 안구 유전자 치료 접근 방식을 연구하는 데 이상적입니다.

비 바이러스 유전자 치료를 위한 포유류 1차 안료 상피 세포의 격리, 배양 및 유전 공학

가을 군벌레, 스포드옵테라 검거르다에서성공적인 생식선 변환은, 활동적인 돼지박 트랜스포사제의 mRNA를 사용하여 달성되었다.

가을 육군벌레, 스포드옵테라 검소한에서 활동적인 피기박 트랜스포사스 중재 된 세균라인 변환

CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 homology-mediated end joining (HMEJ) DNA repair pathway를 통해 1차 인간 T 세포에서 큰 multicistronic 구조체의 고효율 표적 knock-in을 달성하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 cGMP 적응 프로토콜로 조작된 T 세포는 우수한 세포 증식, 세포 독성 및 사이토카인 생산을 유지합니다.

대형 DNA 주형의 상동성 매개 말단 결합을 통한 일차 인간 T 세포의 비바이러스 공학

학습하세요 piggyBac 트랜스포존 시스템을 이용한 기본 인간 T 세포의 안정적인 유전자 수정 방법입니다. 비바이럴 방식으로 장기간 유전자 발현이 가능하며, 면역치료 연구에 활용됩니다.

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

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