CRISPR / 카스 시스템의 Endonucleases을위한 기판 생성

다음 실험의 전반적인 목표는 Cas Endonuclease에 대한 RNA 기질을 얻기 위해 박테리아 및 ArcHa에서 발견되는 crispr Cass 면역 체계에서 중요한 역할을 하는 Cas Endonuclease 연구를 위한 RNA 기질을 생성하는 것입니다. 특정 CRISPR 영역의 PCR 증폭을 사용하여 in vitro RNA 생산을 위한 긴 DNA 템플릿을 얻을 수 있습니다. 원하는 경우.

두 개의 올리고뉴클레오티드를 무릎을 꿇고 기질 RNA 생산을 위한 더 짧은 템플릿을 생성할 수 있습니다. 또는 짧은 맞춤형 합성 반복 염기서열을 CAS 엔도뉴클레아제 분석에서 테스트할 수 있습니다. 궁극적으로, RNA 전사체의 생성과 CAS six 엔도뉴클레아제에 의한 후속 절단은 자동 방사선 촬영으로 시각화할 수 있습니다.

발표자 기술의 주요 목표는 연구자들이 다양한 길이의 RNA 기질로 CRISPR RNA 처리를 연구할 수 있도록 하는 것입니다. 따라서 작은 RNA를 생성하기 위해 다양한 방법, 예를 들어 단일 반복 요소 또는 여러 스페이서에 걸쳐 있는 crispr, RNA, 전사체와 같은 더 큰 RNA가 사용됩니다. 이러한 방법은 특히 CRISPR RNA 성숙에 대한 통찰력을 제공하지만, 유사한 템플릿 준비 전략이 다른 RNA 처리 시스템에 채택될 수 있지만, 절차가 음소거될 것임을 시연하면 실험실에서 박테리아 및 ArcHa CRISPR 면역 체계의 실험실에서 대학원생을 표면화하고 박사 후 연구원을 repl할 수 있습니다.

프로토 스페이서(proto spacer)라고 하는 바이러스 DNA 염기서열은 적응(adaptation)이라는 과정에서 성장하는 CRISPR 클러스터의 두 반복 요소 사이에 삽입될 수 있습니다. 다음으로, 전체 CRISPR 클러스터를 전사한 다음 Cass Endonuclease(예: CAS six)에 의해 작은 CRISPR RNA로 처리합니다. 그런 다음 작은 CRISPR RNA는 CAS 단백질 복합체 캐스케이드에 통합되고 CRISPR RNA와 프로토 스페이서 사이의 염기 상보성을 바이러스 DNA 분해 신호로 활용하여 긴 pre CRISPR RNA 기질을 생성함으로써 반복되는 바이러스 공격에 대한 숙주 방어를 매개합니다.

T seven RNA polymerase promoter sequence를 forward primer에 추가하여 CRISPR 클러스터의 spacer 영역을 표적으로 하는 PCR primer를 설계합니다. 그런 다음 PCR 산물을 벡터로 클로닝하기 위해 두 프라이머에 제한 부위를 추가합니다. T seven RNA 중합효소는 PCR에 의해 게놈 DNA에서 관심 있는 pre CRISPR RNA 염기서열을 증폭한 후 전사의 적절한 시작을 위해 I guine 잔류물을 필요로 합니다.

PCR 제품, Viagra aose 젤 electropheresis 및 젤 추출물을 금지된 욕망 분리하고십시오, 그 후에 금지 효소를 가진 PCR 제품을 끈끈한 끝을 창조하기 위하여 분해하십시오. 다음으로, PCR 정제 키트로 PCR 산물을 정제한 후 절단 부산물을 제거하기 위해 T 4 DNA Ligase T 4 DNA Ligase 완충액과 절단된 PCR 산물의 3:1 몰비를 해당 끈적한 말단이 있는 DFO 4개의 관련 퍽 벡터에 추가합니다. 이제 하룻밤 동안 섭씨 16도에서 결찰 반응을 배양한 다음 성공적인 결찰을 식별하기 위해 청백색 스크리닝을 사용하는 표준 프로토콜에 의해 혼합물을 유능한 대장균, DH 5 알파 세포로 변환합니다.

마지막으로, plasmid preparation kit를 사용하여 백색 콜로니에서 plasmid를 분리하고 plasmid 염기서열분석을 통해 positive clone을 식별하여 중간 크기의 pre CRISPR RNA 기질을 생성합니다. 여기에 표시된 염기서열과 유사한 원하는 CRISPR 반복 공간 염기서열을 사용하여 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드를 설계하는 것으로 시작합니다. 올리고뉴클레오티드는 T 7 RNA 중합효소 프로모터의 염기서열과 올리고뉴클레오티드를 종결한 후 말단 제한 부위를 포함하여 끈적한 말단이 형성되도록 합니다.

무릎을 꿇은 후 샘플을 섭씨 37도에서 1시간 동안 T 4개의 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 T 4개의 폴리뉴클레오티드 키나아제 완충액으로 각 올리고뉴클레오티드의 1개의 변칙인 5개의 프라임 포스포릴레이트에 배양합니다. 그런 다음 인산화된 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드를 T 4 DNA 리가제 완충액으로 가열 블록에서 섭씨 95도에서 5분 동안 배양합니다. 샘플이 혼성화된 후 열원을 끄고 실온에 도달할 때까지 약 2-3시간 동안 혼합물을 식히십시오.

이제 올리고뉴클레오티드라고 하는 올리고뉴클레오티드를 소화 및 탈인산화된 P 벡터 T 4개의 DNA 리가제 완충액과 하룻밤 동안 섭씨 16도의 TP로 접합합니다. 그런 다음 성공적인 결찰을 확인하기 위해 청백색 스크리닝을 사용하는 표준 프로토콜에 의해 결찰된 플라스미드를 유능한 대장균, DH 5 알파 세포로 변환합니다. 마지막으로, 플라스미드를 분리하고 분해 및 후속 플라스미드 염기서열분석을 통해 양성 클론을 식별합니다.

짧은 단일 반복 cas RNA 기질 염기서열은 여기에 표시된 것과 유사하게 설계할 수 있습니다. 데옥시 리보뉴클레오티드를 포함해야 합니다. RNA 절단 부위를 결정해야 하는 경우, RNA 올리고뉴클레오티드의 생산을 구현하기 위해 맞춤형 합성 시설을 활용할 수 있습니다.

선택한 맞춤형 기질로 플라스미드를 분리한 후, maxi Prep plasmid 정제 키트를 사용하여 클로닝된 단편의 다운스트림을 절단하는 제한 효소로 플라스미드를 선형화합니다. 그런 다음 완전한 분해를 확인한 후 페놀 클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 선형화된 플라스미드를 정제합니다. DEPC 처리된 멸균수에 펠릿을 현탁시켜 resus하여 핵산을 회수합니다.

이제 A-T-P-C-T-P-G-T-P 및 UTP를 포함한 새로 준비된 시험관 내 T 7 RNA 중합효소 유출 전사 혼합물에서 소화 플라스미드를 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 변성 8 몰 요소, 12 % 폴리 아크릴 아미드 겔에서 얻은 RNA 전사체를 분석합니다. 또한 mono Q 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 전사체를 정제한 다음 RNA 분획의 에탄올 침전과 DEPC 처리된 멸균수에서 펠릿의 재생으로 전사체를 회수하여 엔도뉴클레아제 분석에 의한 설계 기판을 분석하고, 자동 방사선 촬영으로 기질 밴드를 시각화하고 변성 8몰 요소에서 겔 추출로 반응 생성물을 정제하는 것으로 시작합니다.

12%poly 아크릴아미드 젤은 그 때 Clostridium 열 세포에서 이 CAS 6 단백질을 위해 보이는 것과 같이 열 강수, 니켈 NTA 착색인쇄기를 통해 원한 재조합형 CAS 단백질을 생성하고 순화합니다. 그런 다음 CAS 단백질을 새로 준비한 엔도뉴클레아제 반응 혼합물과 섭씨 37도에서 30분 동안 결합하여 엔도뉴클레아제 분석 반응이 일어나도록 합니다. 마지막으로, 8개의 몰 요소에 반응 혼합물 5개를 로드합니다.

12%poly 아크릴아미드 젤은 자동 방사선 촬영에 의하여 전기 이동법 후에 분열 제품을 구상합니다. 여기에서는 맞춤형으로 설계된 RNA 올리고뉴클레오티드와 2개의 시험관 내 RNA 전사체의 히인 블루 염색 폴리 아크릴아미드 겔이 표시됩니다. RNA 생산의 효율성은 짧은, 긴 길이 및 중간 길이 구조체 간에 차이가 있습니다.

RNA 엔도뉴클레아제 활성을 조사하려면 양성 음성 대조군과 고도로 정제된 재조합 cas 단백질이 필요합니다. 이 그림에서. Clostridium thermo cell의 CAS 6 샘플 준비의 SDS 페이지 젤.

열 침전 및 니켈 후, 표준 단백질 마커와 함께 실행되는 NTA 크로마토그래피가 표시됩니다. 적절한 음성 대조군 샘플에는 CAS six 발현이 없는 세포 용해물이 포함되어야 하지만, 동일한 CAS six 정제 절차에 따라 CAS six 제제는 필요한 높은 수준의 순도를 갖는 것으로 결정되었습니다. 여기서, co 클로스트리듐 열세포 CAS 6 단백질에 의해 반복 서열 기질로 표시된 5개의 프라임 말단의 절단은 자동 방사선 촬영으로 시각화할 수 있습니다.

각 차선에는 방사성 표지된 기질, 더하기 기호로 표시된 대로 ca six 단백질로 배양 후 RNA 또는 디옥시 리보뉴클레오티드의 첨가 여부에 관계없이 마이너스 기호, 긴 기질 또는 짧은 기질로 표시된 대로 버퍼를 음성 대조군으로 포함합니다. 위치 마이너스 9에서, 엔도뉴클레아제 반응을 촉진하기 위해 사용되었다. 이 절차에 따라 deoxy ribonucleotide가 RNA 분자에 포함되었을 때 짧은 기질의 절단이 부족하다는 점에 유의하십시오.

CAS six Nuclease는 성숙하고 선명한 RNA를 생성하는 도구로도 사용할 수 있습니다. 이러한 RNA는 캐스케이드 복합체에 통합되어 바이러스 공격의 간섭에 대한 관여에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 Cas 및 nuclease에 대한 CRISPR es 기질을 설계하고 생산하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이러한 다양한 기질은 crispr Es의 성숙 및 활용과 관련된 질문을 해결하는 데 유용합니다.