Name: CRISPR / 카스 시스템의 Endonucleases을위한 기판 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 학습하세요 CRISPR/Cas 시스템의 Cas 엔도뉴클레이즈 활성 연구를 위한 RNA 기질 생성 방법입니다. PCR 증폭과 올리고뉴클레오티드 합성을 활용하여 다양한 길이의 pre-crRNA 기질을 제작하고 자기방사영상법으로 절단을 분석하는 기술을 익히세요.

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저자는 재조합 T7 RNA 중합 효소의와 그림 1을 준비에 도움 노르만 Ebelt의 준비를 위해 Schermuly 지넷 감사드립니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680)과 최대 플랑크 협회에서 기금의 지원을받는되었다.

1. PCR을 통해 긴 사전 c​​rRNA 기판의 생성 <ol><li> CRISPR 클러스터의 공백 지역을 대상으로 디자인 PCR의 프리 머. T7 RNA의 효소를 추가 복제에 대한 기대 입문서 및 제한 사이트 (T7RNAP) 발기인 순서 (5 &#39;-taatacgactcactata-3&#39;) 모두 프리 머 (pUC19에 대한 예를 BamHI과 뒷다리 III, 그림. 2A)에 벡터로 PCR 제품 . 참고 : T7RNAP는 전사의 적절한 개시를위한 구아니딘 잔여 물이 필요합니다. </li><li> PCR에 의해 게놈 DNA에서 관심의 사전 c​​rRNA 순서를 증폭. </li><li> 아가로 오스 겔 전기 영동하여 PCR 제품을 분리하고 젤 원하는 대역의 압축을 풉니 다. 끈적 끝 (예를 들면 BamHI 및 HindIII, 그림. 2A)을 만들 제한 효소로 PCR 제품을 소화. - 제품에 의해 절단을 제거하기 위해 PCR 정화 키트를 사용하여 PCR 제품을 정화. </li><li> T4 DNA ligase에 포함되어 있습니다 결합 반응, T4 DNA ligase의 버퍼와 설정흘리고 PCR 제품 및 해당 끈적 끝으로 dephosphorylated 선형 pUC 벡터의 3시 1분 몰 비율입니다. 16 ° C 하룻밤에 혼합물을 품다. 표준 프로토콜에 의해 관할 대장균 DH5α 세포에 결합 혼합물을 변환하고 성공적인 결합을 식별하는 파란색 흰색 검사를 사용합니다. </li><li> 플라스미드 준비 키트를 사용하여 흰색 식민지에서 plasmids를 분리합니다. 플라스미드 시퀀싱에 의해 긍정적 인 클론을 확인합니다. 또한 식민지 PCR은 검사에 활용 될 수 있습니다. </li></ol> 2. DNA의 oligonucleotides의 어닐링을 통해 중간 사전 c​​rRNA 기판의 생성 <ol><li> 앞으로 디자인하고 원하는 CRISPR 반복 / 스페이서 순서로 oligonucleotides를 반대로. oligonucleotides는 T7 RNAP 프로모터뿐만 아니라 터미널 제한 사이트 (pUC19에 대한 예를 BamHI과 뒷다리 III)의 순서가 포함되어 있습니다. (그림을 참조하십시오. 2B 어닐링 후에 끈적 끝 양식을 보장하기 위해 oligonucleotides를 종료 </strong&gt;). </li><li> T4 폴리 뉴클레오타이드의 키나제의 5 μl (PNK), T4 PNK 10 배 버퍼, 2 μl ATP (10 ㎜)의 2 μl를 포함하는 별도의 20μl 반응의 각 oligonucleotide의 5&#39;-phosphorylate 1 nmol. 37에서 1 시간 동안 각각의 샘플을 품다 ° C. </li><li> 두 phosphorylated oligonucleotides를 잡종을 만들다. phosphorylated 앞으로 oligo의 혼합물 (2.2.), phosphorylated 역 oligo의 혼합물 (2.2.), 10 μl 반응의 T4 DNA ligase의 10 배 버퍼 1 μl 1 μl의 1μl 조화를 이루고 있습니다. 95시 5 분에 대한 샘플을 배양 ° 가열 블록 또는 끓는 물에 C, 열원을 끄고 실내 온도 (~ 2-3시간)에 아래 혼합물이 멋진 보자. 참고 :이 중요한 단계에서 속도가 느린 냉각 과정은 각 단일 oligonucleotide 내 구조의 형성에 비해 두 oligonucleotides의 어닐링을 좋아 하시 더군요. </li><li> 소화와 dephosphorylated pUC 벡터의 1μl 하이브리드 믹스 4 μl를, (Ligate 0.1 μg /T4 DNA ligase에, T4 DNA ligase의 10 배 버퍼와 20 μl 결합 혼합 10 MM ATP 포함) μl. 16 ° C 하룻밤에 샘플을 품다. </li><li> 표준 프로토콜에 의해 관할 대장균 DH5α 세포에 출혈도 잡았 plasmids를 변환과 파란색 흰색 검사를 사용합니다. plasmids를 분리하고 소화 (원하는 크기의 삽입물에 대한 화면)과 이후의 플라스미드 시퀀싱에 의해 긍정적 인 클론을 확인합니다. </li></ol> 3. 사용자 정의 RNA의 합성 oligonucleotide를 통해 짧은 카스 RNA 기판의 생성 디자인 짧은 카스 RNA 기판 (예 : 하나의 반복 시퀀스, 그림. 2C) 및 사용자 지정 RNA의 합성 oligonucleotide 시설을 사용합니다. 참고 : RNA의 oligonucleotide의 지정된 위치 (그림 2C)에 deoxyribonucleotide의 포함은 RNA의 절단의 사이트를 정확하게하는 데 사용할 수 있습니다. 4.에서 체외 T7 RNA 중합 효소의 전사 <ol><li> 귀하의 설계 구조 (1.9. 또는 2.7에서.) maxiprep 플라스미드 정제 키트를 사용하여 plasmids를 분리합니다. </li><li> 복제 조각 (예 : HindIII)의 하류를 cleaves 제한 효소로 플라스미드를 Linearize. 완전한 소화를 확인합니다. 참고 : RNA의 성적 증명서를 발산 정의 3 &#39;말단이 원하는 경우, 설계 구조가 HindIII 시퀀스의 상류 &quot;실행 - 오프&quot;스크립트에 대한 추가 특정 제한 사이트를 포함해야합니다. </li><li> 클로로포름 (1:1) 추출 및 에탄올 강수량 : 선형화 된 페놀의 플라스미드를 정화. DEPC 처리 멸균 물에 펠렛을 resuspending하여 핵산을 복구 할 수 있습니다. </li><li> 체외 T7 RNAP의 40 MM Hepes / 코 (산도 8), 22 MM MgCl 2, 5 MM dithiothreitol, 1 밀리미터 spermidine, 각 뉴 클레오 사이드의 삼인산 4 ㎜ (ATP, CTP, GTP, UTP이 포함되어 전사 혼합을 실행 설정 ), 40-100 μg / 소화의 ML플라스미드와 DEPC 처리 물에 0.1 MG / ML T7 RNAP. 37 3 시간 동안 품다 ° C. </li><li> 8 M의 요소를 denaturing 12 % polyacrylamide 젤 (그림 3A)에 얻은 RNA 기록을 분석합니다. RNA의 성적은 모노 Q 음이온 교환 크로마토 그래피 13을 통해 정화되고 DEPC 처리 멸균 물에 RNA의 분수와 펠렛의 resuspension의 에탄올 침전으로 복구 할 수 있습니다. 나중에 사용하기 위해, -80에서 RNA를 저장 ° C. </li></ol> 5. Cas6 endonuclease 분석 <ol><li> 설정 체외 T7 RNAP 20 μl 2 MM ATP의 감소 금액을 포함하고 구비되는 (4.4 참조) 전사 혼합을 실행하는 2.5 μl α-[32 P]-ATP (10 MCI / ML, 5000 CI / mmol). denaturing 8 M의 우레아 12 % polyacrylamide 젤에서 젤 추출을 통해 반응 제품을 정화. autoradiography에 의해 밴드를 표시합니다. </li><li> 원하는 재조합 카스 단백질을 생산하고 정화. 이 예에서는, C클로스 트리 디움 thermocellum에서 as6는 열 강수량과 니켈 NTA 크로마토 그래피를 통해 정화되었습니다. </li><li> 클로스 트리 디움 thermocellum Cas6에 대한 endonuclease 분석 반응 (예를 설정, 반응 혼합물은 20 MM Hepes (코 pH8), 250 MM KCl, 2 MM MgCl 2, 1 MM DTT 12,000 노출 당 비용 (CPM) RNA 기판 및 1 μM 효소를 포함하고에 incubated되었습니다 37 ° C 30 분 용). </li><li> 8 M의 우레아 12 % polyacrylamide 젤에서 반응 혼합물 (포름 아미드 95 % 포함 + 10 μl RNA로드 버퍼)의 5 μl를로드합니다. autoradiography에 의한 전기 영동 후 절단 제품을 표시합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 카스의 endonuclease 활동의 분석을위한 RNA 기판의 예는도 3a에 표시됩니다. 체외 전사 반응에 분석 100 μl의 5 μl의 나누어지는이로드되었습니다. RNA 생산의 효율성이 다른 구조 사이에 차이가 있습니다. 일부 요인 t모자는 전사 개시에 필요한 +1 G, 전사시 RNA 구조 형성 (II) 가능성과 세대에 대한 제한 사이트 (III)의 선택에 따라 아르 얻은 RNA의 양은 (i) 초기 순서에 영향을 관찰했다 실행 - 오프 절단 위치의. RNA의 endonuclease 활동의 조사는 모두 높은 정화 재조합 카스 단백질 (그림 3B)와 적절한 부정적인 컨트롤을 필요로합니다. 이상적으로,이 부정적인 컨트롤 샘플 조사 카스의 endonuclease 반응에서 가능한 한 조금 다릅니다. 이것은 카스 표현 (및 동일 정화 절차에 따라)없이 반응 버퍼와 세포 lysate와 RNA의 부화에 의해 달성 될 수있다. 이상적인 부정적인 컨트롤은 제안 절단 사이트에서 deoxyribonucleotide 추가 된 것입니다. 그림 3C에서 5 &#39;터미널이라는 반복 시퀀스의 절단은 클로스 트리 디움 thermocellum Cas6에 표시됩니다. 아래의<html> 동일한 조건이 반복 deoxyribonucleotide이 위치 -9에 도입 할 때 더 이상 기판 없습니다. 이 방법은 또한 절단 사이트에 대한 정보를 제공합니다. 마지막으로, 오랜 내부적으로 표시된 사전 c​​rRNA는 Cas6에 의해 흘리고있다 두 개의 절단 조각을 준수하고 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> CRISPR / 카스 활동의 그림 1. 개략도. 개요 CRISPR 클러스터 (적응), Cas6 endonuclease에 의해 작은 crRNAs에 CRISPR 배열의 전사와 가공, 캐스케이드 단지에 crRNAs의 이해와의 간섭에 바이러스 DNA 시퀀스 (protospacer)의 삽입을 다음과 crRNA와 protospacer 사이 complementarity에 따라 바이러스 공격을 반복했다. Protospacer 인접 모티프 (PAM) 마르크 바이러스 protospacer 시퀀스. igure 2 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. 카스 단백질에 대한 RNA 기판의 세대. 제도는 (A) 긴 사전 c​​rRNA 기판, (B) 중간 사전 c​​rRNA 기판 및 사전 c​​rRNA 생산을위한 (C) 짧은 카스 RNA 기판 창출을위한 워크 플로우를 보여줍니다. 예를 들어 시퀀스는 클로스 트리 디움 thermocellum의 CRISPR 배열에 제공됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> 그림 3. Cas6 endonuclease 분석. A.) Toluidine 푸른 스테인드 polyacrylamide의 맞춤 디자인 RNA의 oligonucleotide (250 pmol)의 젤과 체외 RNA 성적 (일반 100 μl 반응의 5 μl)에 둘. 열 후 클로 스트 리듐 thermocellum에서 Cas6 준비 (80 pmol)의 B.) SDS-PAGE 젤1 시간 니켈 NTA 크로마토 그래피에 대한 ° C 50 강수량. 5 &#39;터미널이라는 반복 시퀀스 및 체외 성적에 사전 crRNA에 대한 endonucleolytic Cas6 활동 C.) 감지. 위치 -9에서 dNTP의 도입은 짧은 카스 RNA 기판 (S, 그림. 2C)에 대한 Cas6 절단 시킨다는. 5 &#39;터미널 8 NT 태그는 오래 전 crRNA 기판 (L, 그림. 2A)에서 crRNA의 성숙을 위해 생성됩니다. 밴드는 denaturing 8 M의 우레아 12 % polyacrylamide 젤에서 분리 autoradiography으로 시각화했다.

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

제시 방법은 서로 다른 크기의 범위 카스 endonuclease 기판의 생성을 활성화하고 시퀀스 디자인의 자유를 변화와 함께. 합성 RNA의 oligonucleotide 기판의 생성을위한 가장 스트레이트 포워드 접근 방식은 더 이상 RNA의 oligomers을 만드는 증가 비용과 기술적 한계로 인해 짧은 RNA 디자인으로 제한됩니다. 성공적인 RNA 합성은 100 세포핵 길이의 수정되지 않은 RNA의 oligomers에 대해보고 된 반면, 사용자 정의 RNA 합성을위한 실용적이고 경제적 인 최대 아래 40 세포핵에 자리 잡고 있습니다. 그러나, 주어진 시퀀스는 합성 할 수 있으며 수정 세포핵 (예 : deoxyribonucleotides)의 대상으로 소개 자세히 절단 사이트를 분석하기 위해 이용 될 수 있습니다. 긴 사전 cRNAs는 체외 스크립트에 통해 생성해야합니다. T7 RNA 중합 효소의 프로모터를 포함 oligonucleotides의 어닐링은 중간 길이 미리 crRN의 생산을 허용있습니다. 정기적으로 그리고 경제적으로 합성 DNA의 oligonucleotides의 최대 길이는 불과 150 세포핵 위에 있으며,이 방법으로 합성 사전 c​​rRNAs의 최대를 나타냅니다. 서로 끈적 끝을 형성 여러 annealed의 DNA oligonucleotide 쌍의 조립이 최대 길이를 연장하지만 구조의 복제에 증가 도전을 필요로 할 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 원하는 순서로 사전 c​​rRNA 구조 (그리고 그에 카스 endonuclease 기판)를 생성 할 수있는 기능입니다. 이 합성 crRNA 디자인의 테스트를 할 수 있습니다. 마지막으로, 큰 사전 c​​rRNAs는 그 전체 게놈의 CRISPR 요소 또는 분수의 PCR의 amplificates에서 얻을 수 있습니다. 플라스미드 체외 전사 템플릿에 대한 변경은 사전 crRNA 변종의 생성을위한 사이트 이동 mutagenesis를 통해 소개 할 수 있습니다. 이러한 구조는 전체 내에 글로벌 endonucleolytic 절단 패턴을 분석하는 데 사용할 수 있습니다사전 crRNA. 체외 스크립트에서 T7 RNA 중합 효소의를 통해 수정되지 않은 RNA의 생산을위한 선구자 작업은 전송 RNAs 14 brome 모자이크 바이러스 RNA 15 일 기준으로했습니다. 합의 T7 RNA 중합 효소의 프로모터는 인식 도메인 (-5 통해 -17)과 필수 구아노 신 일 16 전사 개시와 개시 도메인 (6를 통해 -4)로 구성되어 있습니다. 하나의 순위 하류는 거의 모든 원하는 RNA 시퀀스의 해독을 허용하는 가변 될 수 있습니다. 체외 실행 - 오프 전사 템플릿에서 생성 제시 방법은 게놈 CRISPR 지역 또는 합성 사전 crRNA 변종과 일치하는 완전한 사전 crRNAs의 체외 합성에 대한 수 있습니다. 전사 반응은 5 &#39;모노 포스페이트 테르 미니 (Termini) 14 얻기 위해 GMP와 중이오하지 않는 한 성적 증명서는 5&#39;-터미널 삼인산 존재와 생성됩니다. 성적표가 표시 될 경우 이러한 테르 미니 (Termini)가 필요합니다T4 폴리 뉴클레오타이드 키나제와 γ-[32 P]-ATP.로 Cas6 및 Cas6 같은 효소의 절단 활동은 5&#39;-수산기와 2 &#39;, 3&#39;-순환 인산염 테르 미니 (Termini)를 포함 crRNA를 생성합니다. 이러한 RNAs는 다음 캐스케이드 복잡한에 의해 인식 분석 할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 남극 인산 가수 분해 효소 </td><td> 코 </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> 체외 음성 인식 그레이드 Ultrapure 염기 Triphosphates에 </td><td> Bioscience 예나 </td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td> 액체 크로마토 그래피, ktapurifier 100 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DNA의 oligonucleotides </td><td> MWG 오페론 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> RNA의 oligonucleotides </td><td> MWG 오페론 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 겔 추출 키트 </td><td> QIAGEN </td><td> 28,704 </td><td></td></tr><tr><td> PCR 정화 키트 </td><td> QIAGEN </td><td> 28,104 </td><td></td></tr><tr><td> 스핀 Miniprep 키트 </td><td> QIAGEN </td><td> 27,106 </td><td></td></tr><tr><td> 플라스미드 맥시 키트 </td><td> QIAGEN </td><td> 12,163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> 코 </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIII </td><td> 코 </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNA Ligase의 </td><td> 코 </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> T4 폴리 뉴클레오타이드의 키나아제 </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA 중합 효소의 </td><td> 자신의 준비 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxynucleotide 솔루션 믹스 </td><td> 코 </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> 미니 프로테우스 테트라 전기 영동 시스템 </td><td> 바이오 RAD </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> 폭풍 840 스캐너 </td><td&gt; GE 헬스 케어 </td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td> 저장 Phosphorscreen </td><td> 분자 역학 </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> 모노 Q 50분의 5 GL </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Phusion 고 충실도의 DNA 중합 효소 </td><td> 코 </td><td> M0530L </td><td> GC 버퍼를 사용하여 </td></tr><tr><td> Toluidine 블루 </td><td> 시그마 </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> 코 </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32 P]-ATP, α-[32 P]-ATP </td><td> 하트만 분석 </td><td> SRP-401, SRP-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

crispr / 카스 시스템의 endonucleases을위한 기판 생성

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

바이러스와 prokaryotic 호스트의 상호 작용이 박테리아와 archaeal 삶의 진화를 형성. Prokaryotes이 제한 수정, 불임 감염과 CRISPR / 카스 시스템이 포함되어 바이러스 공격을 피하기 위해 여러 전략을 개발했습니다. C는 내가 S hort P alindromic 연구 epeat (CRISPR) 시퀀스 및 sociated (카스) 유전자와 같은 C RISPR의 수 (그림 1) 1-3을 nterspaced egularly r을 lustered의 많은 박테리아 대부분의 Archaea에서 발견 된 이러한 적응 면역 시스템으로 구성되어 있습니다. 카스 단백질과 반복의 다른 세트 CRISPR / 카스 시스템 (4)의 적어도 세 가지 주요 발산 유형을 정의합니다. 보편적 인 단백질 Cas1 및 Cas2은 바이러스 DNA의 이해에 참여하는 제안됩니다연장 CRISPR 클러스터 (5)의 5 &#39;말단에서 두 반복 사이에 새로운 스페이서 요소를 생성합니다. 전체 클러스터는 모든 공백 및 반복 시퀀스를 포함하는 전구체 - crRNA로 베꼈되어 이후 작은 ​​crRNAs 6-8로 다양한 Cas6 가족의 효소에 의해 처리됩니다. 이 crRNAs은 5 &#39;터미널 (8 세포핵)과 3&#39;반복 순서 9에서 파생 터미널 태그가 옆에있는 스페이서 순서로 구성되어 있습니다. 새로운 crRNA이 바이러스 DNA에 카스 단백질 단지 (캐스케이드) 감독의 기본 complementarity 10을 통해 사용자로 식별 될 것 같은 바이러스의 반복 감염은 이제 차단 될 수 있습니다. 마지막으로, CRISPR / 카스에 1을 입력 한 시스템을위한, nuclease Cas3이 검출 된 침입자 DNA 11,12을 파괴합니다. 이러한 프로세스는 prokaryotes의 적응 면역 시스템으로 CRISPR / 카스를 정의하고 관련자 카스 단백질 연구에 대한 흥미로운 연구 분야를 열었습니다.많은 카스 단백질의 기능은 여전히​​ 어려운이며, CRISPR / 카스 시스템의 명백한 다양성의 원인은 조명 할 수 남아 있습니다. 대부분의 카스 단백질의 잠재적 인 활동은 자세한 계산 분석을 통해 예측했다. 카스 단백질의 단수가 하나 표시하거나 4 endonucleases으로 작동하도록 제안하고 있습니다. 여기, 우리는 카스의 endoribonucleases의 연구 crRNAs 및 전구체-cRNAs를 생성하는 방법을 제시한다. 다른 endonuclease의 assays 직접 RNA의 oligonucleotides 또는 실행 - 오프 스크립트 체외 T7 RNA 중합 효소의의를 통해 생성되는 이상 crRNA 및 사전 crRNA 시퀀스로 합성 할 수 있습니다 중 짧은 반복 시퀀스가 필요합니다. 이 방법론은 내부적으로 표시된 endonuclease 기판 및 합성 또는 돌연변이 crRNAs의 창조의 세대를위한 방사성 세포핵의 결합이 가능합니다. Cas6 endonuclease 활동이 5&#39;-hydr와 crRNAs에 사전 c​​rRNAs를 성숙하기 위해 사용된다oxyl과 2 &#39;, 3&#39;-순환 인산염 테르 미니 (Termini).

박테리아와 Archaea의 CRISPR / 카스 시스템 중재 적응 면역. 많은 카스 단백질은 길이를 변화의 crRNA의 전구체에 작용 endoribonucleases 역할을 제안하고 있습니다. 여기 카스의 endonuclease 활동의 생화학 분석을위한 사전 c​​rRNA 기판을 생성하는 세 가지 방법을 설명합니다.

CRISPR / 카스 시스템의 Endonucleases을위한 기판 생성

바이러스와 그들의 원핵생물 숙주 간의 상호작용은 박테리아와 고세균 생명체의 진화를 형성하였습니다. 원핵생물은 다음과 같은 여러 전략을 발전시켰습니다...

다음 실험의 전반적인 목표는 박테리아와 고균에서 발견되는 crispr Cass 면역 체계에서 중요한 역할을 하는 Cas Endonuclease 연구를 위한 RNA 기질을 생성하는 것입니다. 필요에 따라, in vitro RNA 생산을 위한 긴 DNA 템플릿을 얻기 위해 특정 CRISPR 영역의 PCR 증폭을 이용할 수 있습니다.기질 RNA 생산을 위한 더 짧은 템플릿을 생성하기 위해 두 개의 올리고뉴클레오타이드를 어닐링할 수 있습니다. 또는 짧게 맞춤 합성된 반복 서열을 CAS 엔도뉴클레아제 분석법으로 테스트할 수 있습니다. 최종적으로, RNA 전사체의 생산과 이후의 CAS six 엔도뉴클레아제에 의한 절단은 자동 방사선 촬영법으로 시각화할 수 있습니다.본 발표 기법의 주요 목적은 연구자가 다양한 길이의 RNA 기질을 사용하여 CRISPR RNA 가공 과정을 연구할 수 있도록 하는 것입니다. 따라서 단일 반복 요소와 같은 짧은 RNA나 여러 개의 스페이서를 포함하는 CRISPR RNA 전사체와 같은 더 큰 RNA를 생성하기 위해 서로 다른 방법들이 활용됩니다. 이러한 방법들은 구체적으로 CRISPR RNA 성숙 과정에 대한 통찰을 제공하지만, 유사한 템플릿 준비 전략을 다른 RNA 가공 시스템에도 적용할 수 있습니다. 절차 시연은 박테리아 및 고균 CRISPR 면역 시스템 연구 실험실 소속의 대학원생과 박사후 연구원이 진행합니다.적응(adaptation)이라고 불리는 과정에서 프로토스페이서(proto spacer)라고 불리는 바이러스 DNA 서열이 성장하는 CRISPR 클러스터 내의 두 반복 요소(repeat elements) 사이에 삽입될 수 있습니다. 다음으로, 전체 CRISPR 클러스터가 전사된 후 Cas 엔도뉴클레아제(예: Cas6)에 의해 작은 CRISPR RNA로 가공됩니다. 이렇게 생성된 작은 CRISPR RNA는 Cas 단백질 복합체인 캐스케이드(cascade)에 통합되어, CRISPR RNA와 프로토스페이서 사이의 염기 상보성을 바이러스 DNA 분해 신호로 활용함으로써 반복되는 바이러스 공격에 대한 숙주 방어를 매개하여 긴 pre-CRISPR RNA 기질을 생성합니다.먼저 정방향 프라이머에 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열을 추가하여 CRISPR 클러스터의 스페이서 영역을 타겟팅하는 PCR 프라이머를 설계합니다. 그다음, PCR 산물을 벡터에 클로닝하기 위해 두 프라이머 모두에 제한 효소 인식 부위를 추가합니다. PCR을 통해 게놈 DNA에서 목적하는 pre-CRISPR RNA 서열을 증폭한 후, T7 RNA 중합효소가 전사를 적절히 개시하려면 G 잔기가 필요하다는 점에 유의하십시오.PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고 원하는 밴드를 겔 추출한 후, 제한 효소로 PCR 생성물을 절단하여 점성 말단을 생성합니다. 다음으로, PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제해 절단 부산물을 제거한 뒤, T4 DNA Ligase, T4 DNA Ligase 버퍼, 그리고 상응하는 점성 말단을 가진 pUC 계열 벡터와 3:1의 몰 비로 절단된 PCR 생성물을 첨가합니다. 이제 라이게이션 반응액을 16 °C에서 하룻밤 동안 배양하고, 표준 프로토콜에 따라 혼합물을 컴피턴트 E. coli DH5α 세포에 형질전환시킨 후, 블루-화이트 스크리닝을 통해 라이게이션 성공 여부를 확인합니다.마지막으로, 플라스미드 준비 키트를 사용하여 흰색 콜로니에서 플라스미드를 분리하고, 플라스미드 시퀀싱을 통해 양성 클론을 확인하여 중간 크기의 pre CRISPR RNA 기질을 생성합니다. 먼저 여기에 표시된 서열과 유사하게 원하는 CRISPR repeat spaces 서열을 가진 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드를 설계하는 것으로 시작하십시오. 올리고뉴클레오타이드에는 T7 RNA polymerase 프로모터 서열과 더불어, 점성 말단(sticky ends)이 형성되도록 올리고뉴클레오타이드 말단 뒤에 제한 효소 인식 부위가 포함되어 있음에 유의하십시오.샘플을 T4 polynucleotide kinase 및 T4 polynucleotide kinase 버퍼와 함께 37 °C에서 1시간 동안 배양하여 각 올리고뉴클레오타이드 1 nmol의 5' 말단을 인산화합니다. 그다음 인산화된 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드를 T4 DNA ligase 버퍼와 함께 가열 블록에서 95 °C로 5분 동안 배양합니다. 샘플이 하이브리드화되면 열원을 끄고 혼합물이 실온에 도달할 때까지 약 2~3시간 동안 서서히 식힙니다.이제 합성된 올리고뉴클레오타이드를 하이브리드화 믹스로 처리하여 소화 및 탈인산화된 P vector T, T4 DNA Ligase 버퍼, T4 DNA Ligase와 함께 16°C에서 하룻밤 동안 결찰합니다. 그다음, 표준 프로토콜에 따라 결찰된 플라스미드를 수용성 E. coli DH5α 세포에 형질전환시키고, 블루-화이트 스크리닝을 통해 결찰 성공 여부를 확인합니다. 마지막으로, 플라스미드를 분리하고 제한효소 처리 및 후속 플라스미드 시퀀싱을 통해 양성 클론을 확인합니다.여기에 제시된 것과 유사하게 짧은 단일 반복 cas RNA 기질 서열을 설계할 수 있습니다. 이때 반드시 deoxy ribonucleotide를 포함하십시오. RNA 절단 부위를 결정해야 하는 경우, 맞춤형 합성 시설을 이용하여 RNA 올리고뉴클레오타이드 제작을 수행할 수 있습니다.선택한 맞춤형 기질이 포함된 플라스미드를 분리한 후, maxi prep 플라스미드 정제 키트를 사용하여 클로닝된 단편의 하류(downstream) 부위를 절단하는 제한 효소로 플라스미드를 선형화합니다. 그 다음, 완전한 소화가 이루어졌는지 확인하고 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 통해 선형화된 플라스미드를 정제합니다. 펠렛을 DEPC 처리된 멸균수로 현탁하여 핵산을 회수합니다.이제 ATP, CTP, GTP 및 UTP가 포함된 신선하게 조제된 in vitro T7 RNA 중합효소 런오프 전사(runoff transcription) 혼합물에서 소화된 플라스미드를 37°C에서 3시간 동안 배양하십시오. 마지막으로, 얻어진 RNA 전사체를 변성 8 M urea, 12% polyacrylamide 젤에서 분석합니다. 또한 Mono Q 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 전사체를 정제한 후, RNA 분획의 에탄올 침전과 펠렛을 DEPC 처리된 멸균수에 재현탁하여 전사체를 회수함으로써 엔도뉴클레아제 분석(endonuclease assays)으로 디자인된 기질을 분석할 수 있습니다. 먼저 자동 방사선 촬영(autoradiography)으로 기질 밴드를 시각화하고, 변성 8 M urea 젤 추출을 통해 반응 생성물을 정제함으로써 분석을 시작하십시오.12% poly acrylamide gel을 사용하여, Clostridium thermo cell 유래의 CAS6 단백질 사례와 같이 열 침전 및 니켈 NTA 크로마토그래피를 통해 원하는 재조합 cas 단백질을 제조하고 정제합니다. 그 후, CAS 단백질을 갓 준비한 엔도뉴클레아제 반응 혼합물과 결합하여 37 °C에서 30분 동안 반응시켜 엔도뉴클레아제 분석 반응이 일어나도록 합니다. 마지막으로, 반응 혼합물 5 µL를 8 M urea 겔에 로딩합니다.12% poly acrylamide gel을 사용하고, 전기영동 후 자동 방사선 촬영법(auto radiography)으로 절단 생성물을 시각화합니다. 여기에서는 맞춤 설계된 RNA oligonucleotide와 두 종류의 in vitro RNA 전사체의 hine blue 염색 poly acrylamide gel이 제시되어 있습니다. RNA 생산 효율은 짧은 길이, 긴 길이 및 중간 길이의 구조체 간에 차이가 있음에 유의하십시오.RNA 엔도뉴클레아제 활성 조사를 위해서는 고도로 정제된 재조합 Cas 단백질뿐만 아니라 양성 및 음성 대조군이 필요합니다. 이 그림은 Clostridium thermocellum에서 유래한 Cas6 샘플 준비물의 SDS-PAGE 젤 사진입니다.열 침전 및 Ni-NTA 크로마토그래피 수행 후 표준 단백질 마커와 함께 나타낸 결과입니다. 적절한 음성 대조군 샘플은 CAS6가 발현되지 않은 세포 용해물을 포함해야 하며, 동일한 CAS6 정제 과정을 거친 후 CAS6 조제물이 요구되는 높은 수준의 순도를 보유하고 있음을 확인하였습니다. 여기서 co Clostridium thermo cell CAS6 단백질에 의한 5' 말단 표지 반복 서열 기질의 절단은 자동 방사선 촬영법(autoradiography)으로 시각화할 수 있습니다.각 레인은 방사성 표지된 기질을 포함하며, 플러스(+) 표시로 나타낸 바와 같이 ca six 단백질과 함께 배양한 RNA 또는 마이너스(-) 표시로 나타낸 음성 대조군으로서 버퍼와 함께 배양한 RNA, 그리고 데옥시리보뉴클레오타이드의 첨가 여부에 따른 긴 기질 또는 짧은 기질을 포함합니다. 마이너스 9번 위치는 엔도뉴클레아제 반응을 촉진하기 위해 사용되었습니다. 이 절차를 수행한 후, RNA 분자에 데옥시리보뉴클레오타이드가 포함되었을 때 짧은 기질의 절단이 일어나지 않았음에 유의하십시오.Cas 6 뉴클레아제는 성숙하고 정교한 RNA를 생성하는 도구로도 사용될 수 있습니다. 이러한 RNA는 cascade 복합체에 통합되어 바이러스 공격의 간섭 과정에 관여하는 기전에 대한 통찰을 얻는 데 활용될 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 Cas 뉴클레아제용 CRISPR es 기질을 설계하고 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이러한 다양한 기질들은 crispr Es의 성숙 및 활용에 관한 질문을 해결하는 데 유용합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CAS(CRISPR-associated) 시스템과 같은 게놈 편집 도구는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)의 유전자 표적화 효율성을 크게 향상시켰습니다. 이 원고는 CRISPR/Cas 시스템 보조 상동 재조합을 사용하여 계통 특이적 hiPSC 리포터를 생성하는 프로토콜을 설명합니다.

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타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

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향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

여기, 우리는 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 및 homology 종속 복구 서식 파일을 사용 하 여 C. 선 충 의 게놈을 엔지니어링 하는 방법 제시.

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

여기에 설명 된 endogenously 태그 프로토콜 표시 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에 형광 태그와 단백질 이다. 상 편집된 셀 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 풍성 하 게 하 고 클론 세포 생성 됩니다.

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CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.

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공개적으로 사용 가능한 cDNA/ORF 리소스를 사용하여 Drosophila 에서 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 라이브러리의 고처리량 구축 방법인 CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass)를 위한 프로토콜을 제시합니다. CRISPRmass는 다양한 플라스미드 라이브러리 편집에 적용할 수 있습니다.

UAS-cDNA/ORF Plasmid Library의 고처리량 구축을 위한 CRISPR-based Modular Assembly

CRISPR과 같은 기술의 주요 장벽은 중요한 유전자를 파괴할 수 있는 off-target 이벤트입니다. 'Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing'(CIRCLE-seq)은 의도하지 않은 절단 부위를 식별하기 위해 고안된 기술입니다. 이 방법은 CRISPR-Cas9의 게놈 전체 활성을 높은 감도로 편향 없이 매핑합니다.

off-target 유전자 편집에 대한 조사를 위한 CIRCLE-Seq

여기에서는 안정적인 zpc:cas9 knock-in line과 sgRNA 발현 카세트의 Tol2 매개 전달을 결합하는 모계 돌연변이를 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

zpc:cas9 Knock-in 제브라피시를 사용한 모계 돌연변이 생성

학습하세요 CRISPR/Cas 시스템의 Cas 엔도뉴클레이즈 활성 연구를 위한 RNA 기질 생성 방법입니다. PCR 증폭과 올리고뉴클레오티드 합성을 활용하여 다양한 길이의 pre-crRNA 기질을 제작하고 자기방사영상법으로 절단을 분석하는 기술을 익히세요.

CRISPR / 카스 시스템의 Endonucleases을위한 기판 생성

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