CRISPR / 카스 시스템의 Endonucleases을위한 기판 생성

다음 실험의 전반적인 목표는 박테리아와 고균에서 발견되는 crispr Cass 면역 체계에서 중요한 역할을 하는 Cas Endonuclease 연구를 위한 RNA 기질을 생성하는 것입니다. 필요에 따라, in vitro RNA 생산을 위한 긴 DNA 템플릿을 얻기 위해 특정 CRISPR 영역의 PCR 증폭을 이용할 수 있습니다.

기질 RNA 생산을 위한 더 짧은 템플릿을 생성하기 위해 두 개의 올리고뉴클레오타이드를 어닐링할 수 있습니다. 또는 짧게 맞춤 합성된 반복 서열을 CAS 엔도뉴클레아제 분석법으로 테스트할 수 있습니다. 최종적으로, RNA 전사체의 생산과 이후의 CAS six 엔도뉴클레아제에 의한 절단은 자동 방사선 촬영법으로 시각화할 수 있습니다.

본 발표 기법의 주요 목적은 연구자가 다양한 길이의 RNA 기질을 사용하여 CRISPR RNA 가공 과정을 연구할 수 있도록 하는 것입니다. 따라서 단일 반복 요소와 같은 짧은 RNA나 여러 개의 스페이서를 포함하는 CRISPR RNA 전사체와 같은 더 큰 RNA를 생성하기 위해 서로 다른 방법들이 활용됩니다. 이러한 방법들은 구체적으로 CRISPR RNA 성숙 과정에 대한 통찰을 제공하지만, 유사한 템플릿 준비 전략을 다른 RNA 가공 시스템에도 적용할 수 있습니다. 절차 시연은 박테리아 및 고균 CRISPR 면역 시스템 연구 실험실 소속의 대학원생과 박사후 연구원이 진행합니다.

적응(adaptation)이라고 불리는 과정에서 프로토스페이서(proto spacer)라고 불리는 바이러스 DNA 서열이 성장하는 CRISPR 클러스터 내의 두 반복 요소(repeat elements) 사이에 삽입될 수 있습니다. 다음으로, 전체 CRISPR 클러스터가 전사된 후 Cas 엔도뉴클레아제(예: Cas6)에 의해 작은 CRISPR RNA로 가공됩니다. 이렇게 생성된 작은 CRISPR RNA는 Cas 단백질 복합체인 캐스케이드(cascade)에 통합되어, CRISPR RNA와 프로토스페이서 사이의 염기 상보성을 바이러스 DNA 분해 신호로 활용함으로써 반복되는 바이러스 공격에 대한 숙주 방어를 매개하여 긴 pre-CRISPR RNA 기질을 생성합니다.

먼저 정방향 프라이머에 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열을 추가하여 CRISPR 클러스터의 스페이서 영역을 타겟팅하는 PCR 프라이머를 설계합니다. 그다음, PCR 산물을 벡터에 클로닝하기 위해 두 프라이머 모두에 제한 효소 인식 부위를 추가합니다. PCR을 통해 게놈 DNA에서 목적하는 pre-CRISPR RNA 서열을 증폭한 후, T7 RNA 중합효소가 전사를 적절히 개시하려면 G 잔기가 필요하다는 점에 유의하십시오.

PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고 원하는 밴드를 겔 추출한 후, 제한 효소로 PCR 생성물을 절단하여 점성 말단을 생성합니다. 다음으로, PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제해 절단 부산물을 제거한 뒤, T4 DNA Ligase, T4 DNA Ligase 버퍼, 그리고 상응하는 점성 말단을 가진 pUC 계열 벡터와 3:1의 몰 비로 절단된 PCR 생성물을 첨가합니다. 이제 라이게이션 반응액을 16 °C에서 하룻밤 동안 배양하고, 표준 프로토콜에 따라 혼합물을 컴피턴트 E. coli DH5α 세포에 형질전환시킨 후, 블루-화이트 스크리닝을 통해 라이게이션 성공 여부를 확인합니다.

마지막으로, 플라스미드 준비 키트를 사용하여 흰색 콜로니에서 플라스미드를 분리하고, 플라스미드 시퀀싱을 통해 양성 클론을 확인하여 중간 크기의 pre CRISPR RNA 기질을 생성합니다. 먼저 여기에 표시된 서열과 유사하게 원하는 CRISPR repeat spaces 서열을 가진 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드를 설계하는 것으로 시작하십시오. 올리고뉴클레오타이드에는 T7 RNA polymerase 프로모터 서열과 더불어, 점성 말단(sticky ends)이 형성되도록 올리고뉴클레오타이드 말단 뒤에 제한 효소 인식 부위가 포함되어 있음에 유의하십시오.

샘플을 T4 polynucleotide kinase 및 T4 polynucleotide kinase 버퍼와 함께 37 °C에서 1시간 동안 배양하여 각 올리고뉴클레오타이드 1 nmol의 5' 말단을 인산화합니다. 그다음 인산화된 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드를 T4 DNA ligase 버퍼와 함께 가열 블록에서 95 °C로 5분 동안 배양합니다. 샘플이 하이브리드화되면 열원을 끄고 혼합물이 실온에 도달할 때까지 약 2~3시간 동안 서서히 식힙니다.

이제 합성된 올리고뉴클레오타이드를 하이브리드화 믹스로 처리하여 소화 및 탈인산화된 P vector T, T4 DNA Ligase 버퍼, T4 DNA Ligase와 함께 16°C에서 하룻밤 동안 결찰합니다. 그다음, 표준 프로토콜에 따라 결찰된 플라스미드를 수용성 E. coli DH5α 세포에 형질전환시키고, 블루-화이트 스크리닝을 통해 결찰 성공 여부를 확인합니다. 마지막으로, 플라스미드를 분리하고 제한효소 처리 및 후속 플라스미드 시퀀싱을 통해 양성 클론을 확인합니다.

여기에 제시된 것과 유사하게 짧은 단일 반복 cas RNA 기질 서열을 설계할 수 있습니다. 이때 반드시 deoxy ribonucleotide를 포함하십시오. RNA 절단 부위를 결정해야 하는 경우, 맞춤형 합성 시설을 이용하여 RNA 올리고뉴클레오타이드 제작을 수행할 수 있습니다.

선택한 맞춤형 기질이 포함된 플라스미드를 분리한 후, maxi prep 플라스미드 정제 키트를 사용하여 클로닝된 단편의 하류(downstream) 부위를 절단하는 제한 효소로 플라스미드를 선형화합니다. 그 다음, 완전한 소화가 이루어졌는지 확인하고 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 통해 선형화된 플라스미드를 정제합니다. 펠렛을 DEPC 처리된 멸균수로 현탁하여 핵산을 회수합니다.

이제 ATP, CTP, GTP 및 UTP가 포함된 신선하게 조제된 in vitro T7 RNA 중합효소 런오프 전사(runoff transcription) 혼합물에서 소화된 플라스미드를 37°C에서 3시간 동안 배양하십시오. 마지막으로, 얻어진 RNA 전사체를 변성 8 M urea, 12% polyacrylamide 젤에서 분석합니다. 또한 Mono Q 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 전사체를 정제한 후, RNA 분획의 에탄올 침전과 펠렛을 DEPC 처리된 멸균수에 재현탁하여 전사체를 회수함으로써 엔도뉴클레아제 분석(endonuclease assays)으로 디자인된 기질을 분석할 수 있습니다. 먼저 자동 방사선 촬영(autoradiography)으로 기질 밴드를 시각화하고, 변성 8 M urea 젤 추출을 통해 반응 생성물을 정제함으로써 분석을 시작하십시오.

12% poly acrylamide gel을 사용하여, Clostridium thermo cell 유래의 CAS6 단백질 사례와 같이 열 침전 및 니켈 NTA 크로마토그래피를 통해 원하는 재조합 cas 단백질을 제조하고 정제합니다. 그 후, CAS 단백질을 갓 준비한 엔도뉴클레아제 반응 혼합물과 결합하여 37 °C에서 30분 동안 반응시켜 엔도뉴클레아제 분석 반응이 일어나도록 합니다. 마지막으로, 반응 혼합물 5 µL를 8 M urea 겔에 로딩합니다.

12% poly acrylamide gel을 사용하고, 전기영동 후 자동 방사선 촬영법(auto radiography)으로 절단 생성물을 시각화합니다. 여기에서는 맞춤 설계된 RNA oligonucleotide와 두 종류의 in vitro RNA 전사체의 hine blue 염색 poly acrylamide gel이 제시되어 있습니다. RNA 생산 효율은 짧은 길이, 긴 길이 및 중간 길이의 구조체 간에 차이가 있음에 유의하십시오.

RNA 엔도뉴클레아제 활성 조사를 위해서는 고도로 정제된 재조합 Cas 단백질뿐만 아니라 양성 및 음성 대조군이 필요합니다. 이 그림은 Clostridium thermocellum에서 유래한 Cas6 샘플 준비물의 SDS-PAGE 젤 사진입니다.

열 침전 및 Ni-NTA 크로마토그래피 수행 후 표준 단백질 마커와 함께 나타낸 결과입니다. 적절한 음성 대조군 샘플은 CAS6가 발현되지 않은 세포 용해물을 포함해야 하며, 동일한 CAS6 정제 과정을 거친 후 CAS6 조제물이 요구되는 높은 수준의 순도를 보유하고 있음을 확인하였습니다. 여기서 co Clostridium thermo cell CAS6 단백질에 의한 5' 말단 표지 반복 서열 기질의 절단은 자동 방사선 촬영법(autoradiography)으로 시각화할 수 있습니다.

각 레인은 방사성 표지된 기질을 포함하며, 플러스(+) 표시로 나타낸 바와 같이 ca six 단백질과 함께 배양한 RNA 또는 마이너스(-) 표시로 나타낸 음성 대조군으로서 버퍼와 함께 배양한 RNA, 그리고 데옥시리보뉴클레오타이드의 첨가 여부에 따른 긴 기질 또는 짧은 기질을 포함합니다. 마이너스 9번 위치는 엔도뉴클레아제 반응을 촉진하기 위해 사용되었습니다. 이 절차를 수행한 후, RNA 분자에 데옥시리보뉴클레오타이드가 포함되었을 때 짧은 기질의 절단이 일어나지 않았음에 유의하십시오.

Cas 6 뉴클레아제는 성숙하고 정교한 RNA를 생성하는 도구로도 사용될 수 있습니다. 이러한 RNA는 cascade 복합체에 통합되어 바이러스 공격의 간섭 과정에 관여하는 기전에 대한 통찰을 얻는 데 활용될 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 Cas 뉴클레아제용 CRISPR es 기질을 설계하고 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이러한 다양한 기질들은 crispr Es의 성숙 및 활용에 관한 질문을 해결하는 데 유용합니다.