2012년 11월 14일
이 동영상 프리젠 테이션 forebrain 기능을 지원하는 가장 중요한 두 높은 혈관 구조를 수확하는 방법을 보여줍니다. 그들은 관련된 meninges (MAV)와 뇌성 혈액 흐름과 뇌척수 (CSF) 항상성에 필요한 맥락막 얼기와 함께 대뇌 표면 (표면) vasculature 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 전뇌 피질과 중뇌, 시상 및 캘리의 표면을 오버레이하여 수막의 껍질 및 지주막 부분과 관련 동맥 혈관 구조를 효율적이고 신속하게 해부하고 외심실에서 맥락막신경총을 채취하는 것입니다. 이것은 먼저 송과선을 제거하고 전뇌에 있는 수막과 동맥 나무를 분리함으로써 이루어집니다. 둘째, 피질 표면의 동맥과 동맥을 조심스럽게 제거하고, 윌리스의 복부 원(ventral circle)에서 시작하여 등쪽 피질 표면(dorsal cortical surface)으로 진행하여 껍질과 남아 있는 지주막이 혈관 조직에 부착된 상태를 유지하도록 하여 인접한 피질 표면 조직의 적발을 최소화합니다.
다음으로, 피질(cortex)과 관섬유(commissural fiber)를 중격(septum)과 해마(hippocampus)에서 멀리 해부하여 측면의 뇌실을 노출시켜 맥락막신경총(choroid plexus)을 적출할 수 있도록 합니다. 마지막으로, 해마를 제거하여 중뇌의 시상(thalamus)과 캘리(calli)를 노출시킵니다. 그런 다음 이 영역 위에 있는 수막 및 관련 혈관 구조를 절개합니다.
궁극적으로, 절개된 수막과 관련 동맥 혈관 조직, 맥락막신경총의 무결성과 특이도는 이러한 각 영역의 유전자 발현 프로파일을 비교하여 결정할 수 있습니다. 이 방법은 뇌 기능을 지원하는 혈관과 관련된 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에는 맥락막총의 기능과 수막의 기능, 혈류, CSF 기능, 신경독성 모욕 및 뇌 외상과 관련된 관련 동맥 혈관 구조와 비교하는 유사점과 차이점이 포함됩니다.
이 프로토콜을 시작하기 위해, 쥐에서 방금 제거한 뇌를 안락사시킨 직후 얼음처럼 차가운 일반 식염수로 5분 동안 넣는다. 4개의 뇌 수막 및 관련 동맥 혈관 구조 또는 MAV가 피질 표면에서 분리될 수 있도록 해부 전에 이 시간 동안 뇌를 식히는 것이 중요합니다. 그런 다음 pH 7.4에서 1cm의 얼음, 차가운 일반 식염수 또는 0.1 몰 인산 나트륨 완충 식염수와 함께 얼음 위에 놓인 유리 페트리 접시의 바닥에 뇌를 놓습니다.
모든 해부는 대부분 식염수에 잠긴 뇌로 이루어져야 합니다. 해부를 시작하려면 뇌 등쪽을 페트리 접시에 놓고 두 반구 사이의 가장 배쪽 영역에 있는 송과선을 찾습니다. 소뇌와 바로 아래 또는 수막의 표면으로 쭉 뻗으십시오.
콜리 위에. 두 개의 작은 구부러진 팁 집게를 사용하여 송과선을 제거합니다. 송과선은 피질과 마찬가지로 분홍색을 띠지만 뇌 제거로 인한 잔여 혈액과 혈관 구조의 잔해로 둘러싸여 있는 경우가 많습니다.
다음으로, 페트리 접시에서 뇌를 거꾸로 뒤집습니다. 그런 다음 척추 동맥과 교두를 덮고 있는 더 작은 동맥 및 수막을 전뇌의 수막과 혈관 구조에서 분리합니다. 다음으로 MAV 제거를 시작합니다.
윌리스 서클의 주요 동맥, 중간 대뇌 동맥 및 전방 동맥과 함께 절제 과정에서 복부로 시작하는 것이 중요합니다. 다음으로, 양쪽 반구에서 시작하여 작고 구부러진 끝 집게를 사용하여 내부 경동맥 접합부 바로 뒤에 있는 후방 통신 동맥을 절단하여 전뇌의 더 많은 전방 및 후방 동맥 나무를 분리합니다. 그런 다음 반대쪽 반구에 대해 동일한 과정을 반복합니다.
이제 집게로 MCA와 전방 동맥을 잡고 배쪽 전방 피질을 덮고 있는 MAV가 후각 기관 위와 주변에서 들어 올려지도록 MCA와 전방 동맥을 부드럽게 잡아당깁니다. 이것은 전방 피질을 덮고 있는 MAV의 많은 부분을 제거합니다. 뇌를 페트리 접시에 대해 45-90도 각도로 돌려 외측 피질 영역을 둘러싼 MAV의 더 앞쪽 영역이 피질에서 해방되고 MCA 및 관련 동맥을 잡고 피질을 따라 등쪽으로 부드럽게 당길 수 있도록 합니다.
필요한 경우 겸자의 끝을 사용하여 절제 중에 피질에서 주요 동맥을 들어 올리고 분리할 수 있습니다. 이제 MAV의 더 뒤쪽 측면 영역을 제거합니다. 이 수확 과정에서 한 반구에서 다른 반구로 전환하는 것이 가장 좋으며, MAV가 차갑고 수분된 상태로 유지되도록 하고, 피질에서 MAV를 방출하는 데 저항이 발생하면 반구도 전환합니다.
마지막으로, 원발성 체감각 및 운동 피질을 둘러싼 MAV의 가장 등쪽 영역을 제거하려면, 뇌의 등쪽을 위로 돌려 이 부분을 뇌에서 분리하고, 시상동을 따라 겸자 끝을 사용합니다. 수확된 MAV의 이 부분은 테스트 및 분석에 필요할 때까지 얼음 저온 식염수에 임시로 보관하거나 나중에 처리하기 위해 냉동할 수 있습니다. 종종 피질의 가장 뒤쪽 코들 영역을 덮고 있는 MAV는 부착된 상태로 남아 있습니다.
제거는 이 비디오의 다음 섹션에 나와 있습니다. 맥락막신경총의 첫 번째 위치를 제거하려면 뇌 등쪽이 위로 향하게 하고 더 큰 겸자로 제자리에 고정합니다. 그런 다음 반구 사이의 정중선을 통해 더 작은 집게를 아래로 누르고 끝을 사용하여 피질과 말뭉치를 통해 해마의 정중선 상단으로 구멍을 뚫습니다.
다음으로, 겸자를 사용하여 캘로섬이 있는 피질을 등쪽 해마와 중격에서 멀리 당겨 대부분의 외측 뇌실을 노출시킵니다. 맥락막신경총은 길이를 가로지르는 주요 동맥을 구분하는 물결 모양의 빨간색 선으로 찾고 식별할 수 있습니다. 집게의 두 끝을 사용하여 세 번째 뇌실의 측벽을 들어 올리고 가장 꼬박 끝에서 확대합니다.
그런 다음 작은 집게를 사용하여 맥락막신경총의 이 끝을 빼냅니다. 다음으로, 겸자를 사용하여 중격과 미상 푸타멘 사이의 가장 앞쪽 영역을 확대하고 이 끝에서 맥락막신경총도 빼냅니다. 또한 반대쪽 반구에서 동일한 절차를 수행하여 두 번째 남은 맥락막신경총을 얻습니다.
다시 말하지만, 이 조직은 얼음, 차갑기, 식염수에 임시로 보관하거나 나중에 처리하기 위해 냉동할 수 있습니다. 피질의 가장 뒤쪽 코들 영역을 덮고 있는 나머지 MAV를 제거하려면, 먼저 시상과 구에 MAV를 노출시키는 양쪽 반구에서 전체 해마를 제거합니다. MAV의 이 부분을 제거하는 것은 나머지 MAV를 위해 피질에서 제거하는 것보다 훨씬 덜 어려울 것입니다.
시상의 앞쪽 부분에 있는 더 큰 혈관 구조를 잡고 부드럽게 당기면 이 혈관 구조가 상부 교과 네트워크에 연결되어 등쪽 해마와 등쪽 시상 네트워크에 혈액을 공급합니다. 조금씩 당겨 빼내면 결국 상부 네트워크가 해제되고 유아 동맥 서클의 마지막 부분에 도달할 수 있습니다. 이 시점에서, 과립 후방 직계 일차, 청각 및 시각 피질의 표면에 남아 있는 MAV를 제거하기 위해 더 많은 주의를 기울여야 합니다.
이 두 번째 시상 및 칼리 MAV 절편으로 채취된 남아있는 후복부 피질 MAV는 별도로 분석해야 하는 경우 제거되어 첫 번째 피질 MAV 절편에 추가되어야 합니다. 다음으로, 대조 조건에서 선조체 두정엽 피질과 MAV 영역 간의 유전자 발현 프로파일을 비교하기 위해 Agilent 0 1 4 8 7 9 whole rat genome, four x 44, 060 mer oligonucleotide array를 사용하여 유전자 발현 분석을 수행할 수 있습니다. 처리, 스캔 및 초기 데이터 저장에 대한 자세한 내용은 Thomas et al.에서 확인할 수 있습니다.
해부가 올바르게 실행될 때. 그 결과로 생성된 MAV 조직은 총 무게가 약 35-45mg인 두 개의 온전한 개체에 있어야 합니다. 피질의 대부분을 둘러싸고 있는 초기에 절개된 MAV의 무게는 약 25mg이어야 하며, 시상, 캘리 및 후두 피질을 덮고 있는 MAV의 무게는 약 15mg이어야 합니다.
조직은 혈관 조직에 남아 있는 혈액으로 인해 약간 분홍빛을 띠어야 합니다. 적출된 양측 맥락막신경총은 여기에서 볼 수 있듯이 각각 1-2밀리그램의 무게가 나가는 두 개의 온전한 조직 샘플에 있어야 합니다. 여기에서 우리는 대조 조건 하에서 선조체 두정엽 피질과 MAV의 유전자 발현 프로파일을 비교한 것을 볼 수 있습니다.
위쪽 플롯은 두정엽 피질과 비교하여 선조체의 표현을 보여줍니다. 하단 플롯은 두정엽 피질과 비교하여 MAV의 발현을 보여주지만, 선조체와 두정엽 피질이 MAV보다 서로 훨씬 더 밀접하게 관련되어 있음을 알 수 있습니다. 여기에서 우리는 MAV에서 대조군과 비교하여 온열요법에 대한 반응, 대조군과 비교하여 암페타민에 대한 반응, 그리고 온열요법과 암페타민에 대한 반응에서 차등 유전자 발현을 볼 수 있습니다.
마지막으로, 여기에서 MAV에서 15배 이상의 발현을 가진 유전자를 볼 수 있으며, 이는 기능을 특징으로 하는 두정피질(parietal cortex) 및 선조체(striatum)와 비교됩니다. 이러한 유전자의 대부분은 혈관 시스템 또는 면역 체계와 관련이 있습니다. 매우 큰 폴드 변화를 가진 다른 유전자로는 세포외 기질 단백질(extracellular matrix protein), 소테 수송체(saute transporter), 지질 및 레티노산 대사(lipid and retinoic acid metabolism)가 있습니다.
이 절차를 시도하는 동안 MAV를 해부하는 동안 인내심을 가져야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 전체 해부 동안 뇌가 등장성 식염수 또는 인산염 완충 식염수에 잠긴 상태를 유지하는 것도 중요합니다. 또한 실험 데이터를 생성하기 위한 조직을 얻기 전에 4-5마리의 쥐에서 MAV 단면을 연습하는 것이 좋습니다.
이 동영상 프레젠테이션은 뇌 혈류 및 뇌척수액 항상성을 유지하는 데 중요한 뇌 표면 혈관계와 콩팥체를 수확하는 방법을 시연합니다.
This method enables biopharma researchers to isolate and analyze two critical neurovascular structures—the meninges-associated vasculature (MAV) and choroid plexus—supporting target validation in CNS drug discovery. By providing biochemically viable tissue for gene expression profiling, it facilitates mechanistic de-risking of vascular and fluid homeostasis pathways implicated in neurodegenerative and neuropsychiatric disorders. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking vascular function to neurotoxic insults such as amphetamine exposure and hyperthermia.
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and feeding into lead identification through vascular pathway elucidation.