쥐의 뇌에서 뇌 표면 Vasculature 및 관련 Meninges의 해부 및 맥락막 얼기의 시각적 설명

이 절차의 전반적인 목표는 전뇌 피질, 중뇌, 시상 및 뇌량의 표면을 덮고 있는 뇌막의 외막과 지주막 부분 및 관련 동맥 혈관계를 효율적이고 신속하게 박리하고, 측뇌실에서 맥락총을 채취하는 것입니다. 이는 먼저 송과선을 제거하고 전뇌에 인접한 뇌막과 동맥계를 분리함으로써 달성됩니다. 둘째로, 윌리스환(circle of Willis)의 복측 부위부터 시작하여 배측 피질 표면으로 진행하며 피질 표면의 동맥과 세동맥을 조심스럽게 제거하며, 이때 외막과 나머지 지주막이 혈관계에 붙어 있도록 유지하고 인접한 피질 표면 조직의 채취를 최소화해야 합니다.

다음으로, 피질과 교차 섬유를 중격 및 해마로부터 박리하여 맥락총을 채취할 수 있도록 측뇌실을 노출시킵니다. 마지막으로 해마를 제거하여 시상과 중뇌의 뇌량 부분을 노출시킵니다. 그 후 이 부위를 덮고 있는 뇌막과 관련 혈관들을 박리합니다.

결과적으로, 박리된 뇌수막과 관련 동맥 혈관계, 그리고 맥락총의 무결성과 특이성은 각 영역의 유전자 발현 프로파일을 비교함으로써 결정할 수 있습니다. 이 방법은 뇌 기능을 지원하는 혈관계와 관련된 연구의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에는 혈류, CSF 기능, 신경독성 손상 및 뇌 외상과 관련하여 뇌수막 및 관련 동맥 혈관계와 비교한 맥락총 기능의 유사점, 비교 및 차이점이 포함됩니다.

이 프로토콜을 시작하려면, 안락사 직후 적출한 쥐의 뇌를 얼음처럼 차가운 생리식염수에 5분 동안 담그십시오. 박리를 시작하기 전 이 정도의 시간 동안 뇌를 냉각시키는 것이 중요한데, 이는 뇌막과 관련 동맥 혈관 구조(MAV)를 피질 표면에서 분리하기 위함입니다. 다음으로, 1cm 두께의 얼음처럼 차가운 생리식염수 또는 pH 7.4의 0.1 M 인산나트륨 완충식염수(PBS)가 담긴, 얼음 위에 놓인 유리 페트리 접시 바닥에 뇌를 놓으십시오.

모든 해부는 뇌의 대부분이 식염수에 잠긴 상태에서 이루어져야 합니다. 해부를 시작하려면, 뇌의 배측면이 위로 오도록 페트리 접시에 놓고, 두 반구 사이의 가장 내측 복측 부위에 위치한 송과선을 찾으십시오. 이는 소뇌의 바로 앞쪽(rostral), 그리고 뇌수막의 바로 아래 또는 표면에 위치합니다.

colli 위쪽에서 두 개의 작은 굽은 팁 핀셋을 사용하여 송과선을 제거합니다. 송과선은 피질과 같이 분홍색을 띠지만, 뇌 제거 과정에서 남은 혈액 잔해와 혈관 조직에 둘러싸여 있는 경우가 많으므로 주의하십시오.

다음으로, 페트리 접시 안에서 뇌를 뒤집습니다. 그런 다음 뇌교를 덮고 있는 척추동맥과 더 작은 동맥들 및 뇌수막을 전뇌의 뇌수막 및 혈관계로부터 분리합니다. 이어서 MAV 제거를 시작합니다.

해부 과정에서는 윌리스 환(circle of Willis)의 주요 동맥, 중대뇌동맥 및 전대뇌동맥부터 복측에서 시작하는 것이 중요합니다. 다음으로, 어느 한쪽 반구부터 시작하여 작은 굽은 팁 핀셋을 사용하여 내경동맥 접합부 바로 뒤쪽의 후교통동맥을 절단함으로써 전뇌의 전방 및 후방 동맥계를 분리합니다. 그 다음 반대쪽 반구에 대해서도 동일한 과정을 반복합니다.

이제 포셉으로 MCA와 전동맥을 잡고 전배측 방향으로 부드럽게 당겨, 복측 전두피질을 덮고 있는 MAV가 후각로 위와 주변으로 들어 올려지게 합니다. 이렇게 하면 전두피질을 덮고 있는 MAV의 상당 부분이 제거됩니다. 뇌를 페트리 접시와 45~90도 각도로 돌려 외측 피질 부위를 둘러싸고 있는 MAV의 더 앞쪽 외측 부위가 피질에서 분리될 수 있도록 한 뒤, MCA와 관련 동맥들을 잡고 피질을 따라 배측으로 부드럽게 당깁니다.

필요한 경우, 박리 과정에서 포셉의 끝을 사용하여 주요 동맥을 들어 올려 피질로부터 분리할 수 있습니다. 이제 MAV의 더 후방 외측 부위를 제거하십시오. 이 수확 과정 동안 MAV가 차갑고 촉촉한 상태로 유지되도록 한쪽 반구에서 다른 쪽 반구로 번갈아 가며 작업하는 것이 가장 좋습니다. 또한 MAV를 피질에서 분리할 때 저항이 느껴지는 경우에도 반구를 교체하여 작업하십시오.

마지막으로, 일차 체성 감각 및 운동 피질을 둘러싸고 있는 MAV의 가장 등쪽 부위를 제거하기 위해 뇌의 등쪽이 위로 향하게 돌려 이 부분을 뇌에서 분리하며, 시상 정맥동을 따라 포셉의 끝부분을 사용합니다. 이렇게 수집된 MAV 부위는 테스트 및 분석에 필요할 때까지 얼음처럼 차가운 식염수에 일시적으로 보관하거나, 추후 처리를 위해 냉동 보관할 수 있습니다. 종종 피질의 가장 후측부 부위를 덮고 있는 MAV는 부착된 상태로 남아있기도 합니다.

그 제거 방법은 이 영상의 다음 섹션에서 보여드립니다. 맥락총을 제거하려면 먼저 뇌의 등쪽이 위로 오도록 배치하고 큰 포셉으로 고정합니다. 그런 다음 작은 포셉을 양쪽 반구 사이의 정중선을 따라 아래로 밀어 넣어, 포셉 끝으로 피질과 뇌량에 구멍을 내어 해마 정중선의 상단부까지 도달하게 합니다.

다음으로, 핀셋을 사용하여 뇌량(callosum)이 포함된 피질을 등측 해마와 중격에서 분리하여 측뇌실의 대부분이 노출되도록 합니다. 맥락총(choroid plexus)은 그 길이를 따라 뻗어 있는 주요 동맥을 나타내는 물결 모양의 붉은 선으로 위치를 찾아 식별할 수 있습니다. 핀셋의 두 끝을 사용하여 제3뇌실의 측벽을 벌리고, 가장 좁은 끝부분을 확장합니다.

그런 다음 소형 포셉을 사용하여 맥락총의 이쪽 끝부분을 당겨 분리합니다. 이어서 포셉을 이용해 중격과 미상핵-피각 영역 사이의 매우 앞쪽 부위를 확장하고, 이쪽 끝에서도 맥락총을 당겨 분리합니다. 반대측 반구에서도 동일한 절차를 수행하여 나머지 두 번째 맥락총을 얻습니다.

다시 한번 언급하자면, 이 조직은 나중에 처리하기 위해 얼음, 냉각 식염수 또는 냉동 상태로 일시적으로 보관할 수 있습니다. 피질의 가장 후방 구역을 덮고 있는 나머지 MAV를 제거하려면, 먼저 양쪽 반구에서 해마 전체를 제거하여 시상과 구(colliculi) 위의 MAV를 노출시킵니다. MAV의 이 부분을 제거하는 것은 나머지 MAV를 피질에서 제거하는 것보다 훨씬 수월하다는 점에 유의하십시오.

시상 전면부를 덮고 있는 더 큰 혈관들을 잡고 조심스럽게 당기면, 이 혈관들이 상교차 네트워크와 연결되어 있으며 등쪽 해마 및 등쪽 시상 네트워크에 혈액을 공급하고 있음을 알 수 있습니다. 계속해서 조심스럽게 당기면 결국 상위 네트워크가 분리되고, 마지막 단계에서 교차 동맥륜의 잔여 부분에 도달할 수 있습니다. 이 시점에서는 과립형 후선상 primary, 청각 및 시각 피질 표면에 남아 있는 모든 MAV를 제거하는 데 더욱 세심한 주의를 기울여야 합니다.

두 번째 시상 및 뇌량 MAV 절편과 함께 수확한 잔여 후복측 피질 MAV는 별도로 분석할 경우 제거하여 첫 번째 피질 MAV 절편에 추가해야 합니다. 다음으로, 대조 조건 하에서 선조체, 두정엽 피질 및 MAV 영역 간의 유전자 발현 프로파일을 비교하기 위해 Agilent 0 1 4 8 7 9 whole rat genome, four by 44, 060 mer oligonucleotide array를 사용하여 유전자 발현 분석을 수행할 수 있습니다. 처리, 스캔 및 초기 데이터 저장에 대한 자세한 내용은 Thomas et al.에서 확인할 수 있습니다.

해부가 정확하게 수행되었을 때, 결과적으로 얻은 MAV 조직은 총 약 35~45 mg인 두 개의 온전한 개체여야 합니다. 처음 해부하여 피질의 대부분을 둘러싸고 있는 MAV는 약 25 mg이어야 하며, 시상, 뇌량 및 후두 피질을 덮고 있는 조직은 약 15 mg이어야 합니다.

조직은 혈관 내에 남아 있는 혈액으로 인해 약간 분홍빛을 띠어야 합니다. 채취한 양측 맥락총은 여기 보이는 것처럼 각각 1~2 mg 무게의 온전한 두 개의 조직 샘플 형태여야 합니다. 여기서는 대조군 조건에서 선조체, 두정엽 피질 및 MAV의 유전자 발현 프로필 비교를 볼 수 있습니다.

상단 그래프는 두정엽 피질과 비교한 선조체의 발현을 보여줍니다. 하단 그래프는 두정엽 피질과 비교한 MAV의 발현을 보여주며, 선조체와 두정엽 피질이 MAV보다 서로 훨씬 더 밀접하게 연관되어 있음을 알 수 있습니다. 여기서는 대조군 대비 고열 반응, 대조군 대비 암페타민 반응, 그리고 고열 대 암페타민 반응에 따른 MAV의 차등 유전자 발현을 확인할 수 있습니다.

마지막으로, 여기 두정엽 피질 및 선조체와 비교하여 MAV에서 15배 이상의 발현을 보이는 유전자들을 기능별로 특성화하여 확인하였습니다. 이러한 유전자 중 상당수는 혈관계 또는 면역계와 관련이 있습니다. 매우 큰 배수 변화를 보이는 다른 유전자들은 세포외 기질 단백질, solute 수송체, 그리고 지질 및 레티노익산 대사와 관련되어 있습니다.

이 절차를 수행할 때, MAV를 해부하는 동안 인내심을 갖는 것이 중요합니다. 또한, 해부 전 과정 동안 뇌가 등장성 식염수 또는 인산염 완충 식염수에 잠겨 있도록 유지하는 것이 중요합니다. 아울러, 실험 데이터 생성용 조직을 얻기 전에 4~5마리의 쥐를 대상으로 MAV 절단 연습을 하는 것을 권장합니다.