Name: 효소 세포 융합 분석을 사용하여 올가미로 인한 막 퓨전 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 배우세요 SNARE 매개 세포 융합을 정량화하는 효소 세포 융합 분석법을 사용하여 막 역학을 연구하는 방법입니다. 베타갈락토시다제 보고자를 활용한 이 기법은 다양한 SNARE 조합 분석이 가능하여 세포생물학 연구에 유용합니다.

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이 작품은 국립 보건원에서 루이스 빌과 CA135123 대학 (CH까지)에서 시작 자금에 의해 지원됩니다.

1. 세포 배양 및 Transfection <ol><li> COS-7 세포는 4.5 g / L 포도당와 10 % 태아 소 혈청 (FBS)와 보충 Dulbecco 수정일 독수리의 중간 (DMEM)에서 배양되어 있습니다. </li><li> 플라스미드 transfection는 제조업체의 지시 사항 (Invitrogen)에 따라 Lipofectamine하여 이루어집니다. </li></ol> 2. 세포 표면 스네어의 표현의 형광 미세 분석 <ol><li> transfection 전날, 3 × 10 4 COS-7 세포는 24 잘 플레이트에 포함 된 멸균 12 mm 유리 coverslips (피셔 과학)에 놓는 있습니다. </li><li> TTA을 인코딩 그 플라스미드의 각 잘, 0.25 μg의 V-세포의 경우 (pTet 오프, CLONTECH) Express는 VAMPs을 뒤집은하는 plasmids의 0.25 μg과 cotransfected 있습니다. </li><li> 각 잘에 t-세포를 들어, 플라스미드 인코딩 트레 - LacZ (pBI-G, CLONTECH)의 0.25 μg는 0.25 μg 익스프레스 SNAP-25와 syntaxins 1 4 뒤집힌있는 plasmids의 각을 cotransfected 있습니다. </li><li> t 후 24 시간ransfection, 세포는 PBS에 4 % paraformaldehyde + + 10 분에 (PBS는 0.1 g / L CaCl 2, 0.1 g / L MgCl 2 보충) 한 다음 PBS에서 10 % FBS에서 차단 + + 30 분에 고정되어 있습니다. </li><li> 세포는 안티 - Myc 단클론 항체 9E10 (깔끔한 하이 브리 도마 문화 표면에 뜨는)에 1.5 시간에 incubated 수 있습니다. </li><li> 4 개의 세차 후 PBS + +, 셀 1:500의 희석에 FITC-복합 차 항체 (잭슨 Immunoresearch 연구소)와 1 시간에 incubated 수 있습니다. </li><li> 4 개의 세차 후 PBS + +, 레이블 셀 골드 antifade 시약 (Invitrogen)를 연장으로 장착되어 있습니다. </li><li> 공 촛점 이미지는 올림푸스 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경에서 수집됩니다. 이미지는 어도비 포토샵 소프트웨어로 처리됩니다. </li></ol> 3. 세포 표면 올무 식의 FACS 분석 <ol><li> transfection 전날, 2 × 10 5 COS-7 세포는 6 잘 플레이트의 각 우물에 놓는 있습니다. </li><li> tra 후 24 시간과 nsfection은 스네어, pTet 오프 및 pBI-G의 plasmids, 방석을 뒤집은 세포는 PBS에 1 % paraformaldehyde와 + + 15 분에 고정하고 PBS에서 10 % FBS에서 + + 15 분에 차단됩니다. </li><li> 세포는 60 분에 반 Myc 단클론 항체 9E10와 incubated 수 있습니다. </li><li> 든 세 세차 후 PBS + +, 셀이 45 분에 FITC-복합 차 항체 (1:200 희석)으로 분류됩니다. </li><li> PBS 든 세 세차는 + +, 세포는 세포 스크레이퍼로 접시에서 긁어 후. </li><li> 15000 세포는 FACSCalibur 흐름 cytometer (BD Biosciences)를 사용하여 분석하고 있습니다. 각 샘플의 평균 형광 강도는 CellQuest Pro 소프트웨어를 사용하여 얻어진다. </li></ol> 4. 효소 세포 융합 분석 <ol><li> transfection 전날, 1.2 × 10 6 COS-7 세포는 각각 100 mm 조직 배양 접시에 놓는, 그리고 2아르 × 10 5 COS-7 세포는 6 잘 플레이트의 각 우물에 놓는 있습니다. </li><li> 5 μg flipp의 각 - V-세포, 0.5에 대한플라스미드 에드 즉석 반주는 각 100 mm 배양 접시에있는 세포에 pTet 오프 5 μg과 cotransfected 있습니다. 제어 세포는 빈 벡터 pcDNA3.1 (+)와 pTet 오프로 cotransfected 있습니다. VAMPs 1, 4, 5, 7, 8, tunicamycin의 N-글리코 실화를 방지하기 위해 (10 μg / ml) 쇼핑은 transfection시 세포 배양 매체에 포함되어 있습니다. </li><li> 6 잘 플레이트의 각 잘에 t-세포의 경우, 1 μg은 SNAP-25 플라스미드를 뒤집힌 및 pBI-G는 0.5 μg과 cotransfected 아르는 플라스미드 syntaxin4을 뒤집은의 플라스미드 syntaxin1 또는 0.05 μg을 뒤집어 졌죠. </li><li> 24 시간 transfection 후, V-세포는 효소가없는 세포 분리 버퍼 (Invitrogen)와 문화 요리에서 분리됩니다. 단독 세포가 hemacytometer로 간주하고에 resuspended 아르 HEPES 버퍼 DMEM 10 % FBS, 6.7 μg / ML의 tunicamycin 및 0.67 밀리미터 DTT와 함께 보충. </li><li> 4.8 × resuspended 10 5 V-셀은 각도 이미 t-세포를 포함에 추가됩니다. </li><li> 6, 12 시간 또는 24 시간 쥐 37 이후 ° C 5 % CO 2 </sub&gt;에서 β-갈 락토의 표현은 제조업체의 지침 (Promega)에 따라 리포터 용해 버퍼와 β-갈 락토 효소 분석 시스템을 사용하여 측정된다. 간단히, 세포는 PBS로 두 번 세척 된 다음 리포터 용해 버퍼에 lysed. 세포 lysates는 분석이 × 버퍼의 동등한 볼륨과 혼합되어 있습니다. 빈 컨트롤으로, 리포터 용해 버퍼는 분석이 × 버퍼과 혼합되어 있습니다. </li><li> 90 분 후, colorimetric 반응은 1 M 나트륨 탄산을 추가하여 중지됩니다. </li><li> 420 나노 미터의 흡광도는 히타치 100-40 분광 광도계를 사용하여 측정된다. </li></ol>

<ol><li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+intracellular+protein+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li>
<li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li>
<li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li>
<li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREs--engines+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SNAREs--engines for membrane fusion.</a> Nature. 7, 631-643 (2006).</li>
<li>Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREpins%3A+minimal+machinery+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion.</a> Cell. 92, 759-772 (1998).</li>
<li>Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).</li>
<li>Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+by+VAMP3+and+plasma+membrane+t-SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs.</a> Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).</li>
<li>Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusogenic+Pairings+of+Vesicle-Associated+Membrane+Proteins+%28VAMPs%29+and+Plasma+Membrane+t-SNAREs+-+VAMP5+as+the+Exception%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception.</a> PloS one. 5, e14238(2010).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+-+four+years+of+SNARE+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).</li>
<li>McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellubrevin+is+a+ubiquitous+tetanus-toxin+substrate+homologous+to+a+putative+synaptic+vesicle+fusion+protein.+%5Bsee+comments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments.</a> Nature. 364, 346-349 (1993).</li>
<li>Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-associated+membrane+protein+4+is+implicated+in+trans-Golgi+network+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking.</a> Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).</li>
<li>Zeng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+synaptobrevin%2FVAMP+homologous+protein+%28VAMP5%29+is+increased+during+in+vitro+myogenesis+and+present+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane.</a> Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).</li>
<li>Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tetanus+neurotoxin-insensitive+vesicle-associated+membrane+protein+in+SNARE+complexes+of+the+apical+plasma+membrane+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).</li>
<li>Wong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endobrevin%2C+a+novel+synaptobrevin%2FVAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

원래 세포 융합 분석 6 형광 현미경으로 올무로 인한 세포 융합 이벤트를 결정합니다. 여기 β-갈 락토 및 spectrometric 측정의 활성화 표현으로 올무로 인한 세포 융합 이벤트를 단정 지을 혁신적인 분석을 설명합니다. 이 분석을 사용하여, 우리는 정기적으로 15 분석 - 20 V-와 t-올무 한 실험에서 조합. 세포 표면에 올무 식을 측정하는 유동 세포 계측법을 사용하여, 우리는 VAMPs의 표현 수준을 적정하다하고 막 융합 용량을 (도 2 및도 4) 비교합니다. 또한, 효소 세포 융합 분석을 사용하여, 우리는 VAMP1 단백질의 세포 표면 밀도의 세포 융합 활동의 의존도를 결정하고, 세포 융합 반응 8 VAMP1 단백질의 더 cooperativity을 관찰하지, 여러 올무 단지의 공동 작업이 필요하지 않습니다 것을 제안 세포 세포막을 융합합니다. putative N-글리코 실화의 moti가 있습니다FS (Asn-X-Ser/Th...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 및 장비 명 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12800-017 </td></tr><tr><td> COS-7 세포 </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td></tr><tr><td> tunicamycin </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T7765-5MG </td></tr><tr><td> pTet 오프 </td><td> Clontech </td><td> K1620-A </td></tr><tr><td> pBI-G </td><td> Clontech </td><td> 6150-1 </td></tr><tr><td> lipofectamine </td><td> Invitrogen </td><td> 18324-012 </td></tr><tr><td> 효소가없는 세포 분리 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 13151-014 </td></tr><tr><td> 토끼 반 TET 억제 polyclonal 항체 </td><td> Millipore </td><td> AB3541 </td></tr><tr><td> FITC - 복합 당나귀 안티 - 마우스 IgG (H + L) </td><td> Jackson의 ImmunoResearch </td><td> 715-095-150 </td></tr><tr><td> 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> FV1000 </td></tr><tr><td> FACSCalibur 흐름 cytometer </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> 리포터의 용해 버퍼와 β-갈 락토 효소 분석 시스템 </td><td> Promega </td><td> E2000 </td></tr><tr><td> 모델 100-40 UV-VIS 분광 광도계 </td><td> 히타치 </td><td> C740843 </td></tr></tbody></table>

효소 세포 융합 분석을 사용하여 올가미로 인한 막 퓨전 분석

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

스네어 (들 oluble N-ethylmaleimide에 민감한 요소 ttachment 단백질 재를 ceptor) 소포 (V-그물)에 및 대상 멤브레인에 단백질의 상호 작용 (T-올무) 세포 소포의 융합 1-4 catalyze. Reconstitution의 assays는 올무로 인한 막 융합 (5)의 체계 및 규정을 해부에 필수적입니다. 세포 융합 분석 6,7에서 스네어 단백질은 세포 표면에 ectopically 표현됩니다. 이러한 올무가 세포 세포막을 융합하기에 충분한 것으로 입증, 스네어 단백질 드라이브 세포 세포 융합 &quot;을 뒤집힌.&quot; 세포 융합 분석은 현미경 분석을 기반으로하기 때문에 여러 V-와 t-올무 상호 작용 양적 분석하는 데 사용하면 덜 효율적이다. 여기 β-갈 락토의 활성화 표현으로 올무로 인한 세포 융합 이벤트를 단정 지을만한 새로운 검정 8 설명합니다. 두테트라 사이클린 제어 transactivator (TTA) 및 테트라 사이클린 - 응답 요소의 제어 (트레 - LacZ)에서 LacZ 유전자를 인코딩 플라스미드 기자 : Tet 오프 유전자 발현 시스템 9의 구성 요소는 판독 시스템으로 사용됩니다. 익스프레스 익스프레스는 세포 표면에 t-올무 단백질을 뒤집은 것이 COS-7 세포 (T-세포)로 세포 표면의 V-스네어 단백질 (V-세포)와 transfect 트레 - LacZ를 뒤집힌 것을 COS-7 세포에 우리 transfect TTA . 트레 전사 LacZ의 활성화 및 β-갈 락토 표현에 TTA의 바인딩의 V-및 T-세포 결과의 올무에 의존 융합. β-갈 락토의 활동은 420 nm의에서 흡수하여 colorimetric 방법을 사용하여 정량하고 있습니다. 소포 - 관련 막 단백질 (VAMPs)는 다양한 사후 Golgi 기공을 갖는 구획에 10-15을 거주 V-올무 있습니다. 동일한 수준의 VAMPs 1, 3, 4, 5, 7, 8을 표현함으로써, 우리는 막 융합을 비교효소 세포 융합 분석을 사용하여 활동. spectrometric 측정을 바탕으로,이 분석은 스네어로 인한 막 융합을 분석 및 높은 처리량을 연구 양적 접근 방식을 제공합니다.

양적 세포 융합 분석을 개발하기 위해, 우리는 트레에 TTA의 바인딩에 의해 강한 전사 활성을 활용할 수 있습니다. TTA의 부재에서, 트레-LacZ에 LacZ 유전자의 전사는 침묵입니다. TTA가 존재하면, 트레에 바인딩와 LacZ의 전사를 활성화합니다. 그림 1은 효소 세포 융합 분석의 순서도를 보여줍니다. TTA는 세포 표면의 특급 V-스네어 단백질, 그리고 트레 - LacZ가 T-세포로 transfected되는 V-셀에 transfected되는 세포 표면에서 명시 적 t-스네어 단백질. 트레 LacZ의 전사 활성화 및 β-갈 락토의 표현에 TTA의 바인딩의 V-및 T-세포 결과의 융합. 그림 2A 협조 올무 구조의 도메인 구조를 보여줍니다. preprolactin 신호 순서는 그물의 N-말단에 융합되어 있습니다. 이러한 엔지니어링...

우리는 β-갈 락토의 활성화 표현으로 올무로 인한 막 퓨전 이벤트를 단정 지을 세포 융합 분석을 개발했습니다.

소낭(vesicle) 상의 SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) 단백질(v-SNARE)과 표적 막 상의...

이 절차의 전반적인 목적은 beta galacto의 활성화된 발현을 통해 snare 매개 세포 융합 이벤트를 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 cost seven 세포 표면에 v 및 t snare 단백질을 외인성으로 발현시킴으로써 수행됩니다. 이 절차의 다음 단계는 V snare 단백질을 발현하는 세포와 T snare 단백질을 발현하는 세포를 결합하는 것입니다.그 결과 snare 매개 세포 융합과 beta galacto의 활성 발현이 일어납니다. 최종적으로, 세포 융합으로 유도된 beta galacto 활성은 분광광도계를 사용하여 측정합니다. 이 기술 또는 현미경 SAL 영역 분석과 같은 기존 방법의 주요 장점은 여러 snare 조합을 분석할 수 있다는 점입니다.정량적으로, 이 방법은 snare 매개 막 융합의 메커니즘과 조절을 이해하는 데 적용될 수 있습니다. 또한, 처리량 연구(throughput studies)에도 적용 가능합니다. 실험 절차 시연은 제 연구실의 박사후 연구원인 Doc Na Hassan과 테크니션인 David Humphrey가 수행하며, 트랜스펙션 로드 전날에 진행됩니다.12mm 유리 커버 슬립이 포함된 24웰 플레이트를 준비하고, 실험에서 고유한 플라스미드를 발현하는 세포들의 각 조합당 두 개의 웰을 준비합니다. 4.5 g/L의 glucose와 10% FBS가 첨가된 DMEM에서 배양된 COST7 세포 30,000개를 각 커버 슬립에 분주합니다. V 세포를 형질전환시키기 위해 각 웰에 0.25 µg의 TTA 플라스미드와 한 세트의 발현 플라스미드를 첨가합니다.이 경우 관심 대상인 flipped 단백질, 즉 flipped vamps를 T 세포에 형질전환시키기 위해 TRE lacks Z를 인코딩하는 플라스미드 0.25 µg과 flipped 단백질인 snap 25, syntaxin one 및 syntaxin four를 인코딩하는 상보적 플라스미드 세트를 첨가합니다. 이제 제조사의 지침에 따라 lipofectamine으로 cost seven을 형질전환하고 세포를 24시간 동안 배양합니다. 형질전환 24시간 후, 보충된 paraformaldehyde로 세포를 10분 동안 고정합니다. 고정 후, PBS++로 세포를 3회 세척한 다음, 보충된 FBS로 세포를 30분 동안 블로킹합니다.블로킹 후, cells를 anti mic 단클론 항체 Nine E 10과 함께 30분 동안 반응시킵니다. PBS++로 4회 세척한 후, 1:500으로 희석한 fitzy 접합 2차 항체와 함께 cells를 1시간 동안 반응시킵니다. PBS++로 4회 더 세척한 후, 표지된 cells를 시판되는 anti-fade 시약으로 마운팅합니다.이제 세포를 공초점 현미경으로 관찰할 준비가 되었습니다. transfection 전날, 분석할 각 플라스미드 조합당 100mm 조직 배양 접시에는 120만 개의 Cos-7 세포를, 6-well 플레이트의 각 well에는 20만 개의 Cos-7 세포를 분주하십시오. 한 개의 well을 준비하여 세포를 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, transfection을 위해 플라스미드를 첨가합니다. V 세포의 경우, 각 100mm 배양 접기의 세포에 목적 Flippase 단백질을 발현하는 플라스미드와 5µg의 pTet-off를 transfection하십시오.100 mm 배양 접시의 대조군 세포에 빈 벡터와 P te off를 V 세포와 동일한 상대 농도로 공동 형질전환합니다. 모든 플라스미드가 V 세포와 대조군 세포에 첨가되면, vamps의 N-당화(N-glycosylation)를 억제하기 위해 해당 웰에 tcom mycin을 첨가합니다. 6-웰 플레이트의 각 웰에서 관심 단백질을 발현하는 상보적 플라스미드가 포함된 1 µg의 PBIG를 T 세포에 공동 형질전환합니다.이제 제조사의 지침에 따라 lip을 사용하여 cost seven 세포를 형질전환하십시오. 그 후 세포를 24시간 동안 배양하고, 형질전환 24시간 후에 효소 없는 세포 해리 버퍼를 사용하여 배양 접시에서 V 세포를 떼어내십시오. 먼저 20 milliliters의 PBS로 세포를 한 번 세척하는 것으로 시작하십시오.그 다음 효소 제거 해리 버퍼(enzyme free dissociation buffer) 5 mL를 첨가합니다. 실온에서 10분간 배양한 후, 플레이트를 강하게 두드려 세포를 떼어내고 현미경으로 세포가 분리되었는지 확인합니다. 세포의 절반 미만이 분리되었다면, 5분 더 기다린 후 플레이트를 다시 두드립니다.세포의 절반 이상이 떨어져 나올 때까지 분리 버퍼에서 배양을 계속합니다. 그런 다음 혈구계수기로 V 세포의 수를 측정합니다. 이후 보충제(supplemented)가 첨가된 헤이즈 버퍼 DMEM에서 V 세포를 mL당 약 480,000 cells의 농도로 재부유시킵니다.이제 T 세포가 들어 있는 각 웰에 재현탁된 V 세포 1 mL를 추가하고 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣으십시오. 세포를 6, 12 또는 24시간 동안 공동 배양한 후, PBS로 세척하고 용해 버퍼를 추가합니다. 다음으로, 웰에서 세포를 긁어내어 원심분리를 위해 튜브로 옮깁니다.원심분리 후 상층액을 새 튜브로 옮기고, 해당 프로토콜의 제조사 지침에 따라 시판되는 분석 키트를 사용하여 beta galacto의 발현량을 측정하십시오. 이때, 결과 점수를 매기기 위해 1 M sodium carbonate를 첨가하여 90분 후 콜레라 메트릭 반응을 반드시 중단시키십시오. 분광광도계를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하십시오. CO seven 세포에 flipped snare 플라스미드를 형질전환했을 때, 세포 표면에서 flipped snare 단백질이 발현되었습니다.세포 표면의 snare 단백질 발현 수준을 측정하기 위해 유세포 분석법(Flow cytometry)을 사용하였습니다. 막 융합 능력을 비교하기 위해서는 vamp가 동일한 수준으로 발현되어야 했습니다. 따라서 transfection에 사용된 각 flipped snare 플라스미드의 농도를 적정하여 transfection 조건을 최적화하였습니다.이러한 조건 하에서, vamps 1, 3, 4, 5, 7, 8과 syntaxin 1 및 4가 각각 세포 표면에서 동일한 수준으로 발현되었으며, 시냅스 엑소사이토시스(synaptic exocytosis)를 매개하는 뉴런 SNARE를 사용하여 해당 분석법의 타당성을 테스트하였다. 실제로 vamp 2를 발현하는 V 세포와 SYNTAXIN 1 및 SNAP-25를 발현하는 T 세포를 결합했을 때, 강력한 beta-galactosidase 발현이 검출되었다. 그러나 vamp 2 또는 SNAP-25 중 어느 하나라도 발현되지 않았을 때는 기저 수준의 beta-galactosidase 활성만이 검출되었으며, 이는 세포 융합과 beta-galactosidase의 발현이 v-SNARE와 t-SNARE 간의 상호작용에 의존함을 나타낸다. 전반적으로 SYNTAXIN 1, SNAP-25, vamp 1, vamp 3, vamp 8이 비슷하게 가장 높은 융합 활성을 보였다.반면, 기저 beta GAL 활성은 해당 단백질 조합이 vamp 5와 SYNTAXIN 1의 사례와 같은 막 융합을 유도하지 않음을 시사합니다. Snap 25. 효소적 융합 분석을 수행할 때, SNARE 단백질의 N-당쇄화를 방지하기 위해 tunicamycin을 첨가하고, SNARE 단백질 간의 이황화 결합 형성을 방지하기 위해 DTT를 첨가해야 함을 기억하는 것이 중요합니다.이 영상을 시청한 후에는 세포 융합 분석법을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

analysis-snare-mediated-membrane-fusion-using-an-enzymatic-cell

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

이 비디오에서 우리는 세포의 효율적인 electrofusion을...

세포는 형광 현미경 Electrofusion와 시각

Mitochondrial 융합은 시간이 지남에 mitochondrial 네트워크 photoconverted 매트릭스 타겟 GFP의 평균 추적에 의해 측정되었다. 지금까지 하나의 세포는 한 번에 한 시간 동안 운동 분석을 받다 수 있습니다. 우리는 동시에이를 통해 데이터 수집 과정을 속도, 여러 개의 세포를 측정하는 방법을 제시한다.

병렬 공촛점 현미경을 사용하여 여러 세포의 운동 데이터를 취득 빠르고 높은 해상도, mtPA-GFP 기반 Mitochondrial 퓨전 분석

생화학적 분석과 결합된 광학 현미경 기술은 네트린 의존성 축삭돌기 분지화에서 SNARE 매개 외세포작용의 관여를 밝힙니다. 이러한 기술의 조합을 통해 축삭돌기 분지 및 세포 모양 변화를 제어하는 분자 메커니즘을 식별할 수 있습니다.

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

여기, 우리는 단일 분자 감도와 ~ 15 밀리 초 시간 해상도와 편광 TIRFM를 사용하여 리포좀과 미세 유체 채널에 지원 이중층 사이에 하나의 SNARE 매개 융합 이벤트를 감지하는 프로토콜을 제시한다. 지질 용해성화물 분리를 동시에 검출 할 수있다. 리포좀의 크기, 지질 확산과 융합 기공 특성을 측정한다.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

이 프로토콜에는 포스터 공명 에너지 전달, 및 현미경 이미징 형광 수명에 따라 무 단백질의 복잡 한 형성의 양적 시각화에 대 한 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다.

형광 일생 화상 현미경 검사 법에 의해 인신 매매 세포내 올 무를 떠 올 리

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

여기, 우리 N 터미널 hexahistidine/맥 아당 의무적인 단백질 및 형광 단백질 융합 재조합 기판 니켈 nitrilotriacetic의 표면에 부착 된 최근에 개발한 효소 분석 플랫폼의 상세한 절차를 제시 산 자기 agarose 구슬입니다. 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법으로 분리 분석 결과 샘플의 후속에 젤 분석 또한 제공 됩니다.

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

생물학적 막 융합은 특수 융합 단백질에 의해 촉매됩니다. 단백질의 fusogenic 특성을 측정하는 것은 지질 혼합 분석을 통해 달성될 수 있다. 우리는 재조합 Drosophila 아틀라를 정화하는 방법을 제시, ER의 상모 융합을 중재하는 단백질, 미리 형성 된 리포솜에 그것을 재구성, 융합 용량에 대한 테스트.

지질 혼합 애신을 위한 리포솜으로 재조합 초파리 아틀라스틴의 세제 지원 재구성

이 프로토콜은 소 부신 크로마핀 세포에서 세 가지 융합 모드를 검출하기 위한 공초점 이미징 기술을 기술한다. 이러한 융합 모드에는 1) 융합 기공 개폐 및 폐쇄를 포함하는 근접 융합 (키스 앤 런이라고도 함), 2) 융합 기공 개방 및 개방 된 기공 유지를 포함하는 체류 융합, 3) 융합 된 소낭 수축을 포함하는 수축 융합이 포함됩니다.

부신 크로마핀 세포에서 융합 기공 역학의 세 가지 모드를 측정하는 공초점 현미경 검사

배우세요 SNARE 매개 세포 융합을 정량화하는 효소 세포 융합 분석법을 사용하여 막 역학을 연구하는 방법입니다. 베타갈락토시다제 보고자를 활용한 이 기법은 다양한 SNARE 조합 분석이 가능하여 세포생물학 연구에 유용합니다.

효소 세포 융합 분석을 사용하여 올가미로 인한 막 퓨전 분석

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