Name: 신경 침윤성 Encephalitic 바이러스의 생체 이미징 시스템 (IVIS) 검색에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 학습하세요 중추신경계 바이러스 감염을 생체 발광 기술과 IVIS로 실시간 시각화하는 방법을. TC 83 백신주와 루시퍼라제 유전자를 활용하여 바이러스 복제를 추적하고 백신 및 항바이러스제 효능을 평가합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 원고에 대한 비디오 편집과 그녀의 도움 병진 과학 UTMB-NIH 보조금 1UL1RR029876-01과 Alisha 프레이 연구소.

1. 동물 준비 <ol><li> 동물 도착 : 동물 바이오 안전성 수준 2 (ABSL2) 시설에 도착시, 동물에게 그들의 새로운 환경에 적응하기 위해 이일을 최소 할 수 있습니다. 이 휴식 기간 후, 자신의 건강 및 전반적인 신체적 인 외모를 평가하기 위해 동물을 검사한다. <ol><li> 형광 기자를 활용하면은 GI의 autofluorescence 및 배경 신호의 양을 제한하는 알팔파 무료로 다이어트의 모든 동물 과목을 배치하는 것이 중요합니다. </li></ol></li><li> 동물을 면도 : 영상 중에 두개 지역에서 발견 발광 생물 신호를 향상 시키려면, 모든 동물의 머리를 면도. 산소 가스의 혼합물로 동물을 마취하고 isoflurane 기화. 동물이 완전히 anesthetized되면​​, 그들의 머리를 면도하는 전기 면도기를 사용합니다. 일단 면도가 완료, 자신의 새장에 동물을 반환하고 마취의 영향으로부터 완전히 복구를 위해 관찰합니다. </li><li> 바이오 의사 데이터시스템 (BMDS) 트랜스 폰더 삽입 (동물이 완전히 anesthetized있는 동안 마우스 면도 후 자리를 차지) : 덜 침습적 방법은 preprogrammed BMDS 무선 송수신기는 각 마우스의 등 지역에 피하 온도 이식을 추적 할 수 있습니다. 이 트랜스 폰더는 무선 식별 및 온도 기록을위한 수 있습니다. 트랜스 폰더의 주입 후, 상처에 수의학 급 조직 접착제를 적용합니다. </li><li> 기본 컬렉션 : 감염 전에, 모든 동물들에게 기준 온도와 무게를 기록합니다. 쥐가 마취에서있는 동안 복고풍 궤도 (RO) 블리드를 통해 플라크 감소 중화 시험 (PRNT) 분석을 위해 혈액을 수집합니다. 혈액 수집 후, 잠재적 인 이차 세균 감염을 줄이기 위해 수의학 항생제 눈 연고를 적용 할 수 있습니다. 이 기본 컬렉션은 동물 쥐에 의한 스트레스로 마취하에 배치 횟수를 고려하여 완료해야합니다. 미래 RO 컬렉션의마우스가 마취에서있는 동안 신고해야할, 영상 이후에 완료 될. RO에서 수집 한 최대 혈액 200 μl 주변에 있어야합니다. </li><li> 감염 : 이전에 설명 된대로 마취하에 장소 마우스. 인산에 의해 희석 40 μl의 총 볼륨의 - 루시 페라 제 TC83 5x10 6 5x10 7 PFU의 복용량을 사용하여 비강 경로를 통해 예방이 비강 감염을 통해 (PBS) 식염 버퍼링. 감염 후, 자신의 주택 케이지 내에서 쥐를 넣고 복구를 관찰합니다. </li></ol> 2. 동물 이미징 면책 조항 : 자신의 주택 단위, 바이오 캐비닛 (BSC), 또는 항상 XIC 봉쇄 상자에서 마우스세요. 이 프로토콜에 대한 승인 BSCs은 클래스 II 타입 B1 또는 B2 있습니다. <ol><li> 15 MG / ML의 농도에 intraperitoneal (IP) luciferin의 체중 g 당 10 μl와 함께 모든 동물을 주사. <ol><li> Ampligen을받는 쥐 injecte하여야한다자신의 그룹에 따라 -4 시간 포스트 감염 또는 48 시간 게시물 감염에서 12.5 밀리그램 / kg 체중의 복용에 d 개의 IP. </li></ol></li><li> 이전 luciferin을 주입하기 XIC-3 봉쇄 상자에서 적절한 운동을 보장하기 위해 세 그룹으로 쥐를 구분합니다. <ol><li> 모든 영상은 절차를 통해 각막의 건조를 방지하기 위해 안구 연고 / 윤활제를 사용합니다. </li></ol></li><li> LivingImage 소프트웨어와 언론 이미징 상자를 준비하는 초기화 열고, 설정 자동 저장, 자동으로 노출 시간 (자동 LivingImage 소프트웨어 3.2 이상의 새로운 기능입니다에 대한 노출 시간), C로의 현장을 볼 수 있으며, 열 필터, 분야 보기의는 사용자가 이미지 아르 생쥐의 수에 기초 및 기타 영상 프로젝트를 위해 필요에 따라 필터를 최적화 할 수 있습니다. </li><li> 공기 숯 필터가 만료되지 않은 확인, 산소 탱크 가득하고, isoflurane 저수지가 가득 차 있습니다. XIC-3 전에서 전기 테이프의 작은 조각을 배치어떤 solation 상자 이미징 동안 동물의 움직임을 줄여 도와드립니다. </li><li> 3-5 분의 Isoflurane 유도 챔버 (뚜껑을 열 포함) 내에 섹션 2.1 및 장소에 설명 된대로 luciferin의 IP와 쥐를 주사. </li><li> 5 분 후, 유도 챔버의 뚜껑을 닫고 isoflurane의 흐름을 시작합니다. 마취가 약 2.0 L / 분에서 산소 유량 세트 약 3~5%에서 운영하고 있습니다. 일단 완전히 의식 추가 30 초를 기다린 XIC-3 절연 상자에 쥐를 전송합니다. 이 절차는 유도 챔버 (IVIS 단위가 자신의 수동 공정 용기 및 XIC-3 억제 상자가 직접에 / 소켓 아웃에 연결을 포함에서 isoflurane의 손실을 포함하므로 이용되는 바이오 안전성 캐비닛은 isoflurane의 소기의 안전을 위해 할 수 있는지 확인 ) 포함 마취 흐름을 보장 할 수 있습니다. <ol><li> 첨부 isoflurane 커넥터와 XIC-3 절연 상자에 칩 / 그룹 번호에 따라 쥐를 전송d는 엽니 다. 그들이 부드럽게 테이프 스트립에 쉬고있는 머리로 흉골 드러 누움에 배치되도록 마우스를 배치합니다. </li></ol></li><li> cavicide과 에탄올, 스프레이 손과 XIC-3 하단으로 XIC 봉쇄 상자를 닦아하고, IVIS 이미징 챔버에 전송할 수 있습니다. 한 번 이미징 유닛 내부의 밀폐 상자에 마취를 다시 연결하십시오. </li><li> 후 luciferin의 주입에 따라 10 분, 생활 이미지 소프트웨어를 통해 이미지가 쥐를. </li><li> 오픈 필터 초기 이미징 따라 순서 분석 및 발광 생물 반딧불의 루시 페라 제의 이미지 마법사 설정을 사용하여 DLIT 3 차원 영상을 시작합니다. 이 이미징 프로세스 4-5 분 소요됩니다하고 원하는 생쥐의 수에 대한 관련 뷰의 필드에서 완료해야합니다. <ol><li> 전 생체 분석은 뇌의 가능한 다음 검시 및 모음입니다. 멸균 페트리 접시에 뇌를 놓고 IMA에서 50-100 상단에 주식 luciferin의 μl, 그리고 장소를 똑상자를 ging. </li></ol></li><li> DLIT 영상이 완료되면 15-17 분 후 감​​염에 두 번째 오픈 필터 이미지를 완료. 서열 분석이 꺼져 확인 및보기 및 필터 설정의 필드가 이전 설정으로 돌아갑니다. </li></ol> 3. 반환 마우스 및 데이터 분석 <ol><li> isoflurane vaporizer를 끄고 바이오 안전성 캐비닛으로 다시 XIC 봉쇄 상자를 전송할 수 있습니다. </li><li> 자신의 주택 단위에서 다시 마우스를 놓고, 다시 주택 랙에 대해 적절한 살균제과 장소와 외관을 뿌려 상단을 닫습니다. <ol><li> 확인 마우스는 완전히 마취에서 회복했습니다. </li></ol></li><li> 이미징이 완료 될 때까지 실험에서 요구하는대로 위의 절차를 반복합니다. </li><li> , BSC를 소독 장비를 종료하고, 추가 분석을 위해 외부 실험실 위치에 모든 데이터를 전송할 수 있습니다. </li><li> 데이터를 분석하고 IVIS 결과 uti에 따라 3 차원 이미지를 생성LivingImage 소프트웨어를 lizing. <ol><li> 이미지가 제대로 지향하고 조명 / 색상 균형이 설정되어 있는지 확인합니다. 도구 팔레트 내 옵션은 이미지, 조정 정정, 이미지 정보, 투자 수익 (ROI) 도구 등이 있습니다. </li><li> 위치에 따라 특정 신호 강도를 식별 할 투자 수익 (ROI) 모양을 사용합니다. </li><li> , 마우스 몸을 강조하기 위해 표면 지형을 재구성 3D DLIT 재건를 초기화하고, 지형 재건에 장기 맵을 설정하는 선형 운동을 사용합니다. </li></ol></li><li> 또한 바이러스 적정 분석 혈액 및 장기의 컬렉션을 완료 할 수 있습니다. 본 연구에서는 적정은 수정 독수리 매체 (가상)에서 뇌 조직의 균질화를 통해 완성되었습니다. homogenate는 순차적으로 희석 우리는 1 시간에 Vero 세포의 6 잘 판을 감염되었습니다. 세포는 1.5 % agarose/2xMEM 오버레이로 덮여 있으며 37도에서 2 일 incubated되었습니다. 세포는 30 분에 포르말린 10 %로 고정되어 물들되었습니다크리스탈 바이올렛. </li></ol>

<ol><li>Steele, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Neurovirulence+and+Tissue+Tropism+of+Wild-type+and+Attenuated+Strains+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Administered+by+Aerosol+in+C3H%2FHeN+and+BALB%2Fc+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology+Online%22%5BJournal%5D)">Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice.</a> Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).</li>
<li>Ludwig, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+neurovirulence+of+attenuated+and+non-attenuated+strains+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).</li>
<li>Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Neuroinvasion+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse.</a> Virology. , 208-662 (1995).</li>
<li>Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficient+packaging+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus-specific+RNAs+into+viral+particles+is+determined+by+nsP1-3+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis.</a> Virology. 344, 315-327 (2006).</li>
<li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+non-invasive+imaging+of+alphaviral+brain+infection%3A+Reducing+animal+numbers+and+morbidity+to+identify+efficacy+of+potential+vaccines+and+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals.</a> Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).</li>
<li>Cook, S. H., Griffin, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luciferase+Imaging+of+a+Neurotropic+Viral+Infection+in+Intact+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals.</a> J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).</li>
<li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+indicators+in+living+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nat. Med. 4, 245-247 (1998).</li>
<li>Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Monkeypox+Viruses+Pathogenesis+in+Mice+by+In+Vivo+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging.</a> PLoS ONE. 4, e6592(2009).</li>
<li>Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Imaging+Reveals+Systemic+Dissemination+of+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+in+the+Absence+of+Interferon+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors.</a> J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , (1959).</li>
<li>Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+mouse+model+for+the+evaluation+of+potential+antiviral+compounds%3A+results+with+Venezuelan+equine+encephalomyelitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).</li>
<li>Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pegylated+Alpha+Interferon+Is+an+Effective+Treatment+for+Virulent+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+and+Has+Profound+Effects+on+the+Host+Immune+Response+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection.</a> J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 프로토콜은 생체 분석을위한 이미징 측면을 다루고 있지만, 향후 연구를위한 중요한 요소로 발광 생물 벡터를 인식하는 것이 중요합니다. 루시 페라 제 표현을위한 벡터로 TC83 우리의 활용, VEEV의 감쇠 백신 변형은 효소의 대량는 이전 1-4에 설명 된대로 CNS에서 바이러스의 높은 복제 속도로 인해 생산되고 있다는 보장합니다. 재조합 바이러스의 추가 감쇠에 두 번째 subgenomic 발기인 및 루시 페라 제 유전자 결과의 추가는 야생 타입 TC83에 비해 있지만,이 감쇠 감염 5 첫번째 6 일 이내에 질병의 임상 과정을 변경하지 않는 것 같습니다. 우리는 기대 시간이 지남에 따라 바이러스의 복제를 통해 루시 페라 제 유전자의 손실을 볼 수 있지만, 다시는 질병의 개발에까지 나중에 볼 수 없습니다. 바이러스와 박테리아 등 병원성 벡터,의 개발 가능성과 효율성을 확인병원체 연구 6-9의 여러 분야에 걸쳐 IVIS과 루시 페라 제의. <p cl...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xenogen IVIS 시스템 (스펙트럼) </td><td> 캘리퍼스 생명 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> XGI-8-가스 마취 시스템 </td><td> 캘리퍼스 생명 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> XIC-3 억압 박스 </td><td> 캘리퍼스 생명 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LivingImage 4.0 소프트웨어 </td><td> 캘리퍼스 생명 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 원격 / 식별 칩 </td><td> 바이오 의사 데이터 시스템 </td><td> IPTT-300 </td><td> 동물 ID 및 성격ature </td></tr><tr><td> 26 GX 3 / 8 &quot;바늘로 BD Integra 1ml TB의 주사기 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 305279 </td><td></td></tr><tr><td> 수의사 본드 조직 접착제 </td><td> 피셔 과학 </td><td> NC9259532 </td><td></td></tr><tr><td> Vetropolycin의 안과 연고 </td><td> 웹스터 동물 제품 </td><td> 78444656 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 인산이 식염 1X 버퍼 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> BMDS 칩 리더 </td><td> 바이오 의사 데이터 시스템 </td><td> DAS-7007S </td><td></td></tr><tr><td> DAS-HOST 소프트웨어 </td><td> 바이오 의사 데이터 시스템 </td><td></td><td> 프로브 정보를 다운로드하는 데 사용 </td></tr></tbody></table>

신경 침윤성 encephalitic 바이러스의 생체 이미징 시스템 (ivis) 검색에서

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

영상 기술의 현대적인 발전은 바이러스 성 연구가 수행되는 방식으로 발전하고 상세 검색을 권장합니다. 처음 흄의 3Rs에 Russel과 버치 제안한 (교체, 감소, 정제), 과학 연구에서 동물 모델의 활용은 과학 정확성과 속도를 향상하면서 동물 사용을 줄이기 위해 새로운 방법론을 식별 할 수 지속적인 압력을 받고 있습니다. 흄의 원칙에 대한 주요 도전하지만, 동물 질병 병적 상태와 전체 숫자를 줄이는 한편 연구 통계적으로 정확하도록하는 방법입니다. 백신 효능 연구는 현재 통계적으로 유의미한 것으로 간주하기 위해 동물의 다수를 필요로 종종 면역 보호의 식별을위한 높은 병적 상태와 사망률의 끝점하는 결과를 가져올 수도 있습니다. 우리는 점점 줬어에 의해 중추 신경계 (CNS)의 침략을 추적 할 반딧불 발광 생물 효소와 함께 생체 이미징 시스템 (IVIS)에 활용손쥐 모델의 phalitic 바이러스. 일반적으로,이 병은 비교적 천천히 진행하지만 바이러스 복제는 특히 CNS 내에서 빠른 속도이며, 종종 치명적인 결과로 이어질 수 있습니다. TC83 룩과 마우스의 비강 감염 후, 감쇠 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 변종이 루시 페라 제 유전자를 표현하도록 수정, 우리는 최소 3 일전에 임상 질병의 증상을 개발하기 전에 뇌에서 바이러스 복제를 시각화 할 수 있습니다. 우리는 임상 증상이 개발되기 전에 신속하게 TC83 룩 감염에 대한 치료 및 백신 보호 기능을 식별 할 수있는 키 encephalitic 질병 개발 엔드 포인트로 CNS의 침략을 활용. IVIS 기술을 통해 우리는 동물 번호와 질병을 줄이면서 약물 치료학 및 백신의 신속하고 정확한 테스트를 시연 할 수 있습니다.

바이러스 복제가 중앙 CNS (그림 1)에 코 지역에서 이동하는 유전자 변형 바이러스, TC83 - 루시 페라 제, 우리는 발광 생물 신호 강도의 증가를 보았다. 높은 바이러스 복제 속도로 인해, 우리는 벡터 및 벡터에 대한 동물 면역 반응에 의존 발광 생물 신호의 높은 수준 (그림 2A)를 참조 할 예정입니다. 우리는 CNS에서 바이러스 복제 피크 (그림 2B)와 함께, 일 5-7 후 감염 사이에,이 신호 증가 피크를 계속 할 예정입니다. 신호 및 바이러스 피크 따라, 우리는 바이러스 복제의 감소로 인해와 루시 페라 제 유전자의 손실로 인해 두 신호의 감소를 볼 것으로 기대합니다. 이러한 신호 값으로 우리는 정확하게 하나의 동물 specif에서 점진적으로 증가 바이러스 부하를 계산하기 위해 생체 방법에를 제공하는 신호의 강도에 따라 바이러스 부하를 정할 수있을 것으로 예상<html> TC83 - 루시 페라로 IC. </...

소설로 루시 페라 제 및 생체 이미징 시스템 (IVIS)에서를 활용하면 임상 개발가 발생하기 전에 질병 끝점을 식별 할 수 의미합니다. IVIS은 우리가 미래 연구를위한보다 정확한 질병 모델을 제공 실시간으로 여러 일 동안 encephalitic 바이러스의 침입을 시각화 할 수 있습니다. 또한 우리는 신속하게 현재 활용 동물 모델보다 antivirals과 백신의 잠재적 인 보호 기능을 식별 할 수 있습니다. 여러 시간 지점을 통해 개인 동물을 활용하는 기능은 감소 동물의 요구 사항, 비용, 질병 연구의 더 인간적 더 과학적인 수단을 확보 활용 동물 전반적인 질병을 보장합니다.

신경 침윤성 Encephalitic 바이러스의 생체 이미징 시스템 (IVIS) 검색에서

영상 기술의 현대적 발전은 바이러스 연구 수행 방식의 추가적인 발전과 개선을 촉진하고 있습니다. 최초로 ...에 의해 제안된

오늘은 생물 발광 기술을 사용하여 Aurine 종 내의 알파 바이러스에 의한 중추 신경계 감염을 탐지하는 방법을 소개합니다. 이 방법은 반딧불이 루시페라아제 유전자가 삽입된 베네수엘라 말 뇌염의 약독화 생백신 균주인 TC 83을 활용하며, 이를 통해 바이러스가 숙주 내로 확산됨에 따른 복제 과정을 추적할 수 있습니다. 최근 발표된 백신 관련 논문에서 우리는 중추 신경계(CNS) 침투를 시각화하는 능력을 입증하였으며, 이를 대조군에서 임상적 질병이 나타나기 전 백신 및 항바이러스 치료제의 효능을 테스트하기 위한 연구 종점으로 활용하였습니다.안녕하세요, 저는 텍사스 대학교 의료분과(University of Texas Medical Branch)의 고위험 격리 실험실에서 근무하는 동물 기술자 Allison Ard입니다. 이 영상에서 보게 될 연구는 저와 UTMB의 대학원생인 Michael Patterson, 그리고 저희 실험실의 선임 대학원생인 Katie Taylor가 함께 수행하였습니다. 모든 실험 과정은 환경 보건 및 안전 규정을 준수하고 IACUC의 최종 승인을 받아 Galveston National Laboratory에서 in vivo 이미징 시스템을 사용하여 진행되었습니다.IVUS는 각 개체 동물에 대해 매일 영상을 생성할 수 있는 기능 덕분에 연구에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있게 해줍니다. 오늘 개요에서는 이마 제모, BMDS 칩 삽입, TC 80 D를 이용한 비강 내 감염, 영상 촬영을 위한 루시페레이스(Luciferase)의 복강 내 3회 주사, 그리고 바이오콘(Biocon) 격리 캐비닛에서 영상 촬영 상자로 동물을 옮기는 핸들링 과정을 보여드릴 것입니다. 영상 촬영 상자에서 캘리퍼스(caliper's) 영상 유닛으로 동물을 옮기는 과정, 실제 영상 촬영 과정, 2차원 및 3차원 영상 촬영, 그리고 촬영 후 동물을 다시 생물안전 작업대로 옮기는 과정을 다루겠습니다.저희 동물 실험실에는 모든 in vitro 및 in vivo 절차가 수행되는 2등급 생물안전작업대(biosafety cabinet)가 한 대 있습니다. 생물안전작업대 옆에는 isof fluorine 기화기와 컴퓨터 인터페이스가 연결된 Cali ivu spectrum이 배치되어 있습니다. Isof fluorine 기화기는 흡입 마취제를 정밀하게 투여할 수 있게 하며, 주사제 마취제에 비해 마우스를 더 빠르고 안전하게 마취할 수 있는 수단입니다.XI C3 이미징 박스는 HEPA 필터가 장착된 밀폐 장치로, 실험실 내에서 동물을 안전하게 운반할 수 있게 해줍니다. 이전 연구들을 통해, 털색이 어두운 해양 종은 털로 인해 생물 발광 신호가 억제된다는 것을 확인하였습니다. 따라서 연구 전반에 걸쳐 신호 검출력을 높이기 위해 이마와 코 부분을 면도할 것을 권장합니다.본 연구 전반에 걸쳐, 온도 및 동물 식별 정보를 무선으로 수집할 수 있는 BMDS 트랜스폰더 칩을 사용하였습니다. 이러한 수집 방식은 동물의 핸들링과 스트레스를 줄여줍니다. 에탄올 솜으로 털을 눕혀 정리한 후, 칩을 피하로 삽입합니다.마우스가 마취된 상태에서 비강 내 감염을 위해 동물을 마취합니다. 의식을 잃으면 각 동물의 목덜미를 부드럽게 잡고 코가 위를 향하도록 고정합니다.각 콧구멍에 20 µL씩 피펫팅합니다. 마우스당 총 40 µL를 투여하되, 접종액이 목구멍 뒤쪽에 고이지 않도록 방울 사이사이에 동물이 숨을 쉴 수 있게 합니다. IP 루시페린 주사를 위해, 목덜미를 잡고 꼬리를 새끼손가락과 약손가락 아래에 두어 동물을 부드럽게 보정합니다.그 다음, 혈류 내에서 Lucifer가 최대한 확산될 수 있도록 각 동물의 복강에 Luciferian을 주입합니다. 주입 후 5~10분 동안 대기한 뒤, 영상 촬영을 위해 마우스에 마취를 실시합니다. 마취가 완료되면 동물을 XI C3 영상 촬영용 격리 박스로 이동시킬 수 있습니다.두개골의 변위를 줄이기 위해 머리를 검은색 전기 테이프 조각 위에 조심스럽게 올려 놓습니다. 호흡으로 인한 움직임이 3차원 영상 촬영, 전체 사지 신전 및 XI C3 장치 내 복와위 자세를 포함한 모든 영상 촬영 과정에 방해가 될 수 있으므로, 최적의 지형적 매핑을 위해 이를 확인합니다. 모든 동물이 적절하게 배치되면 XI C3 박스를 밀봉하고 장치 외부를 에탄올로 닦아낸 후, 손을 소독하고 생물안전 작업대에서 박스를 꺼냅니다.XI C3 박스를 ivus Imaging Unit 내부에 배치할 때, 마취제 유입구와 유출구가 XI C3 박스에 부착된 HEPA 필터에 올바르게 연결되었는지 확인하십시오. 또한, 이미징 유닛을 닫고 마취제 흐름을 시작하기 전에 이미징 그리드가 마우스를 완전히 둘러싸고 있는지 확인하십시오. living image 소프트웨어를 실행한 후, 사용자 계정으로 로그인해야 합니다.그 다음 ivus 장치를 초기화합니다. IVUS 장치가 준비되면 온도 표시등이 녹색으로 변하며, 이는 약 -90 °C에서 이루어집니다. 노출 시간은 자동 감지를 사용하며, 나머지 모든 설정은 기본 설정으로 둡니다.이미지 획득이 완료되면 기본 화면에 표시됩니다. 관심 영역(ROI)을 선택하여 신호 강도가 강한 특정 영역을 자동으로 검출할 수 있습니다. 또한, 시스템이 3차원 이미징을 위해 자동으로 식별하지 못하는 강도가 높은 영역을 사용자가 직접 입력하여 시각화할 수도 있습니다.시퀀스 설정 옵션을 선택하고, imaging wizard를 선택한 후, bioluminescence를 선택하십시오. bioluminescence가 선택되면, DLIT를 클릭하고 next를 클릭하십시오. DLIT 항목에서 US Firefly에 적절한 리포터가 선택되었는지 확인하고 Next를 클릭하십시오.모든 정보가 정확한지 확인하십시오. 여기서는 시야(field of view)가 C 크기인 마우스의 이미징 대상을 설정하였습니다. 그런 다음 '다음(next)'을 클릭하면 560 nm에서 640 nm까지 다양한 파장의 이미지 5개 세트가 생성됩니다.첫 번째 이미지 내에는 3차원 이미징을 위해 촬영한 지형 이미지가 포함되어 있습니다. 그런 다음 'acquire sequence'를 클릭합니다. 다섯 개의 이미지가 모두 획득되면, 이미징 시퀀스 설정을 닫고 이미지 조작을 시작할 수 있습니다.3차원 재구성을 개발하기 위해서는 먼저 정밀한 지형도를 확보해야 합니다. 대상물을 생쥐로 설정하고 배면 방향으로 맞춘 뒤 재구성합니다. 상자의 배경 영역은 제외하고 생쥐 본체만을 강조하여 표시합니다.다음(next)을 클릭합니다. 이 섹션은 이미지 상태와 사용 중인 컴퓨터 시스템에 따라 시간이 다소 소요될 수 있습니다. 완료되면 마우스 신체의 지형도가 생성됩니다. 이후 DLIT 3D 재구성 단계로 이동합니다.임계값 설정과 조직 속성이 올바르게 설정되었는지 확인하십시오. Brain을 선택한 다음 reconstruct를 선택합니다. 이는 또 다른 시점의 작업으로, 사용 중인 컴퓨팅 시스템에 따라 어느 정도 시간이 소요될 수 있습니다.완료되면 지형도(topographic map)에 신호가 표시됩니다. 그런 다음 3D tools를 클릭하고 registration, organ atlas를 거쳐 female dorsal orientation을 클릭하십시오. 그 후 장기의 투명도를 조절하여 더 잘 보이게 할 수 있으며, linear fit을 클릭하여 지형도를 디지털 장기 세트에 맞춥니다.초음파 뇌 신호를 실제로 식별하고자 하는 장기를 제외한 모든 장기를 제거할 수 있습니다. 이 기술을 통해 3차원 비디오를 생성할 수 있으며, 이를 통해 회전, 투명도 조절, 보기 변경, 확대, 장기 제거 및 최종적으로 축소가 가능합니다. 영상 촬영이 완료되면 ISO fluorine 기화기를 끄고 XI C3 밀폐 박스를 분리하십시오.밀봉된 상자를 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 다시 옮기고 전기 테이프에서 마우스를 조심스럽게 제거합니다. 영상 촬영 시간이 길어지는 경우, ABS L two 내에서 적절히 장갑을 낀 손으로 핸들링하여 마우스의 체온을 유지할 수 있습니다.마취에서 완전히 회복되었는지 확인하기 위해 동물을 면밀히 관찰합니다. 이 프로젝트에 기여해주신 Pessler 박사님과 실험실의 모든 분께 감사드립니다. 또한 시설과 장비를 제공해주신 Galveston National Laboratory와 본 연구의 연구비를 지원해주신 Institute for Translational Sciences에 감사드립니다.

in-vivo-imaging-systems-ivis-detection-neuro-invasive-encephalitic

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

nanoparticles의 세포 biodistribution을 평가하는 데 사용 Bioimaging 방법은 nanoformulated 화합물의 치료 및 진단 모니터링에 적용할 수 있습니다. histological coregistration에 의해 평가하면 여기에 설명된 방법은 민감하고 구체적인 수 있습니다. 방법은 설치류에서 인간의 응용 프로그램에 translational 경로를 제공합니다.

진단 및 치료 모니터링을위한 Nanomaterials 등록 Bioimaging

신생아 인간의 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV) 감염은 정신 지체의 중요한 원인을 나타내는, 아직 바이러스에 의한 발병으로 이어지는 분자 이벤트가 여전히 제대로 이해하고 있습니다. 뇌 감염의 역학을 조사하기 위해, 우리는 전체 - 동물의...

사용<em&gt; 생체 내</em&gt; 이미징 신생아의 실험 쥐 거대 세포 바이러스 감염의 진행 상황을 모니터링 할 수

여기서 우리는 신생아 마우스 뇌에 아데노 관련 바이러스를 뇌실 내 주입하여 광범위한 신경 세포 전달을 위한 기술을 보여줍니다.  이 방법은 바이러스로 전달된 transgenes의 평생 발현을 달성하는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

여기에서는 바이러스 입자 또는 형광 마이크로비즈를 신생아 쥐의 뇌에 뇌내실 및 혈관 내 주입하는 간단한 방법을 설명합니다. 바이러스와 나노 입자의 국소화 패턴은 현미경 평가 또는 현장 혼성화에 의해 검출될 수 있습니다.

신생아 뇌에 바이러스 성 입자와 형광 마이크로 비즈의 뇌실과 혈관 내 주입

우리는 실험용 뇌 말라리아의 마우스 모델을 설명하고 자기 공명 영상을 사용하여 생체 내에서 염증 및 미세 혈관 병리학을 추적할 수 있는 방법을 보여줍니다.

자기 공명 영상을 이용한 실험용 뇌 말라리아 모델에서의 부종 발달 및 미세 혈관 병리학 적 추적

여기에서, 우리는 신경병의 발달을 표시하기 위하여 중추 신경계 감염의 면역적격 ICR (암 연구 연구소) 뮤린 모형을 만들기위한 프로토콜을 제시합니다. 동일한 질병 점수에 의한 급성 바이러스 성 뇌질환 모니터링은 생체 내에서 뎅기열 바이러스 유발 신경병증을 나타내는 데 수행될 수 있었다.

뎅기열 바이러스 유발 급성 바이러스 뇌염 같은 질병의 뮤린 모델

여기, 선물이 vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 혈관 단위의 장애를 조사 하는 프로토콜. 우리는 특별히 명과 limitans에서 혈액-뇌 장벽 침투성 및 백혈구 마이그레이션에 관련 된 gelatinase 활동을 확인 하는 방법 주소.

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

용매 정리 된 장기의 궁극적 인 3D 이미징과 같은 새로운 면역 염색 호환 조직 지우기 기술은 광견병 바이러스 뇌 감염및 복잡한 세포 환경의 3D 시각화를 허용합니다. 두꺼운 항체 표지 된 뇌 조직 조각은 이미징 깊이를 높이고 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 3D 분석을 가능하게하기 위해 광학적으로 투명하게 만들어집니다.

용매 클리어 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 고해상도 3D 이미징

이 프로토콜은 생체 내에서 직접 다시 프로그래밍 된 인터뉴런을 생성하는 것을 목표로, 뇌의 AAV 기반 바이러스 시스템과 생체 내에서 세포 식별 및 추가 분석을 허용하는 FLEX 시냅신 구동 GFP 리포터를 사용하여.

바이러스 벡터의 intracerebral 주입에 의해 인터뉴런으로 상주 신경교 세포의 생체 내 직접 재프로그래밍

Miniscope in vivo 칼슘 이미징은 자유롭게 행동하는 마우스에서 신경 역학과 미세 회로를 연구하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 미니 스코프를 사용하여 좋은 생체 내 칼슘 이미징을 달성하기 위해 뇌 수술을 수행하는 것을 설명합니다.

입체 택시 바이러스 주입 및 생체 내 심부 뇌를위한 그라디언트 인덱스 렌즈 이식

우리는 마우스 모델에서 형광 표지된 산화철 나노입자를 교모세포종에 전달하는 종양 전달에 대한 이광자 현미경에 대한 새로운 접근 방식을 제시합니다.

쥐 모델에서 교모세포종의 Two-Photon Intravital Microscopy

학습하세요 중추신경계 바이러스 감염을 생체 발광 기술과 IVIS로 실시간 시각화하는 방법을. TC 83 백신주와 루시퍼라제 유전자를 활용하여 바이러스 복제를 추적하고 백신 및 항바이러스제 효능을 평가합니다.

신경 침윤성 Encephalitic 바이러스의 생체 이미징 시스템 (IVIS) 검색에서

더 많은 동영상 탐색