Name: 개인 신장 세포 암에서 단백질 표현 변화를 탐험하기 위해 역 위상 단백질 배열 (RPPA)의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 배우세요 역 위상 단백질 배열(RPPA)을 활용하여 신장 세포 암에서 단백질 발현 변화를 분석하는 방법입니다. 이 기술은 종양 내 이질성을 연구하고 치료 반응 관련 바이오마커를 식별하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ETM37 및 암 연구 영국의 실험 암 의학 센터에서 지원 : 최고 과학자 사무실, 교부금 번호의 지원을 받고 있습니다 위에 작성자 FCO, DF, JN, DJH와 GDS의 작품은 멘션했습니다. AL의 작품은 에딘버러 (Edinburgh) 로버슨 신뢰, 관리 및 암과 의학 연구위원회의 치료를위한 멜빌 신뢰의 외과의 로얄 대학의 지원을 받고 있습니다. IO는 마리 퀴리 작업과 영국 의학 연구위원회 cofunded 에딘버러 (Edinburgh) 스코틀랜드 정부 활동의 로얄 학회에 의해 지원됩니다. 저자는이 문서에서 설명하는 주제의 일부에서의 유용한 토론을 SCOTRRCC 공동 신청자 및 공동 작업자 감사드립니다.

1. 형태학 및 분자 종양 이질성의 확인 <ol><li> 종양 -80 ° C의 냉동고에서 제거 드라이 아이스에 보관. </li><li> 약 1cm 3 부분으로 종양을 나눈다. 각 종양 서로에 대해 섹션을 고유 한 이름으로 라벨의 원래 위치를 매핑합니다. 스토어 샘플 -80에서 개인 cryovials에서 ° C 사용할 준비가 될 때까지. </li><li> 코트 샘플 10월 및 -22 ° C.에 그라 이오 스탯에 절단 </li><li> 샘플 Hematoxylin과 Eosin의 counterstaining 방법을 사용하여 얼룩이. </li><li> 냉동 섹션의 현미경 분석들이 ccRCC 자연, 가능한 종양 및 등급 (냉동 섹션에 Fuhrman 등급 1을 4 대 차별화 할 도전 낮은 등급 높은 등급 또는 혼합 고 / 저 등급)에 대한의을 보장합니다. 그림 1 A &amp; B (H &amp; E 염색 높은 낮은 혼합 학년). </li><li> 단백질 추출 각 종양 내의 각 morphologically 서로 다른 지역에서 4 샘플까지 선택합니다. </li></ol> 2. 종양 샘플에서 단백질 추출 <ol><li> 10월에서 종양 샘플을 잘라 버릴거야. </li><li> 용해 버퍼 990 μl 수있는 2 ML 튜브에 조직의 장 50-75 MG [50 MM 트리스 - HCL (산도 7.5), 5 MM EGTA (산도 8.5), 150 MM NaCl] aprotinin (시그마 A6279) (10 밀리그램과 보충 / ML), 인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일 2 (시그마, P5716), 인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일 3 (시그마, P0044)와 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈, 11836153001). </li><li> 각 튜브에 하나 5mm의 스틸 볼을 추가하고 두 번 각 5 분 기간이 지나면 TissueLyser를 사용하여 균질화의 수준을 확인 5 분을 위해 50Hz에서 균질화. </li><li> 뒤에 강철 공을두고 피펫을 사용하여 새 2 ML 튜브에 균질 샘플을 전송합니다. </li><li> 4 ° C.에서 30 분 동안 13,000 XG에서 centrifuging 전에 각 샘플에 트리톤 X-100의 10 μl를 추가합니다 </li><li> 신선한 microcentrifuge 튜브에 supernatants를 전송합니다. </li><li> BCA 분석을 (그림 2)를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다. </li><li>1 MG / ML에서 단백질 농도를 정상화. </li></ol> 3. 항체 확인 <ol><li> 서부 얼룩에 대한 단백질 샘플을 (적절한 셀 라인 또는 조직에서 추출) 준비하고 10 % SDS-PAGE 젤에서 실행됩니다. </li><li> 4에서 하룻밤 니트로 셀룰로스 막에 샘플을 전송 ° C. </li><li> 상온에서 1 시간에 리튬 오호 오디세이 차단 버퍼 (PBS에서 50:50에 희석)에 멤브레인을 차단합니다. </li><li> 제조업체에서 리튬 오호 오디세이 차단 버퍼의 기본 항체를 (PBS에서 50:50에 희석) 희석 희석 1,000에 일반적으로 1 권장합니다. </li><li> 4 ° C.에서 밤새 차 항체의 멤브레인을 품다 </li><li> 0.1 % PBS-Tween20 (, 1 ML Tween20 / 1L PBS PBS-T)를 구성합니다. </li><li> 5 분 (X3)에 대한 실온에서 PBS-T의 멤브레인을 씻으십시오. </li><li> 오디세이 차단 버퍼 (PBS에서 50:50에 희석) 0.01 % 1:10,000 희석에서 SDS (1.5 μl/15 ML)에 차 항체를 휘황 라벨이 표시된 희석. </li><li> 차의 멤브레인을 품다부드러운 진동과 45 분 동안 실온에서 항체 - 그것이 마지막 스캔 작업이 완료되었으며, 같은 시간까지 빛으로부터 멤브레인을 보호하는 것이 중요합니다. </li><li> 어둠 속에서 막을 유지 5 분 (X3), 동안 실온에서 PBS-T의 멤브레인을 씻으십시오. </li><li> 다시 어둠 속에서 막을 유지 잔여 Tween20을 제거하는 5 분 (X3), 동안 실온에서 PBS의 멤브레인을 씻으십시오. </li><li> 어둠 속에서 필터 종이에 평면 멤브레인을 누워 건조한 공기 할 수 있도록 - 건조 할 수있는 멤브레인의 신호를 향상시키고 배경을 줄일 수 있지만, 벗겨하고 다시 프로빙하기에 쓸모 렌더링 할 수 있도록합니다. </li><li> LiCor 오디세이 스캐너에 멤브레인을 검사합니다. 이 스캔되어 같은 시간까지 어둠 속에서 막세요. </li><li> 만 정확한 분자량의 하나의 지배적 인 밴드를 생성 항체을 선택합니다. 그림 3은 RPPA와 함께 사용하기위한 허용 및 허용되지 않는 항체의 예를 보여줍니다. </li></ol> 4. RPPA PRInting <ol><li> 단백질 lysates는 MicroGrid II 로봇 반점을 찍는를 사용하여 니트로 셀룰로스 - 코팅 유리 슬라이드 (Fastslides-워트 먼지)에 발견되었다. 사용 슬라이드 샘플이 발견 된에이 패드가 포함되어 있습니다. 각 패드는이 경우 100 샘플에 동일한 샘플 발견되었습니다. 다른 사용 가능한 형식은 1, 8 및 16 패드 슬라이드가 포함되어 있습니다. 패드의 높은 번호를 작은 각에 발견 할 수 있습니다 샘플의 수입니다. </li><li> 오 2 배 dilutions 일련의 각 샘플에서 만든 각 그 다음 (샘플 당 15 곳의 총의 결과) 세중의에 발견되었다. </li></ol> 5. RPPA 단백질 감지 <ol><li> 초과 LiCor 차단 버퍼에 젖은 슬라이드 (PBS에서 50:50에 희석). 흔들 플랫폼에서 1 시간에 RT를 품다. </li><li> 원하는 농도에 LiCor 차단 버퍼 (PBS에서 50:50에 희석)에 차 항체 800 μl를 준비하고 얼음 계속. </li><li> 중은 (i) 단일 프레임 칩 클립에서 슬라이드를 마운트또는 (ii) &#39;FastFrame의 4 베이 슬라이드 홀더 그래서 시일이 슬라이드 및 배양 챔버 사이에 형성되는. </li><li> 우물에서 잔류 버퍼를 제거하고 각각의 우물에 600 μl 차 항체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 4에 밤새 플랫폼을 흔들에 봉인 된 서부 유럽 표준시 상자 및 배양에 슬라이드와 챔버를 배치 ° C. </li><li> 0.1 % PBS-Tween20 (; 100 μl 십대 초반 1백분의 20 ML PBS PBS-T)를 구성합니다. </li><li> 추운 방에서 슬라이드를 제거하고 신중하게 각 우물에서 차 항체를 제거합니다. </li><li> PBS-T 600 μl를 추가하고 5 분 (X3)에 대한 RT에서 플랫폼을 흔들에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 오디세이 차단 버퍼 (PBS에서 50:50에 희석) 0.01 % 첫 번째 인스턴스에서 1:2,000 희석 (1 μl / 2 ML)에서 SDS에 diluting하여 휘황 - 라벨 차 항체를 준비합니다. </li><li> 우물에서 버퍼를 제거하고 각각의 우물에 600 μl 휘황 - 라벨 차 항체를 추가합니다. 부드러운 진동과 45 분 동안 실온에서 보조 항체를 배양 -가이 마지막 스캔 작업이 완료되었으며, 같은 시간까지 빛으로부터 멤브레인을 보호하는 것이 중요합니다. </li><li> 상온에서 600 μl PBS-T에서 잘하고 간단히 세척 (X3)에서 차 항체를 제거합니다. 통신사에서 슬라이드를 제거 적당한 용기에 전송하고 어둠 속에서 막을 유지, 15 분에 대한 초과 PBS-T에 씻는다. </li><li> 다시 어둠 속에서 막을 유지, 잔여 십대 초반-20을 제거하는 PBS-T 및 15 분 동안 실온에서 PBS에 대한 추가 세탁 막을 제거합니다. </li><li> 10 분 50 ° C의 오븐에 Fastslide 건조 후 리튬 오호 오디세이 스캐너에 스캔합니다. 이 스캔 될 때까지 어둠 속에서 슬라이드세요. </li><li> 보조 항체 / 사용 항체에 따라 680 nm의 및 / 또는 800 nm의에서 슬라이드를 스캔합니다. 2 색 검출을 위해 항상 교차 반응성을 최소화하기 위해 매우 간 adsorbed 차 항체를 사용합니다. 기본 및 보조 항체에주의 선택은 2 색을 감지하기 위해 필요합니다. 주요 중요성의 선택은두 가지 기본 항체에 대해 다른 호스트 종 (예를 들면 토끼 및 마우스). 이 쉽게 구별 방출 스펙트럼과 염색으로 분류됩니다 항 토끼 반 마우스 보조 항체에 의한 차별 할 수 있습니다. </li><li> 이미지 파일은. tiff 파일로 저장됩니다. 그림 4는 (스캔 파일의 이미지). </li></ol> 6. 데이터 분석 <ol><li> MicroVigene 소프트웨어 (VigeneTech, 칼라일, MA, USA)를 실행합니다. </li><li> 엽니 다. RPPA 슬라이드의 검사를 포함하는 TIFF 이미지 파일을. </li><li> RPPA 슬라이드의 이미지에 오버레이 할 수있는 그리드를해야합니다 미리 정의 된 템플릿 파일을 선택합니다. </li><li> 클릭하여 그리드를 표시, 관심 (ROI) 버튼의 영역을 정의합니다. </li><li> RPPA 장소를 통해 그리드를 배치합니다. 그림 6A (이미지 이상의 격자의 이미지). </li><li> 모든 투자 수익 (ROI)을 강조하기 위해 모두 선택 버튼을 클릭합니다. </li><li> 모두 찾기를 클릭합니다. MicroVigene이 autom합니다atically 투자 수익 (ROI)을 찾아, 관광 명소를 찾아 배경을 빼야 모든 먼지를 제거하고 장소를 정할. </li><li> RPPA 슬라이드에있는 모든 샘플에 대한 결과를 가져보기 희석 곡선 버튼을 클릭합니다. </li><li> 희석 데이터 저장을 클릭합니다. </li><li> 각 샘플은 5 희석 포인트에서 인쇄되기 때문에 세중의에서 각 분석 15 점, 오류의 위험을 줄이고 커브 피팅의 품질을 향상 있습니다. MicroVigene는 항원 - 항체 결합 반응 속도론의 sigmoid 곡선을 생산하기위한 모든 부분을 포함 4 매개 변수 물류 - 로그 모델 &quot;Supercurve&quot;알고리즘 (그림 6B)를 생산하고 있습니다. 가정은 동일한 항체 - 항원 바인딩 속도론는 일반적인 응답 곡선에 맞게 배열에있는 모든 장소를 활용하여 따라서도 다른 샘플에 각각의 샘플 지점에 자리를하고있다하면 곡선 피팅 10,11의 신뢰를 높일 수 있다는 것입니다 Y = + ((BA) / (1 + E (C * D-솔직히 (X))) x는 dilutio입니다N 요소와 Y는 신호 강도입니다. 샘플은 비교적 분석에 supercurve로 사람들을 매핑 한 후 x 값의 중간 지점에있는 Y 값에 대응 y0 값을 사용하여 분석 할 수 있습니다. </li><li> 그림 7에서와 같이 Microsoft Excel 및 플롯 y0의 데이터를 내 보냅니다. </li><li> Intratumoral 단백질 차이는 ANOVA 프레임 워크의 치료 및 처리 치료 환자에 대해 개별적으로 계산되었습니다. 모든 분석 단백질의 데이터를 결합 분산 배포판은 맨 - 휘트니 시험 (MWT)로 비교했다. 잘못된 검색 속도 (루즈 벨트)이 수정은 12 적용, 각각의 단백질에 대한 Intratumoral 차이는 정상 상태와 homoscedasticity의 가정이 Lillefours 및 Fligner 테스트를 사용하여 각각 평가 개최 F-테스트에 비교했다. 치료 및 처리 환자 샘플 사이의 차동 단백질 표현식은 학생의 t-테스트를​​ 사용하여 각 단백질에 대한 테스트 된 곳 정상 상태 및 homoscedasticity 가정S는 달리 MWT이 수행되었습니다 충족 된, 루즈 벨트는 결합 t-테스트 및 MWT 값을 12으로 적용되었습니다. 단백질에 대한 단백질 표현과 분산 피어슨 상관의 의의는 표준 접근 방식을 사용하여 추정 된 [R 참조]와 루즈 벨트는 12을 적용했습니다. </li></ol>

<ol><li>Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+molecular+pathology+contribute+to+the+management+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma.</a> Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).</li>
<li>Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+and+biomarker+analysis+of+sunitinib+in+patients+with+bevacizumab-refractory+metastatic+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma.</a> J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).</li>
<li>Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+biomarker+discovery+through+the+parallel+integration+of+clinical+trial+and+functional+genomics+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets.</a> Genome Med. 2, 52(2010).</li>
<li>Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+in+chronic+myeloid+leukemia+after+sequential+treatment+with+multiple+tyrosine+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors.</a> Blood. 110, 4005-4011 (2007).</li>
<li>Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).</li>
<li>Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter+and+intratumour+heterogeneity%3A+a+barrier+to+individualized+medical+therapy+in+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma.</a> Front. Oncol. 2, 49(2012).</li>
<li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li>
<li>O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+automated+quantitative+analysis+to+evaluate+epithelial-to-mesenchymal+transition+associated+proteins+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma.</a> PLoS One. 7, e31557(2012).</li>
<li>Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-phase+protein+lysate+microarrays+for+cell+signaling+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis.</a> Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).</li>
<li>Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-parametric+quantification+of+protein+lysate+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Non-parametric quantification of protein lysate arrays.</a> Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).</li>
<li>Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+protein+arrays+for+quantitative+systems+analysis+of+the+dynamics+of+signaling+pathway+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions.</a> Proteome Sci. 9, 53(2011).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+False+Discovery+Rate%3A+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 제시된 RPPA 방법은 단백질 분석의 널리 사용하지만 비교적 낮은 처리량 서부 얼룩 기술에 대한 높은 처리량 대안을 나타냅니다. 방법은 샘플 수백 분석 동시에 셀 라인과 조직 샘플의 다양한 선택의 주요 단백질의 직접 비교할 수 비교 반 정량적으로 할 수 있습니다. 다른 항체 종과 멀티플렉싱은 더 여러 항체를 동시에 사용할 수 있도록 기술의 힘을 증가시킵니다. 여기에 제시된 예는 종양 이질성과 이질성에 타겟팅 된 치료의 효과의 연구에서 RPPA의 능력을 보여줍니다. 기술로 RPPA는 항체 선택 답있는 중요한 단계 수 있습니다. 기술의 항체 특이성의 점 얼룩 특성으로 인해이 분석 기간 동안 확인 할 수 있으며 사용하기 전에 ascertained 수 있어야합니다. 현재 연구에서 83 항체이 유효만 58 (~ 30 %의 비율을 실패) 전달 중 서부 blots에 ated. RPPA (95 %의 성공률)에서 분석합니다. 다른 중요한 단계가 RPPA에 샘플을 발견 할 수있는 농도의...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> aprotinin </td><td> 시그마 </td><td> A6279 </td></tr><tr><td> 인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일 2 </td><td> 시그마 </td><td> P5726 </td></tr><tr><td> 인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일 3 </td><td> 시그마 </td><td> P0044 </td></tr><tr><td> 프로테아제 억제제 칵테일 </td><td> 로슈 </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 트리톤-X </td><td> T8787 </td></tr><tr><td> 리튬 오호 오디세이는 버퍼 차단 </td><td> 리튬 오호 </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> TissueLyser </td><td> Qiagen </td><td> 85,600 </td></tr><tr><td> MicroGrid II 로봇 감적 </td><td> Biorobotics </td><td></td></tr><tr><td> FastFrame의 4 베이 슬라이드 홀더 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 10486001 </td></tr><tr><td> FAST 슬라이드 - 2 패드 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 10485317 </td></tr><tr><td> IRDye 680LT 염소 안티 - 마우스 IgG </td><td> Licor </td><td> 926-68020 </td></tr><tr><td> IRDye 800CW 염소 안티 - 토끼 IgG </td><td> Licor </td><td> 926-32211 </td></tr></tbody></table>

개인 신장 세포 암에서 단백질 표현 변화를 탐험하기 위해 역 위상 단백질 배열 (rppa)의 사용

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

현재 전이성 투명 세포 신장 세포 암에 대한 치료 치료, 질병의 commonest 변형이 없습니다. 이 치료 저항에 핵심 요소가 질병 (1)의 분자 복잡한 것으로 생각됩니다. 같은 티로신 키나제 억제제 (TKI) sunitinib의 타겟 치료가 사용되어 왔지만, 환자의 단지 40 % 1 년 2 안에 원래대로 돌아가는 이들 환자의 절대 다수와 함께 응답합니다. 신장 세포 암 환자에 고유 및 취득 저항 등의 질문은 3 관련성이 있습니다. 효과적인 맞춤 치료를 개발의 궁극적 인 목표로, TKIs에 저항을 연구하기 위해, 대상 치료의 특정 기간 이후 순차 조직은, 만성 골수 양 백혈병 (4)에 성공적으로 입증 한 접근 방식을 필요합니다. 그러나 신장 세포 암종 이러한 전략의 응용 프로그램은 B의 높은 수준에 의해 복잡신장 세포 암종 5,6뿐만 아니라 다른 고체 종양 7의 기능입니다 oth 간 및 intratumoral 이질성. transcriptomic와 유전자의 차이로 인해 Intertumoral 이질성은 잘도 유사한 프리젠 테이션, 무대와 종양의 등급 환자에 설립되어 있습니다. 또한이 더욱 분자 이질성을 대표 할 가능성이 RCC에 큰 형태학 (intratumoral) 이질성이 있다는 것을 분명하다. 통합 형태학의 분석 및 Fuhrman 등급의 RCC 종양에 대한 상세한 매핑 및 분류는 proteomic 분석을위한 대표 지역의 선택을 할 수 있습니다. RCC 8 단백질 기반의 분석으로 인해 병리 실험실에서의 광범위한 상황에 매력적입니다하지만, 그 응용 프로그램은 특정 항체 9의 제한된 가용성으로 인해 문제가 발생할 수 있습니다. 역 위상 단백질 배열의 점 얼룩 자연 (RPPA), 항체 특이성은 반드시 B로 인해전자 사전은 - 확인, 사용 항체의 이러한 엄격한 품질 관리로 최고의 중요성입니다. 이러한 제한에도 불구하고 점 얼룩 형식은 하나의 니트로 셀룰로스 슬라이드로 샘플 수백 인쇄 수 있도록 검정 소형화을 허용하지 않습니다. 인쇄 슬라이드 그런 다음 멀티플렉싱을 허용, 대상 특정 기본 항체와 휘황 분류 이차 항체를 이용하여 서양 분석과 유사한 방식으로 분석 할 수 있습니다. 슬라이드에있는 모든 샘플에서 차동 단백질 표현식은 다음보다 비용 효율적이고 높은 처리량 방식으로 형광의 상대적 수준을 비교하여 동시에 분석 할 수 있습니다.

스캔 RPPA 슬라이드의 예는 680과 800 nm의 표시 채널을 모두 그림 4은 (i)에서 볼 수 있습니다. 파장, 그림 4 (II)에 의해 이미지를 분리하면 분석 할 RPPA 슬라이드와 그림 4 (III)를 결정 개별 단백질의 발현에 각 패드를 할 수 있습니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 (iii) 본 샘플에서 개별 단백질의 표현은 Gelsolin이 훨씬 낮은 단백질 표현이 cMYC에 비해 슬라이드에 걸쳐 표현의 높은 수준을 가지는 독특한이지만, 여전히 보편적 모든 샘플에서 표현 테스트. 반면 CD10는 특정 샘플이 거의 또는 전혀 표현이 감지하지 다른 샘플에도 불구하고 표현의 높은 수준을 제공과 함께, 다양한 표현했다. 마지막으로 pJAK2 배경 해발 모든 감지 단백질 식을 생산에 실패했습니다. 품질 관리의 관점에서 pJAK2의 결과는 분들 반면 용납 할 수없는 것CD10...

RPPA이 휘황이라는 항체를 사용하여 동시에 심문을 할 수 니트로 셀룰로스 슬라이드에 인쇄 샘플 수백의 단백질 표현을 할 수 있습니다. 이 기술은 투명 세포 신장 암에서 약물 치료 이질성의 효과를 연구에 적용되었습니다.

개인 신장 세포 암에서 단백질 표현 변화를 탐험하기 위해 역 위상 단백질 배열 (RPPA)의 사용

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

이 절차의 목적은 역상 단백질 어레이 또는 RPPA를 사용하여 신세포암의 단백질체 발현 변이를 연구하는 것입니다. 이는 먼저 개별 종양의 이질적인 영역을 매핑하고 선택함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 샘플에서 단백질을 추출하는 것입니다.다음으로, 단백질을 정규화하고 RPPA 슬라이드에 인쇄합니다. 마지막 단계는 관심 단백질에 대한 항체를 사용하여 슬라이드를 분석하는 것입니다. 궁극적으로 RPPA는 신세포암의 두 치료 그룹에서 차등 단백질체 발현 변화를 보여주는 데 사용됩니다.이 방법은 신세포암 분야의 몇 가지 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 훌륭한 단백질에는 이질성이 존재합니다. 이 기술의 함의는 표적 요법으로 치료받는 신세포암 환자의 치료에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다는 것입니다.이는 조직 샘플에서 치료 전후 이질성을 모두 조사할 수 있기 때문에 이러한 치료에 대한 후천적 내성이 발생하는 환자를 위한 새로운 약물 투여 가능한 표적을 식별할 수 있기를 희망하기 때문입니다. 저온 유지 장치와 H 무릎 시술을 시연하는 것은 연구실 관리자인 Helen Caldwell이 맡을 것이며, 단백질 추출 기술을 시연하는 것은 우리 그룹의 연구 기술자인 Jo Nanda가 될 것입니다. OR PPA 인쇄를 시연하는 것은 St.Andrews의 동료인 Peter Mullen이 맡을 것입니다.이 절차를 시작하려면 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 종양을 제거하고 드라이아이스를 보관하십시오. 종양을 약 1cm 세제곱의 절편으로 나눕니다. 각 종양 절편의 원래 위치를 서로에 대해 매핑하고 고유한 이름으로 레이블을 지정합니다.OCT에서 샘플을 코팅하고 샘플을 염색한 후 섭씨 영하 22도의 저온 온도에서 자릅니다. hemat, toin 및 DSN 카운터 염색 방법을 사용하여 현미경으로 동결 단면을 분석합니다. 절편이 투명세포 신세포암의 생존 가능한 종양인지 확인하고 높은 등급, 낮은 등급 또는 낮은 등급과 높은 등급이 혼합된 등급으로 등급을 매깁니다.단백질 추출을 위해 각 종양 내에서 형태학적으로 다른 각 영역에서 최대 4개의 샘플을 선택하며, 이는 종양 샘플에서 단백질을 추출하기 위해 다음에 시연될 것입니다. 50-75mg의 티슈를 놓습니다. CT에서 2밀리리터 튜브로 자릅니다.990마이크로리터의 용해 완충액을 첨가하고 인산가수분해효소 및 프로테아제 억제제의 단백질을 보충합니다. 각 튜브에 단일 5mm 스틸 볼을 추가하고 50Hz에서 5분 동안 균질화합니다. 조직 레이저를 사용합니다.균질화 수준을 확인한 다음 5분 더 균질화합니다. 피펫을 사용하여 균질화된 표본을 새로운 2 밀리리터 관으로 옮기고, 각 표본에 Triton X 100의 10 마이크로리터 뒤에 강철 공을 남겨두고, 그 후에 13, 4 섭씨 온도에 30 분 동안 G 000 시간에 원심분리. S 상층액을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 BCA 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.PPA 프린팅 전에 단백질 농도를 밀리리터당 1밀리그램으로 정규화했습니다. 각 샘플에서 일련의 5가지 2중 희석이 이루어집니다. 이 절차에서 가장 시간이 많이 소요되는 측면 중 하나는 슬라이드를 인쇄하기 전에 다시 확인하여 수백 번의 희석을 성공적으로 수행하는 것입니다.그런 다음 마이크로그리드 2개의 로봇 스포터를 사용하여 니트로셀룰로오스 코팅된 유리 슬라이드에 있는 단백질 용해물을 찾아냅니다. 각 샘플은 세 번씩 발견되어 샘플당 총 15개의 spot이 나타납니다. 이 실험에 사용된 슬라이드에는 샘플이 발견되는 두 개의 패드가 포함되어 있습니다.각 패드에는 동일한 샘플이 발견되었으며, 이 경우 100개의 샘플이 발견되었습니다. 사용 가능한 다른 형식으로는 1개의 8개 및 16개의 패드 슬라이드가 있습니다. 패드 수가 많을수록 각각에 있을 수 있는 샘플의 수가 줄어듭니다.단백질 검출 절차를 시작하려면 습식 슬라이드, 초과 차단 버퍼를 사용하고 실온을 흔들 플랫폼에서 1시간 동안 배양하고 원하는 농도의 차단 버퍼에 800마이크로리터의 1차 항체를 준비하고 얼음 위에 보관합니다. 1 시간 배양 후. 버퍼를 차단할 때는 단일 프레임 칩 클립 또는 빠른 프레임 4개의 베이스 슬라이드 홀더에 슬라이드를 장착하여 슬라이드와 배양 챔버 사이에 단단한 밀봉이 형성되도록 합니다.웰에서 잔류 완충액을 제거하고 각 웰에 600마이크로리터의 1차 항체를 추가합니다. 슬라이드와 챔버를 밀봉된 습식 상자에 넣고 다음 날 아침 섭씨 4도의 흔들리는 플랫폼에서 밤새 배양합니다. 냉장실에서 슬라이드를 제거합니다.각각에서 기본 항체를 조심스럽게 제거합니다. 20 또는 PBST 사이에 0.1%PBS의 600 마이크로 방출을 추가하고 실온의 흔들 플랫폼에서 5분 동안 슬라이드를 세척합니다. 이런 식으로 PBST를 새 PBST로 교체합니다.슬라이드를 총 세 번 세척합니다. 웰에서 완충액을 제거하고 600마이크로리터의 형광 표지된 2차 항체를 적절한 희석액으로 각 웰에 추가합니다. 2차 항체를 실온에서 45분 동안 부드럽게 흔들어 배양하면 스캔할 때까지 멤브레인을 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다.45분 후 웰에서 2차 항체를 제거하고 실온에서 600마이크로리터 PBST로 짧게 3회 세척합니다. 캐리어에서 슬라이드를 제거하고 적절한 용기로 옮긴 다음 15분 동안 과도한 PBST를 세탁합니다. 멤브레인을 어두운 곳에 유지합니다.PBST를 제거하고 실온에서 15분 동안 PBS로 멤브레인을 세척하여 잔여 트윈 20을 다시 제거하여 멤브레인을 어두운 곳에 유지합니다. 섭씨 50도의 오븐에서 10분 동안 빠른 슬라이드를 시도해 보세요. 마지막으로, 사용된 2차 항체에 따라 슬라이드를 680나노미터 또는 800나노미터로 스캔합니다.슬라이드를 스캔할 때까지 슬라이드를 어두운 곳에 두십시오. 이미지를 T 파일로 저장합니다. 스캔된 RPPA 슬라이드의 예는 680 및 800 나노미터 채널이 모두 표시된 이 그림에서 볼 수 있습니다.파장별로 이미지를 분리하면 RPPA 슬라이드의 각 패드를 분석하고 여기에 표시된 대로 개별 단백질 발현을 결정할 수 있습니다. 샘플 전반에 걸친 개별 단백질의 발현은 단백질 발현이 훨씬 낮지만 테스트된 모든 샘플에서 여전히 보편적으로 발현되는 cmic에 비해 슬라이드 전반에 걸쳐 높은 수준의 발현을 갖는 gel soin으로 독특합니다. 대조적으로, CD 10은 검출 가능한 발현이 거의 또는 전혀 없는 다른 샘플에도 불구하고 높은 수준의 발현을 제공하는 특정 샘플로 다양한 발현을 제공했습니다.마지막으로, p JK 2는 백그라운드 수준 이상에서 검출 가능한 단백질 발현을 생성하지 못했습니다. 다음 그림은 2차 항체와 다른 종의 1차 항체 사이에 교차 반응이 없음을 강조합니다. 왼쪽 하단의 이미지는 680나노미터의 올바른 파장에서 스캔된 2차 항체를 사용하여 단백질 발현을 검출한 것을 보여줍니다.오른쪽 이미지에서는 단백질 발현이 검출되지 않았으며, 800나노미터의 잘못된 파장에서 스캔되었습니다. RPPA 슬라이드에 있는 모든 샘플의 비교 분석에 사용되는 수퍼 곡선의 예가 여기에 나와 있습니다. 녹색 점은 허용 가능한 지점을 나타내고 빨간색 점은 분석 소프트웨어에서 사전 정의된 한계를 기반으로 하는 이상값을 나타냅니다.슈퍼 곡선은 상대적인 단백질 기반 발현 데이터를 생성하는 데 사용됩니다. 이 그림은 3개의 RPPA 슬라이드에 걸쳐 대표 단백질 mlh 1의 발현 수준을 보여주며, RPPA가 처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플 간의 차이를 감지하는 방법을 강조합니다. 여기서 각 샘플은 종양 소영역에 해당합니다.이 다음 그림은 샘플이 처리에 따라 그룹화된 후 mlh 1에 대한 차등 단백질 발현을 보여줍니다. 치료 전과 치료 후 샘플 사이의 MLH 1 발현에서 종양 내 분산을 계산할 때 치료 전 그룹에서 더 높은 MLH 1 발현이 발견되었습니다. 처리에 따라 샘플을 그룹화한 후, 처리 후 샘플에서 더 높은 분산이 관찰되었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 단백질 이질성 연구에 PPA를 활용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

the-use-reverse-phase-protein-arrays-rppa-to-explore-protein

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 사전 microRNA의 설정 및 분석 서비스를 선보일 예정 써모 과학 매트릭스 멀티채널 피펫과 수작업으로뿐만 아니라 로봇을 사용하여 QPCR위한 96 잘 배열.

정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

이 동영상은 세포 용해물에서 단백질 발현 패턴을 연구하기 위해 역상 단백질 어레이(RPPA)를 수행하는 방법론을 보여줍니다. RPPA에서는 단백질 혼합물을 포함하는 용해물을 니트로셀룰로오스 슬라이드에 인쇄하고 관심 단백질을 형광 표지된 항체를 사용하여 분석합니다.

역상 단백질 어레이 기반 단백질 발현 분석: 세포 용해물에서 여러 단백질의 발현을 동시에 정량화하기 위한 절차

면역 적격 마우스에서 신 세포 암의 동소 모델의 구현은 연구자에게 동일한 동물의 신장 차 종양 및 폐 전이의 존재에 의해 정의 된 임상 관련 시스템을 제공한다. 이 시스템은 전임상 생체 내에서 다양한 트리트먼트를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

전임상 치료의 양적 및 종 방향 평가를위한 동계 마우스 모델 전이성의 신장 세포 암

이 원고는 실시간 PCR 방법을 사용 하 여 혈 청 또는 플라스마 DNA에서 복사 번호 유사 분석을 설명 합니다. 이 방법은 거세 저항 전립선 암 환자에서 약물 저항의 예측에 적합 하지만 그것은 또한 다른 질병에 대 한 정보 수 있습니다.

혈 청 및 혈장 복사 번호 검출 실시간 PCR를 사용 하 여

여기, 우리는 다양 한 세포 모델에서 신호 경로 변경을 식별 하기 위해 항 체 배열에 대 한 프로토콜을 제시. 마약/산소/초 violet 빛/방사선, 또는 overexpression/downregulation/녹아웃, 한 이러한 변경 사항을 다양 한 질병 모델에 대 한 중요 하 고 치료 효과가 있을 것입니다 또는 약물의 메커니즘을 확인할 수 있습니다. 여부를 나타낼 수 있습니다. 저항입니다.

항 체 배열에 의해 신호 변환 통로의 심문에 의해 Tyrosine Kinase 억제제에 평가

키나아제 억제제의 스크리닝을 위한 자가 조립된 인간 단백질 마이크로어레이의 생성을 위한 상세한 프로토콜이 제시된다.

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

전이성 맑은 세포 신장 세포 암은 철저한 전임상 조사를 위한 포괄적인 동물 모델이 없는 질병이다. 이 프로토콜은 질병에 대한 두 가지 새로운 동물 모델을 보여줍니다: 정형 이식 마우스 모델과 닭 융모난토막 모델, 둘 다 임상 사례를 닮은 폐 전이를 보여줍니다.

마우스 신장과 닭 융모알란투암 막에 설립된 전이성 맑은 세포 신장 세포 암종 모델 비교

여기에서는 미세생리학적 시스템에서 콜라겐 및 콜라겐-아가로스 매트릭스를 사용하여 3D 세포 배양을 구현하기 위한 지침을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜은 신장 근위세뇨관 및 신세포 암 스페로이드 공동 배양을 지원하여 생체 내 조건을 시뮬레이션하고 신장암 세포 상호 작용에 대한 고급 조사를 가능하게 합니다.

신장암 진행을 모델링하기 위한 건강한 신장과 종양 상피의 미세유체 공동 배양

질량 분석 기반 단백질체 데이터는 개방형 데이터베이스에서 사용할 수 있으며 무료 도구를 사용하여 액세스할 수 있습니다. 데이터베이스 검색 및 설명의 복잡성을 감안할 때 많은 생물학자들은 이러한 데이터 세트를 활용할 수 있는 지식이 부족합니다. 여기에서는 기본 단백질체 데이터 검색을 위한 무료 도구 사용에 대한 가이드를 제공합니다.

무료 계산 도구를 사용하여 질량 분석 기반 단백질체 데이터 탐색

국소 빈혈에 의한 급성 신장 손상에 대한 정확한 murine 모델 (아키)는 급성 신장 부상을 조사하고 가능한 신장 부상을 치료하는 치료 도구를 찾는 중요한 도구입니다. 걸려 체중이 시스템은 신장 혼잡을 유발하지 않고 즉각적이고 안정적​​인 신장 동맥 폐색 및 reperfusion위한 도구를 제공합니다.

절연 신장 동맥 폐색에 대한 한깅 - 무게 시스템의 사용

배우세요 역 위상 단백질 배열(RPPA)을 활용하여 신장 세포 암에서 단백질 발현 변화를 분석하는 방법입니다. 이 기술은 종양 내 이질성을 연구하고 치료 반응 관련 바이오마커를 식별하는 데 활용됩니다.

개인 신장 세포 암에서 단백질 표현 변화를 탐험하기 위해 역 위상 단백질 배열 (RPPA)의 사용

더 많은 동영상 탐색