Citrobacter rodentium 마우스 모델 : 감염성 대장염에 대한 공부 병원체 및 호스트 기부

이 절차의 전반적인 목표는 마우스에 그람 음성 미러링 병원균인 시트로박터 설치류를 감염시켜 대장염을 유발하여 위장관의 병원체 및 숙주 상호 작용을 연구할 수 있도록 하는 것입니다. 이것은 하룻밤 사이에 구원이 없는 문화인 첫 번째 접종을 통해 달성됩니다. 두 번째 단계에서 마우스는 하룻밤 접종물로 구강 위장에 감염됩니다.

다음으로, 감염 후 7일째에는 마지막 단계에서 맹장 결장과 내강 내용물을 수집합니다. 조직을 플레이트화하고, 박테리아 콜로니를 계수하고, 조직은 관심 숙주 단백질에 대한 면역염색을 합니다. 궁극적으로 병원체 부담, 장벽 기능, 조직학적 손상 및 숙주 반응의 변화는 면역조직화학을 통해 평가할 수 있습니다.

이 방법은 감염성 대장염에 대한 강력한 모델을 제공하여 숙주 병원체 상호 작용 및 면역 반응을 연구할 수 있지만 박테리아 감염이 대장암 위험에 미치는 영향을 조사하는 데에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인에서는 자연스럽게 마우스의 박테리아 감염으로 어려움을 겪을 것입니다. 먼저 멸균 접종 루프를 사용하여 얼어붙은 글리세롤 스톡에서 LB 전기도금으로 실행 가능한 C 회수

섭씨 37도에서 하룻밤 배양 후 접종 루프를 사용하여 LB 플레이트에서 3ml의 멸균 lb 육수로 콜로니를 옮깁니다. 다음으로, 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 200RPM의 벤치탑 배양 쉐이커에서 ERO Dunum 배양을 호기적으로 배양합니다. 다음날 아침, 접종된 파운드 육수가 흐린 것처럼 보일 것입니다.

박테리아 세포 배양액이 고르게 분포되도록 배양액을 부드럽게 교반한 다음 1ml 주사기에 육수를 넣고 위 배기 바늘에 부착합니다. 펨과 손가락으로 목과 등의 느슨한 피부를 단단히 잡고 gavage용 마우스를 선택합니다. 그런 다음 검지로 동물의 머리를 뒤로 당겨 동물의 머리를 고정시키고 식도를 곧게 펴서 삽입합니다.

마우스를 똑바로 세운 상태에서 위 간질 바늘의 전구 끝을 동물의 입 옆과 혀 위로 향하게 합니다. 동물의 입천장을 따라 바늘을 부드럽게 통과시키고 바늘을 식도로 전진시킵니다. 마지막으로 주사기를 사용하여 100마이크로리터의 세균 접종물을 천천히 주입한 다음 간침을 부드럽게 제거합니다.

쥐를 반납한 후 호흡 속도와 행동을 모니터링하고, 분석 당일 케이지를 보고, 방금 시연한 대로 쥐를 긁어낸 다음 갓 준비한 fitzy dextrin 150마이크로리터로 동물을 배싱합니다. 이때 케이지에서 음식을 빼내고, 배를 탄 후 4시간 후에 동물을 진정시킵니다. 마취된 동물로부터 가능한 한 많은 혈액을 채취하기 위해 심장 천자를 사용하십시오.

혈액을 3%산 시트레이트 포도당의 최종 농도에 첨가하여 마이크로 원심분리기 튜브에 넣어 응고를 억제합니다. 다음으로, 혈액 샘플을 1000 치즈와 섭씨 4도에서 12분 동안 회전시킵니다. 그런 다음 혈청을 수집하고 각 샘플의 100 마이크로 리터에서 PBS에서 1-10 및 1-100으로 듀트합니다.

이 두 가지에서 96 웰 플레이트로 희석합니다. 표준 곡선을 준비하려면 원래 밀리리터당 80밀리그램의 샘플 100마이크로리터를 희석합니다. Fitz Dextrin은 어두운 마이크로 원심 분리기 튜브에서 PBS의 마우스를 개비지하는 데 사용되었습니다.

그런 다음 표준 샘플을 96웰 플레이트에 3회씩 추가합니다. 그런 다음 형광계를 사용하여 각 샘플의 형광을 정량화하고 무균 기술을 사용하여 FXI 덱스트린 농도를 측정하려면 1ml의 멸균 PBS와 오토클레이브 금속 비드를 2밀리리터 원심분리기 튜브에 둥근 바닥으로 추가하여 이 단계를 시작합니다. 그런 다음 각 튜브의 무게를 잰다.

다음으로, 마우스에서 혈청과 결장을 제거한 후 결장에서 혈청을 분리하고 세로로 잘라냅니다. 집게로 발광 내용물을 수집하고 내용물을 PBS 튜브에 추가합니다. 후유증과 결장 조직을 별도의 튜브에 넣기 전에 멸균 PBS로 세척하십시오.

이제 조직 튜브의 무게를 측정하고 비드 비터를 사용하여 6분 동안 샘플을 균질화합니다. 30Hz에서 웰당 180마이크로리터의 멸균 PBS를 96웰 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 균질화된 각 샘플 20마이크로리터를 각 행의 첫 번째 웰에 추가하고 잘 혼합합니다.

이전의 각 웰에서 20마이크로리터를 첨가하여 샘플을 연속적으로 희석하여 첫 번째 웰에서 10에서 마이너스 1까지 10에서 마이너스 6까지 희석을 얻습니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 하룻밤 배양 후 각 샘플의 각 희석액 10마이크로리터를 바닥이 있는 정사각형 LB 플레이트에 세 번 플레이트합니다. 한 접시에 군체 형성 단위를 세십시오.

각 샘플에 대한 3배의 평균을 낸 다음 각 샘플이 계수된 희석량을 기록합니다. 평균 CFU에 50을 곱하고 샘플이 계수된 희석 계수를 곱하면 밀리리터당 CFU가 됩니다. 마지막으로, 조직 무게로 나누어 이전에 저장된 0.5cm 결장 및 세컴 단면의 하룻밤, 공식 및 고정 후 그램당 CFU를 결정합니다.

다음날 아침, 70% 에탄올로 조직을 세척하고 카세트에 넣어 조직학 시설로 보내 파라핀에 넣고 헤마틴과 에오신으로 염색하여 조직을 분리합니다. 슬라이드를 coplan 염색 용기에 넣고 섭씨 65도의 수조에서 10분 동안 놓습니다. 이제 슬라이드를 자일렌에 넣고 2분씩 4번 세탁합니다.

각각은 두 번의 5분 세척과 100% 에탄올로 슬라이드를 재수화한 다음 다음 각각에서 한 번의 5분 세척으로 슬라이드를 재수화합니다.95% 에탄올, 75% 에탄올 및 증류수. 세척된 슬라이드를 예열 구연산나트륨 완충액이 있는 코플랜 용기에 넣은 다음 항아리를 실온에서 30분 더 방치한 후 항아리를 찜기에 30분 동안 넣고 PBS Zied로 5분 동안 슬라이드를 세 번 세척합니다.

슬라이드가 마르면 팹 펜으로 조직 주변을 표시하십시오. 그런 다음 실온의 면역염색 수분 챔버에서 차단 버퍼로 조직을 차단합니다. 1시간 후, 차단 완충액을 붓고 조직을 섭씨 4도에서 50-100마이크로리터의 1차 항체로 밤새 배양합니다.

잠복기가 끝나면 PBS Azi로 5분 동안 조직을 세 번 세척합니다. 그런 다음 한 시간 후에 실온에서 어둠 속에서 2 차 항체의 50-100 마이크로 리터에 슬라이드를 배양하고 5 분 동안 증류수로 슬라이드를 세 번 세척합니다. 마지막으로, 조직을 탈수하고, dpi, 연장된 금 장착 매체로 슬라이드를 덮은 다음 형광 현미경으로 슬라이드를 본 커버 슬립을 적용합니다.

이 첫 번째 그림은 C 57 블랙 식스 마우스의 혈청에서 측정된 Fitz 덱스트린을 보여주며, 톨 유사 수용체에서 녹아웃 마우스에 이르기까지 이전에 손상되지 않은 장 상피 장벽이 있는 상태에서 감염 중에 손상된 상피 장벽 무결성을 나타내는 것으로 밝혀졌습니다. ZI 덱스트린은 이 층을 통해 투과성이 낮습니다. 따라서 혈청 내 Fitz 덱스트린 수치 증가는 감염 중 장 상피 장벽 무결성의 손상이 있음을 시사하며, 이 분자가 감염되지 않은 마우스에서 대조 혈청 수준으로 누출될 수 있습니다.

Fitz 덱스트린을 함유한 Gavage도 제시됩니다. Assent는 장 상피 세포에 밀접하게 부착할 수 있는 발강 병원체입니다. luminal 내용물, 속편 및 결장 조직의 박테리아 부하가 7일째에 있을 수 있습니다. 감염 후.

결장의 박테리아 부하가 그램당 약 10에서 9번째 CFU로 최고조에 달하는 것으로 밝혀졌습니다. C 57 PL 6 마우스에서 C DUM 감염 중 관찰된 대부분의 병리학은 감염 후 7일째까지 거시적으로 결장의 원위 2cm에서 발생합니다. 결장 점막이 두꺼워지는 것뿐만 아니라 결장이 짧아지고 길어지는 것은 감염 중에 일반적으로 관찰됩니다.

C 57 PL 6 마리의 마우스는 면역 세포 침투, 결장 소낭선의 신장 및 성교 세포 고갈에 의해 조직 학적으로 특징 지어지는 중등도의 염증 및 병리학을 겪습니다. 감염 중에 반응하는 숙주의 반응을 추가로 특성화하기 위해 면역형광 염색을 사용하여 증식 마커와 같은 관심 단백질의 변화를 검사하거나 감염된 조직 내 국소화와 같은 박테리아 반응의 측면을 검사할 수 있습니다. 이 염색 기법의 예로, 감염 후 12일째에 세균 국소화를 검사하기 위해 빨간색으로 표시되는 세포 증식 마커인 숙주 단백질 KI 67과 녹색으로 표시되는 제로 de 단백질 찢어짐을 검사하는 것이 이 그림에 설명되어 있습니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 몇 분 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 쥐가 감염되었는지 확인하고 감염 과정 전반에 걸쳐 동물의 건강을 모니터링하기 위해 게이징 기술을 적절하게 수행하는 것이 중요합니다. 지난 10년에서 15년 동안 시트로박터 설치류 모델은 EPEC과 같은 세균 병원체를 도대체 부착하는 연구의 황금 표준이 되었습니다.

또한, 장 내 TH 17 반응의 발달과 같은 박테리아에 대한 점막 면역 반응 연구를 위해 잘 알려진 모델이 되었습니다.