Name: Citrobacter rodentium 마우스 모델 : 감염성 대장염에 대한 공부 병원체 및 호스트 기부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 배우세요 Citrobacter rodentium을 이용한 마우스 감염성 대장염 유도 방법입니다. 병원체-숙주 상호작용과 장벽 기능, 조직학적 손상을 평가하여 면역 반응 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 Crohn의 및 캐나다의 대장염 재단 (CCFC)과 건강 연구 (CIHR)에 대한 캐나다 연구소에서 BAV에 운영 보조금에 의해 지원되었다. 기가바이트는 CIHR에서 대학원 학생이기로 운영되었습니다. BAV는 장과 간 장애 (아동) 소아 Gastroenterology의 소아 IBD 연구 및 캐나다 연구 의자 재단 위원장과 어린이입니다.

1. Citrobacter rodentium Inoculum와 마우스의 사정 Gavage의 작성 <ol><li> 준비와 Luria Bertani 국물 (LB)를 압력솥. </li><li> 가능한 C.를 얻을 멸균 inoculating 루프 또는 피펫 팁을 사용하여 LB 한천 플레이트로 냉동 글리세롤 주식과 승리의 rodentium. 37 ° C 하룻밤에 품다. inoculating 루프 또는 피펫 팁을 사용하여 LB 플레이트의 식민지로 매 문화 관 멸균 LB의 국물 3 ML의 예방. inoculum의 준비는 무균 기술을 사용하여 수행해야합니다. </li><li> C.를 품다 rodentium 문화 aerobically 37 번 ° C 200 rpm으로 benchtop 부화 흔드는에서 하룻밤. 주사 LB의 국물은 밤새 문화 흐린 후 나타납니다. </li><li> 전구를 사용 밤새 C. 100 μl 각 마우스를 gavage하기 위해 1 ML의 주사기에 부착 된 위 gavage 바늘을 팁 rodentium 문화. 단단히 목 다시 위에 느슨한 피부를 쥐었고하여 부드럽게 안녕하세요, 마우스를,엄지와 손가락. 머리를 고정하고 gavage 바늘의 삽입을 위해 식도를 바르게 색인 손가락으로 동물의 머리를 뒤로 당겨. </li><li> 수직 위치에 마우스를 유지하고 입의 측면을 따라와 혀 위에 gavage 바늘의 전구 팁을 지시. 부드럽게 입의 지붕을 따라 바늘을 통과하고 식도를 내려 향상. 이 절차를 수행하는 동안 느낌이 어떤 저항이있을 경우 gavage 바늘을 제거하고 다시 삽입합니다. </li><li> 천천히 세균 inoculum 100 μl를 삽입하고 부드럽게 gavage 바늘을 제거합니다. 그 케이지에 반환 한 후 마우스의 호흡 속도와 동작을 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol> 참고 사항 : <ul><li> 2 단계와 3 단계에서 또한 국물 자체의 어떤 세균 오염이 없다는 것을 보장하기 위해 밤새 배양 할 무균 LB의 국물 3 ML과 무균 기술을 사용하여 매 문화 튜브를 준비합니다. LB의 국물은 밤새 문화 이후에 명확 나타납니다. </li><li&gt;을 부드럽게 박테리아의 동등한 복용량은 4 단계에서 각 마우스에 전달 될 수 있도록 gavage에 주사기를로드하기 전에 매 관 내에서 문화를 선동. </li><li> 이 24 시간 이상 주사 한 경우 숙박 문화는 폐기해야합니다. </li><li> 모든 C. 감염된 동물의 rodentium 감염 및 주택은 바이오 레벨 2 시설에서 수행되어야한다. </li></ul> 2. C.에 Colonic 상피 장벽 투과율 측정 rodentium에 감염된 마우스 <ol><li> 원하는 시점 이후의 감염에 장벽 무결성을 측정합니다. </li><li> 검정의 날, 4 kDa fluorescein의 isothiocyanate (FITC) - dextran 150 μl 각 마우스를 gavage하고 표준 곡선을 준비하는 80 MG ML -1의 농도로 생리 (PBS)를 버퍼 인산에 용해 충분한 준비합니다. </li><li> FITC-dextran의 150 μl와 안녕하세요, 마우스와 gavage. 이 시간에 우리를에서 음식을 철회 할 수 있습니다. </li><li> 후 마우스에게 4 시간을 마취gavaging 및 심장 구멍을 통해 가능한 한 많은 양의 피 (~ 450 μl)로 수집합니다. 응고를 억제하는 microcentrifuge 관 3퍼센트 산 구연산의 덱스 트로 오스의 최종 농도에 혈액을 추가합니다. 쥐를 안락사시켜야하고 박테리아 카운트 (단계 3.1-3.5)에 대한 PBS에서 colonic 조직을 수집하고 조직 고정 용 포르말린, 그리고 궁극적으로 immunofluorescence 얼룩 10 % (단계 4.1-4.8)에 있습니다. </li><li> 4 ° C.에서 원심 분리기에서 12 분 1,000 XG에서 혈액 샘플을 스핀 혈청을 수집하여 PBS의 10분의 1과 1 / 100 희석. 복제에 96 잘 판에이 두 dilutions 각 샘플 100 μl를 추가합니다. </li><li> 표준 곡선을 준비하려면 원래의 80 MG ML -1 FITC-dextran은 다음과 농도에 PBS에서 쥐를 gavage하는 데 사용 희석 : 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 μg / ML . 세중의에 96 잘 판에 각 농도 100 μl를 추가합니다. </li><li> 여기 WAV에서 fluorometer를 사용하여 각 샘플의 형광을 수량화485 나노 미터와 535 nm의 방출 파장의 elength. </li><li> 표준 곡선을 음모하여 원시 데이터를 분석합니다. 입력 각 샘플에 FITC-dextran의 농도를 결정하기 위해 표준 곡선에 의해 생성되는 라인의 방정식에 각 샘플에 대한 원시 데이터입니다. </li></ol> 참고 사항 : <ul><li> 4 단계 이후로, 얼음에 혈액 샘플을 유지하고 빛에 노출을 최소화합니다. </li><li> 심각한 조직 손상이이 시점 이후에 발생로 시점에서, 또는 그 이전에 상피 장벽 무결성을 측정 할 경우 7 일 이후 감염 최적입니다. 심각한 피해가 발생하기 전에 장벽 무결성을 측정하면 C. 동안 투자율의 최대 차이를 확인할 수 있습니다 마우스 변종 사이의 rodentium 감염. </li><li> 감염되지 않은 컨트롤 마우스도 상피 장벽의 무결성에 대한 테스트되어 있는지 확인합니다. </li></ul> 3. C.의 조직에서 세균 하중 측정 rodentium에 감염된 마우스 <ol><li> 한 ML 멸균 PBS를 추가ND은 원형에 구슬 autoclaved 금속은 무균 기술을 사용하여 두 ML의 원심 분리기 튜브를 버린. 각 동물로부터 수집 된 개인 조직은 별도의 PBS 튜브에 배치됩니다. 조직의 추가하기 전에 튜브를 무게. </li><li> 마우스에서이게 맹장과 결장을 제거합니다. 콜론에서이게 맹장을 분리하고 집게를 사용하여 luminal 내용을 밀어. PBS 관에 내용을 추가합니다. 10% 포르말린 고정의 말초 콜론과이게 맹장에서 0.5 cm 섹션을 분리 한 후 길이 방향으로 나머지 콜론과이게 맹장을 잘라 튜브에 조직을 배치하기 전에 멸균 PBS로 씻어. </li><li> 조직과 PBS 튜브를 무게 그리고 30 Hz에서 6 분을 위해 구슬 때리는를 사용하여 샘​​플을 균질화. </li><li> 무균 기술 사용 96 잘 플레이트에 잘 당 180 μl 멸균 PBS를 추가합니다. 각 행의 첫 번째도 각 균질 샘플의 20 μl를 추가합니다. 잘 섞어서 순차적으로 (먼저 10 -1에서 dilutions를 얻기 위해 잘 각 이전에서 20 μl를 추가 희석10 -6까지) 붙인다. 그리드와 사각형 바닥 LB 플레이트에 세중의 각 샘플에서 각 희석의 플레이트 10 μl. 37 박 품다 ° C. </li><li> 그리고 평균 식민지 성형 단위 (CFU), 3 카운트를 계산하고, 각 샘플이 계산 된에 희석를 기록합니다. 원래 1 ML 샘플의 20 μl이 사용 된 것처럼, 50으로 평균 CFU를 곱하며, 샘플 CFU / ML의 결과로 계산 된에 희석 요인에 의해. 마지막으로, CFU / g를 결정하는 조직 무게로 나눕니다. </li></ol> 4. 조직 학적 평가와 감염된 장 조직의 Immunofluorescence 착색 <ol><li> 단계 3.2에서와 같이 조직을 수집합니다. 포르말린 하룻밤에 저장 조직은 다음 70 % 에탄올로 씻는다. 파라핀에 조직을 추가하고 착색 5 μm 섹션을 잘라. 조직 학적 평가에 대한 hematoxylin &amp; eosin으로 청바지와 immunofluorescence 얼룩을위한 다음 단계로 진행합니다. </li><li> 이전 착색에 조직을 deparaffinize하려면, 장소에 슬라이드65 10 분에 대한 ° C 물 목욕에 coplin의 착색 병 등을 넣어. 다음, 2 분마다 네 개의 세차에 대한 크실렌의 장소 슬라이드. 95 % 에탄올, 75 % 에탄올과 DH 2 0 : 슬라이드가 다음 하나 5 분 다음 각 세척에 이어 100 % 에탄올에 두 개의 5 분 세차와 rehydrated해야합니다. 이러한 세차는 유해한 증기에 노출을 피하기 위해 퓸 배출 후드에서 수행해야합니다. </li><li> 30 분의 증기선에 미리 예열 나트륨 구연산 버퍼 한 후 이곳의 coplin 병의 장소 슬라이드 한 다음 30 분에 앉아 보자. 이 과정은 단백질 잠재적 인 antigenic 사이트를 검색 포르말린 고정에 의해 형성된 간 링크를시킵니다. </li><li> 5 분 세 번 PBS azide로 씻으십시오. 드라이 슬라이드와 조직에 지역화 착색의 시약을 유지, 소수성 장벽을 생성 할 수 PAP 펜과 조직 주변 마크 공간이 마련되어 있습니다. </li><li> immunostaining 수분 챔버에서 차단 버퍼로 실온에서 1 시간 (예 : α-염소 혈청)에 대한 블록 조직. </li><li> 꼼꼼한를 희석워 항체가 원하는 농도에 항체 희석 버퍼를 사용합니다. 버퍼를 차단 해제 넣어와 조직에 주요 항체의 50-100 μl를 추가합니다. 4 2 시간에 ° C 야간이나 실내 온도에서에 품다. </li><li> 5 분 세 번 PBS azide로 씻으십시오. 어둠 속에서 1 시간 동안 실온에서 조직 및 배양에 항체 희석 버퍼에 희석 이차 항체의 50-100 μl를 추가합니다. 5 분 세 번 DH 2 O로 씻으십시오. </li><li> DAPI 골드 장착 중간을 연장하고 coverslip을 적용 추가 슬라이드를 탈수. 형광 현미경 슬라이드를 표시합니다. </li></ol> 참고 사항 : <ul><li> PBS azide는 4 단계 이후의 세척 매체의 박테리아 성장을 방지 할 수있는 대안으로 신선하게 조리 된 PBS로 대체 할 수 있습니다. </li></ul>

<ol><li>Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD%3A+lessons+from+mouse+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).</li>
<li>Cario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+Receptors+in+Inflammatory+Bowel+Diseases%3A+A+Decade+Later%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).</li>
<li>Eckmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Inflammatory Bowel Disease.</a> Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).</li>
<li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).</li>
<li>Luperchio, S., Schauer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+of+Citrobacter+rodentium+and+transmissible+murine+colonic+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia.</a> Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).</li>
<li>Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+host+responses+to+enteric+bacterial+pathogens%3A+a+balancing+act+between+resistance+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance.</a> Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).</li>
<li>MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+defences+to+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Host defences to Citrobacter rodentium.</a> International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).</li>
<li>Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+the+Citrobacter+rodentium+infection+model+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).</li>
<li>Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+2+plays+a+critical+role+in+maintaining+mucosal+integrity+during+Citrobacter+rodentium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis.</a> Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).</li>
<li>Dennis, A., Kudo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p50+subunit+of+NF-%CE%BAB+is+critical+for+in+vivo+clearance+of+the+non-invasive+enteric+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).</li>
<li>Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88+signalling+plays+a+critical+role+in+host+defence+by+controlling+pathogen+burden+and+promoting+epithelial+cell+homeostasis+during+Citrobacter+rodentium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis.</a> Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).</li>
<li>Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signaling+mediated+by+MyD88+is+required+for+a+protective+innate+immune+response+by+neutrophils+to+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium.</a> Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).</li>
<li>Bry, L., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+T+cell+dependent+serum+antibody%2C+but+not+the+gut-associated+lymphoid+tissue%2C+for+surviving+acute+mucosal+infection+with+Citrobacter+rodentium%2C+an+attaching+and+effacing+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).</li>
<li>Simmons, C. P., Clare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+B+lymphocytes+and+CD4%2B+T+cells+in+immunity+to+infection+by+the+attaching+and+effacing+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).</li>
<li>Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Roles+of+Notch+and+Wnt%2F%CE%B2-Catenin+Pathways+in+the+Regulation+of+Hyperplasia+and%2For+Colitis+in+Response+to+Bacterial+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection.</a> Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).</li>
</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

Citrobacter rodentium 감염은 전염성 질병과 쥐 대장염 모두의 연구 귀중한 모델을 제공합니다. 이 독특한 모델은 두 호스트 응답뿐만 아니라 세균의 병원성 속성의 특성을 허용합니다. 단계는이 프로토콜 세부 사항에이 모델의 성공적인 사용을 설명했다. 대장염을 유도하고 응답을 분석 할 때 염두에 두어야 할이 프로토콜의 여러 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 신선한 밤 C.의 준비 LB의 국물에 rodentium의 inoculum는 마우스를 성공적으로 감염이 필요합니다. 10 8 -10 9 생물체의 복용이 inoculum가 흔드는 또는 오랜 시간 동안 실온에서 벤치 상단에 남아있는 경우, 마우스의 대부분 변종을 감염하는 데 필요한 때, 문화에 남아있는만큼 가능한 생물이되지 않습니다 감염시 대장염을 유발합니다. 그것은 전에 박테리아 inoculum을 선동하는 것도 중요합니다각 마우스가...

장용 세균 병원균에 의해 감염이 위장 (GI) 염증뿐만 아니라, 설사 및 장 상피 장벽 기능 장애 등의 장 병리학 및 pathophysiology을 트리거합니다. 세균성 병원체가 자신의 호스트,뿐만 아니라 감염에 대한 방어를 특정 호스트 응답의 GI 기관을 식민지화하는이 독성 메커니즘이 잘못 이해되어 장용 세균 감염의 모델링에 그러나 최근 발전은 이러한 프로세스에 대한 우리의 이해를 돕기 위해 시작했습니다. 장용 박테리아는 또한 염증성 장 질병 (IBDs)에 연결되었습니다. IBDs Crohn의 질병 (CD)와 UC 만성 장 염증 및 조직 손상을 특징으로 알 수없는 병인의 복잡한 질병입니다. 이러한 dextran 나트륨 황산 (DSS)와 D와 같은 화합물과 화학 도전에, 마우스 - / - 장 염증의 많은 마우스 모델은 IL10와 같은 유전자 변형 종자에 자연스럽게 염증의 존재initrobenzene 설 폰산 (DNBS) 1. 그것은 IBD 환자에 존재 maladaptive 만성 염증성 반응이 장의 박테리아에 장 점막 면역 시스템의 이상 노출 2, 그러므로 전염성 대장염의 모델의 연구는 잠재적으로 병원성 호스트를 정의하는 중요한 가능성을 제공에 유전자 민감한 개인에 개발하는 가설되었습니다 . 장용 박테리아에 대한 답변 Citrobacter rodentium 유도 대장염은 장의 박테리아와 IBD의 pathogenesis의 잠재적 인 메커니즘의 추가 이해에 대한 호스트 응답의 분석을 위해 수 있도록 잘 1,3를 특징으로 한 감염성 대장염의 희귀 모델 중 하나이며, 필수 단계 소설 예방 및 치료 치료를 개발 인치 C. rodentium는 밀접하게 중요한 인간과 관련되어 (A / E) g 부착 부정적인 및 나온다, 손쥐 특정 세균 병원균입니다병원체 enteropathogenic E. 대장균 (EPEC) 및 enterohaemorrhagic E. 대장균 (EHEC) 3-8. A / E의 병원균의 가족은 깊은 숙주 세포에 비 침습적 받침대와 같은 구조를 형성 cecal과 colonic 상피의 꼭대기 숙주 세포 막에 첨부합니다. C.이있는 구두 도전 10 8 -10 9 생물의 rodentium은 crypts, mononuclear 면역 세포 침투와 고 블렛 셀 고갈 3,4의 colonic 증식이나 신장을 특징으로 전염성 대장염의 강력한 모델을 생산하고 있습니다. 식민지의 초기 사이트는 몇 시간 도전 한 후, cecal 패치에 2-3일 감염 3 후 말초 콜론으로 진행을합니다. 면역 적격 마우스 변종에서 병원균의 등급이 3-4주 감염 1,3,4 후에 이루어집니다. 그러나 많은 유전자 변형 종자는 즉, 유전자 결함 또는 녹아웃 (- / -) 생쥐는 increa를 표시 할 수 발견되었습니다과장 손상 및 / 또는 만성 감염과 염증 9-14의 결과로 감염에 느끼기 쉬운 상태를 SED. 이 녹아웃의 변종이 전염성 대장염 모델의 사용, 본래 신호 단백질이 부족한 많은 사람들이, 장 감염 및 염증의 해상도에 필수적인 여러 호스트 단백질을 드러내 indispensible있다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Luria 국물 </td><td> ABM </td><td> G247 </td><td> 물 1L에 LB 가루 25g을 추가합니다. 사용하기 전에 압력솥. </td></tr><tr><td> 그리드와 광장 바닥 판 </td><td> 어부 </td><td> 08-757 - 11A </td><td></td></tr><tr><td> 팔콘 문화 관 </td><td> Sarstedt </td><td> 62.515.006 </td><td></td></tr><tr><td> 전구는 위 gavage 바늘이 팁 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 18060-20 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ML의 주사기 </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> 4 kDa FITC - dextran </td><td> 시그마 </td><td> FD-4 </td><td></td></tr><tr><td> 구연산 </td><td> 시그마 </td><td> C7129 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 나트륨 시트르산 </td><td> 어부 </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> 우선 당 </td><td> 어부 </td><td> D16.1 </td><td></td></tr><tr><td> 산성 구연산 덱스 트로 오스 </td><td></td><td></td><td> 20 MM ctiric 산, 110 MM 나트륨 구연산, 5 MM 덱스 트로 오스 </td></tr><tr><td> 블랙 96 - 웰 플레이트 </td><td> 어부 </td><td> 07-200-762 </td><td></td></tr><tr><td> 금속 구슬 (5 ㎜) </td><td> Qiagen </td><td> 69,989 </td><td></td></tr><tr><td> 포르말린 10% </td><td> 어부 </td><td> 5F93-4 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ML의 약병 </td><td> DiaMed </td><td> STK3205 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> 어부 </td><td> H345-23 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin </td><td> 어부 </td><td> E511-100 </td><td></td></tr><tr><td> 크실렌 </td><td> 어부 </td><tD&gt; HC700-1GAL </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반 20 </td><td> 시그마 </td><td> P5927 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin의 착색 병 </td><td> VWR </td><td> 47751-792 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 시트르산 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 10 MM 나트륨 구연산, 0.05 % 십대 초반 20 pH를 6.0 </td></tr><tr><td> 자궁 펜 </td><td> Cedarlane </td><td> Mu22 </td><td></td></tr><tr><td> 염소 혈청 </td><td> 시그마 </td><td> G902-3 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 (BSA) </td><td> 어부 </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 시그마 </td><td> T8532 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 azide </td><td> 시그마 </td><td> SZ002 </td><td></td></tr><tr><td> 버퍼를 차단 </td><td></td><td></td><td> 2 % 염소 혈청, 1 % BSA, 0.1 % 트라이 튼 X-100, 0.05 % 십대 초반 20 0.05 % 나트륨azide, 0.01 M PBS, pH를 7.2, 4에 혼합 및 저장 ° C. </td></tr><tr><td> 항체 희석 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 0.1 % 트라이 튼 X-100, 0.1 % BSA, 0.05 % 나트륨 azide, 0.04 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td></tr><tr><td> 티르에 대한 차단 버퍼 및 항체 희석 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 위와 같이하지만, 세제의 추가 (트라이 튼 X-100과 십대 초반 20)없이 동일 요리법 </td></tr><tr><td> DAPI와 골드 Antifade의 시약을 연장 </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> 어부 </td><td> 12.54SE </td><td></td></tr><tr><td> Benchtop 부화 흔드는 </td><td> Barnstead 연구소 선 </td><td> 최대 Q4000 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorometer </td><td> Perkin 엘머 </td><td> Victor2D </td><td></td></tr><tr><td> 냉장 원심 분리기 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> Microfuge 22R</td><td></td></tr><tr><td> 기선 </td><td> 블랙 &amp; 데커 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> Zeiss </td><td> Axio Image.Z1 </td><td></td></tr></tbody></table>

<em&gt; citrobacter rodentium</em&gt; 마우스 모델 : 감염성 대장염에 대한 공부 병원체 및 호스트 기부

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

이 프로토콜은 전염성 질환과 대장염의 강력한 모델을 생산하는 데 필요한 단계뿐만 아니라, 마우스에 Citrobacter rodentium 감염을 특징하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. C.는 rodentium는 밀접하게 임상 적으로 중요한 인간 병원체 enteropathogenic E. 관련되어 g 제외, 손쥐 특정 세균 병원균입니다 대장균 및 enterohemorrhagic E. 대장균. C.로 감염시 rodentium, 면역 적격 마우스는 겸손과 과도 체중 감소, 설사로 고통 받고 있습니다. Histologically, 장 토굴 신장, 면역 세포 침투 및 고 블렛 셀 고갈을 준수하고 있습니다. 감염의 등급이 3-4주 후 이루어집니다. 감염 후 다른 시간 지점에서 장 상피 장벽 무결성, 박테리아 부하 및 조직 학적 손상의 측정은 감염에 민감 마우스 종자의 특성을 수 있습니다. 독성 메커니즘s이 (가) 세균성 병원체가 자신의 호스트,뿐만 아니라 감염에 대한 방어를 특정 호스트 응답의 창자를 이식하는이 제대로 이해하고 있습니다. 따라서 C. 장용 세균 감염의 rodentium 모델은 이러한 프로세스에 대한 우리의 이해에 도움이 할 수있는 유용한 도구 역할을합니다. 장용 박테리아는 또한 염증성 장 질병 (IBDs)에 연결되었습니다. 그것은 IBD 환자에서 볼 수 maladaptive 만성 염증성 반응이 장의 박테리아에 장 점막 면역 시스템의 이상 노출 후 유전자 민감한 개인에 개발하는 가설되었습니다. 따라서, 전염성 대장염의 모델의 연구는 장용 박테리아에 잠재적으로 병원성 호스트 응답을 정의하기위한 중요한 가능성을 제공합니다. C.는 rodentium 유도 대장염은 IBD의 pathogenesis의 잠재적 인 메커니즘에 대한 우리의 이해를 발전, 장용 박테리아에 대한 호스트 응답의 분석을 허용 하나의 희귀 한 모델이다;소설 예방 및 치료 치료의 개발에 필수적.

표준 감염 실험이 진행되는 동안, 마우스는 100 μl 박 C.의 gavage을 통해 약 2.5 X 10 8 CFU에 감염된 rodentium 문화. C.와 C57BL / 6 마우스의 감염 겸손과 과도 체중 감소, 설사에 rodentium 결과이다. C57BL / 6 마​​우스와 드문, 동물은 병이되고 euthanization가 필요할 수 있습니다 있지만. 따라서, 쥐가 다른 변종은 감염에 의해 영향을받습니다 할 수있는 범위를 결정하기 위해, 체중 감소 및 piloerect 모피 hunched 자세로 고통의 증상의 정도에 대한 모니터링해야합니다. 4 그림 1에 제시 결과는 냉동 글리세롤 주식에서 준비 하룻밤 문화를 사용하여 수행 감염의 대표입니다. 칠일 후 감염에서 마우스 anesthetized 있었고, 피가 심장 주사를 통해 수집되었다. 그림 1은...

Citrobacter rodentium 감염이 장의 세균 감염을 공부뿐만 아니라 마우스의 면역 반응 및 대장염를 개최 할 수있는 중요한 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 장벽 무결성, 병원체 부하와 손쥐 전염성 대장염에 대한 병원체 및 호스트 공헌의 철저한 특성을 허용하는 조직 학적 손상의 측정을 설명합니다.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; 마우스 모델 : 감염성 대장염에 대한 공부 병원체 및 호스트 기부

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

이 프로시저의 전반적인 목표는 그람 음성 거울 병원체인 citrobacter rodent를 마우스에 감염시켜 결장염을 유도함으로써 위장관 내의 병원체와 호스트 간의 상호작용을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 overnight 배양액을 접종함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 경구 투여(oral gavage)를 통해 마우스에 overnight 접종물을 감염시킵니다.다음으로 감염 후 7일째에 최종 단계로서 맹장, 결장 및 관腔 내용물을 수집합니다. 조직을 도말하여 박테리아 콜로니 수를 측정하고, 관심 대상인 숙주 단백질에 대해 조직 면역 염색을 수행합니다. 최종적으로 면역조직화학법을 통해 병원체 부하, 장벽 기능, 조직학적 손상 및 숙주 반응의 변화를 평가할 수 있습니다.이 방법은 감염성 결장염의 강력한 모델을 제공하여 숙주-병원체 상호작용 및 면역 반응 연구를 가능하게 하지만, 박테리아 감염이 결장암 위험에 미치는 영향을 조사하는 데에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 쥐에게 박테리아를 감염시키는 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다. 먼저 멸균된 백금이를 사용하여 냉동 글리세롤 스톡에서 생존 가능한 C redemption을 LB 평판 배지에 스트리킹하여 배양하는 것으로 시작하십시오.37°C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 접종 루프를 사용하여 LB 플레이트의 콜로니를 3 mL의 멸균 LB 브로스에 옮깁니다. 다음으로, ERO Dunum 배양액을 벤치탑 배양 셰이커를 이용하여 37°C에서 200 RPM으로 하룻밤 동안 호기성 배양합니다. 다음 날 아침이면 접종된 LB 브로스가 탁하게 보일 것입니다.배양액을 부드럽게 흔들어 박테리아 세포 배양액이 고르게 분포되도록 한 다음, 1 mL 주사기에 배지를 채우고 위관 영양 바늘(gastric gavage needle)을 연결합니다. 엄지와 손가락으로 마우스의 목과 등 쪽의 느슨한 피부를 단단히 잡아 고정한 후, 검지로 동물의 머리를 뒤로 당겨 머리를 고정하고 삽입을 위해 식도를 곧게 폅니다.마우스를 똑바로 세운 상태에서, 위장 존데(gastric gavage needle)의 전구 팁을 동물의 입 옆을 따라 혀 위로 향하게 합니다. 바늘을 동물의 입천장을 따라 조심스럽게 통과시킨 후 식도를 따라 아래로 삽입합니다. 마지막으로 주사기를 사용하여 100 µL의 세균 접종액을 천천히 주입하고, 존데 바늘을 부드럽게 제거합니다.마우스를 케이지에 넣은 후 호흡률과 행동을 관찰하십시오. 분석 당일, 시연한 대로 마우스의 목덜미를 잡고 150 µL의 갓 준비한 fitzy dextrin을 경구 투여하십시오. 투여 시점에 케이지에서 먹이를 제거하고, 투여 4시간 후에 동물을 진정시키십시오. 마취된 동물로부터 심장 천자를 통해 가능한 한 많은 양의 혈액을 채취하십시오.응고를 방지하기 위해 마이크로 원심분리 튜브에 최종 농도 3%의 acid citrate dextrose가 되도록 혈액을 첨가합니다. 다음으로, 혈액 샘플을 4°C에서 1000 xg으로 12분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 혈청을 수집하고 PBS를 사용하여 각 샘플당 100 µL씩 1:10 및 1:100로 희석합니다.이 두 가지 희석액을 96-웰 플레이트에 중복으로 분주합니다. 표준 곡선을 작성하려면, 마우스 경구 투여에 사용된 80 mg/mL 농도의 원본 Fitz Dextrin 샘플 100 µL를 암색 마이크로 원심분리 튜브 내의 PBS로 희석하십시오.그 후 표준 시료를 96-웰 플레이트에 3반복으로 분주합니다. 그런 다음 형광계(fluorimeter)를 사용하여 각 시료의 형광을 정량하고 FXI 덱스트린 농도를 결정합니다. 무균 조작법을 사용하여, 우선 2mL 원심분리 튜브의 라운드 바닥에 멸균 PBS 1mL와 오토클레이브용 금속 비드를 넣는 것으로 이 단계를 시작합니다. 그다음 각 튜브의 무게를 측정합니다.다음으로, 마우스에서Cecum과 결장을 제거한 후, Cecum과 결장을 분리하고 세로 방향으로 절개합니다. 포셉을 사용하여 내강의 내용물을 수집하고, 이를 PBS가 담긴 튜브에 넣습니다. Cecum과 결장 조직을 멸균 PBS로 세척한 후 각각 별도의 튜브에 담습니다.이제 조직이 들어있는 튜브의 무게를 측정하고 비드 비터를 사용하여 6분 동안 샘플을 균질화합니다. 30 Hz에서 96-웰 플레이트의 각 웰에 멸균 PBS 180 µL를 추가합니다. 그런 다음 각 균질화된 샘플 20 µL를 각 행의 첫 번째 웰에 넣고 잘 섞어줍니다.이전 웰의 시료 20 µL를 각각 추가하여 첫 번째 웰의 10⁻¹부터 10⁻⁶까지 순차적으로 희석합니다. 그 후, 각 시료의 희석액 10 µL를 그리드가 그려진 정사각형 바닥의 LB 플레이트에 3회 반복하여 도말하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 플레이트 하나당 콜로니 형성 단위(CFU)를 측정합니다.각 시료의 3회 반복 측정값의 평균을 구한 다음, 각 시료를 계수한 희석 배수를 기록합니다. 평균 CFU에 50과 해당 시료를 계수한 희석 배수를 곱하여 밀리리터당 CFU를 산출합니다. 마지막으로, 이전에 보관한 0.5 cm 결장 및 맹장 절편을 하룻밤 동안 포르말린 고정 처리한 후, 조직 무게로 나누어 그램당 CFU를 결정합니다.다음 날 아침, 조직을 70% ethanol로 세척하고 카세트에 넣어 조직학 센터로 보내 파라핀 포매 및 hematoxylin and eosin 염색을 통해 조직을 탈파라핀화합니다. 슬라이드를 coplan 염색 용기에 넣고 65 °C 항온수조에서 10분 동안 가열합니다. 이제 슬라이드를 xylene에 넣고 2분씩 4회 세척합니다.각 슬라이드를 100% ethanol로 5분씩 두 번 세척하여 재수화시킨 후, 95% ethanol, 75% ethanol, 증류수 순으로 각각 5분씩 한 번씩 세척합니다. 세척된 슬라이드를 미리 데워둔 sodium citrate buffer가 담긴 coplan jar에 넣고, 실온에서 30분간 방치한 뒤 스티머에 넣어 30분 동안 가열합니다. 그 후 슬라이드를 PBS Zied로 5분씩 세 번 세척합니다.슬라이드가 마르면 пап 펜으로 조직 주변 영역을 표시합니다. 그런 다음 실온의 면역염색 습윤 챔버에서 블로킹 버퍼를 사용하여 조직을 블로킹합니다. 1시간 후 블로킹 버퍼를 따라내고 50 to 100 µL의 1차 항체에서 4 °C로 하룻밤 동안 조직을 인큐베이션합니다.배양 기간이 지난 후, 조직을 PBS Azi로 5분씩 3회 세척합니다. 그 다음, 슬라이드를 50~100 µL의 2차 항체와 함께 암실 내 실온에서 1시간 동안 배양하고, 증류수로 5분씩 3회 세척합니다. 마지막으로 조직을 탈수시킨 후, dpi prolonged gold mounting medium을 도포하고 커버 슬립을 덮어 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰합니다.첫 번째 그림은 C 57 black six 마우스와 toll-like receptor 2 knockout 마우스의 혈청에서 측정된 Fitz dextrin 수치를 보여줍니다. knockout 마우스는 앞서 온전한 장 상피 장벽이 있음에도 불구하고 감염 시 상피 장벽 무결성이 손상되는 것으로 밝혀졌습니다. ZI dextrin은 이 층을 통한 투과성이 낮습니다. 따라서 혈청 내 Fitz dextrin 수치의 증가는 감염 중 장 상피 장벽 무결성이 손상되어 이 분자가 누출되었음을 시사하며, 이는 감염되지 않은 마우스의 혈청 수치와 대조됩니다.Fitz dextrin을 이용한 경구 투여(Gavage) 과정도 제시됩니다. Assent는 장 상피 세포에 밀접하게 부착될 수 있는 관강 내 병원균입니다. 감염 후 7일째에 관강 내용물, 회장 및 결장 조직 내의 세균 부하량을 측정할 수 있습니다.결장 내의 세균 수는 g당 10⁹ CFU 정도에서 정점에 도달하는 것으로 밝혀졌습니다. C 57 PL 6 마우스의 C DUM 감염 중 관찰되는 대부분의 병리는 감염 후 7일째에 육안상 결장의 말단 2cm 부위에서 발생합니다. 감염 동안 일반적으로 결장 점막의 증후와 결장 길이의 단축이 관찰됩니다.C 57 PL six 마우스는 면역 세포 침윤, 결장 은와(crypt)의 연장 및 술잔 세포(goblet cell) 고갈로 특징지어지는 조직학적 분석 결과, 중등도의 염증과 병리 현상만을 나타냅니다. *Salmonella* 감염 동안 일어나는 숙주의 반응을 더욱 상세히 분석하기 위해, 증식 마커와 같은 관심 단백질의 변화를 조사하거나, 감염된 조직 내에서의 국소화와 같은 박테리아 반응의 양상을 조사하는 데 면역형광 염색법을 활용할 수 있습니다. 감염 후 12일 차에 세포 증식 마커인 숙주 단백질 KI 67(빨간색으로 표시)과 박테리아 국소화를 확인하기 위한 *Salmonella* 단백질(초록색으로 표시)을 조사한 이 염색 기법의 예시가 이 그림에 나타나 있습니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 수 분 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 마우스가 확실히 감염되었는지 확인하고 감염 과정 전반에 걸쳐 동물의 건강 상태를 모니터링하기 위해 게이징(gaging) 기술을 정확하게 수행하는 것이 중요합니다. 지난 10~15년 동안 citrobacter 설치류 모델은 장내 EPEC와 같은 부착 및 침투성 박테리아 병원체 연구의 표준 모델이 되었습니다.또한, 이는 장내 TH 17 반응의 발달과 같이 박테리아에 대한 점막 면역 반응 연구를 위한 잘 알려진 모델이 되었습니다.

the-citrobacter-rodentium-mouse-model-studying-pathogen-host

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

영구와 만성 세균 감염 마우스 모델...

만성의 살모넬라균 감염된 마우스 모델

출처: 윈스턴, J. A. 외 임상적으로 중요한 Clostridium difficile 균주 R20291의 Cefoperazone 처리 마우스 모델.  J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 항생제 사전 처리된 쥐에게 클로스트리듐 디피실 포자를 접종하여 병원 및 숙주 반응 연구를 위한 쥐 감염 모델을 구축하는 절차를 시연합니다.

클로스트리듐 디피실 감염의 마우스 모델 구축

멀티 양상 이미징 작은 동물 모델에서 세균성 식민지 공부를위한 유용한 방법입니다. 이 프로토콜은 생물 발광과 생쥐의 감염을...

의 4D 좌석 Multimodality 이미징<em&gt; Citrobacter rodentium</em마우스에서&gt; 감염

동물 모델은 만성 염증의 발달에 기여하는 호스트와 병원체의 특정 메커니즘을 규정하는 매우 중요한 도구로 입증되었다. 여기서 우리는 로컬 및 전신성 염증 부위에서의 진행을 평가하기 위해 인간 병원체 Porphyromonas 진지 발리 및 세부 방법론 경구 감염 마우스 모델을 설명한다.

로컬 및 전신 사이트에서 병원체에 의한 만성 염증을위한 마우스 모델

여기에, 절차는 대장균 K1의 문화와 신생아 쥐에 전신 감염의 설립을 설명합니다. 이것은 비 침습성 절차 맥락총에서 위장관 식민 전신 순환에 병원균의 전위, 및 중추 신경계의 침입을 허용한다.

Neuropathogenic의 비 침습 모델 대장균 신생아 쥐에 감염

요로 감염(UTI)을 모델링하는 능력은 박테리아 발병 기전을 이해하고 새로운 치료법의 개발을 촉발할 수 있도록 하는 데 매우 중요합니다. 이 작업의 목표는 인간에서 관찰된 결과를 요약하고 예측하는 실험적 요로감염 및 카테터 관련 요로감염의 마우스 모델을 시연하는 것입니다.

마우스 모델의 설립 및 요로 감염 및 CAUTI의 특성

이 프로토콜은 임상 적으로 관련 및 유전자 다루기 쉬운 변형, R20291를 사용 클로스 트리 디움 디피 감염 (CDI)의 cefoperazone 마우스 모델을 설명합니다. 임상 질병 모니터링, C. 디피 세균 열거, 독소의 세포 독성 및 마우스 모델에서 CDI에 걸쳐 조직 병리학 적 변화에 대한 강조는 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.

의 Cefoperazone 처리 된 마우스 모델 임상 관련<em&gt; 클로스 트리 디움 디피</em&gt; 스트레인 R20291

Enterohemorrhagic 생물 발광 표시 된 박테리아를 사용 하 여 대장균 (EHEC) 식민지에 대 한 마우스 모델의 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템 라이브 동물에 의해 이러한 발광 박테리아의 탐지 EHEC 식민의 우리의 현재 이해를 미리 수 있습니다.

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

Murine 원심 인공 인간의 전환 colitis, 지저분한 스트림에서 제외 콜론 세그먼트에서 주로 림프 colitis 위한 murine 모델을 제공 합니다.

Murine 원심 인공, C57BL/6 마우스에 전환 Colitis의 새로운 모델

본 프로토콜에서, 장내 미생물-항원 특이적 T 세포 입양 상반염 모델이 기재된다. CD4+ T 세포는 CBir1 TCR 형질전환 마우스로부터 분리된다. 이들은 면역 지배적인 창자 microbiota 항원 CBir1 flagellin를 위해 특정합니다, 수신자 Rag1/-- 마우스로 전송되는, 장 염증으로 이끌어 내는.

CBir1 TCR 형질 전환 CD4+ T 세포의 입양 전달에 의한 장 염증유도

배우세요 Citrobacter rodentium을 이용한 마우스 감염성 대장염 유도 방법입니다. 병원체-숙주 상호작용과 장벽 기능, 조직학적 손상을 평가하여 면역 반응 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

더 많은 동영상 탐색