수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜
January 6th, 2013
레이저 microdissection은 실질의 미세한에서 선택한 셀의 복구를 할 수있는 기술입니다. 여기 transcriptomic 연구에 사용되는 수술 표본에서 인간의 췌장 섬을 획득을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리 프로토콜은 따라서 자신의 컬렉션을 촉진 인간의 베타 세포의 고유 autofluorescence을 향상시킵니다.
안녕하세요, 제 이름은 University of Technology, Reen Laser의 Thea Hands Institute의 Dorte입니다. 미세해부는 아주 적은 양의 부모 종양에서 특별한 세포 집단을 얻을 수 있는 기술입니다. 절개된 세포는 전사체 및 단백질체 연구, DNA 평가 또는 염색체 분석에 사용할 수 있습니다.
여기에서는 전사체 연구에 사용할 수술 표본에서 인간 췌장 메타 세포를 획득하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 췌장 조직을 작은 조각으로 자릅니다. 크라이오 몰드의 중앙에 한 조각을 놓고 Chilled embedding compound로 덮습니다.
조직을 즉시 냉장 한 두 가지 재료 부탄으로 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 단면 : 40 개의 접착 슬라이드에 라벨을 붙이고 Christed Chamber 내부를 사전 냉각합니다. cryo block을 트리밍한 후 OCT 화합물로 표본 홀더에 동결된 조직을 고정합니다.
10마이크로미터 두께의 단면 40개를 자릅니다. 손가락으로 슬라이드의 뒷면을 터치하여 한 섹션을 하나의 슬라이드로 옮겨 섹션을 놓는 위치만 따뜻하게 합니다.냉동 데드 내부에 섹션을 2-3분 동안 시도하고 나중에 섭씨 영하 80도에서 보관하고 Ation 시약을 준비하고 셀린을 제외한 모든 액체를 얼음에 식힙니다. 이것은 미세 해부 전에 애완 동물 세포의 고유한 자가형광을 증가시킬 것입니다.
4개의 섹션은 매번 경감됩니다. 한 번에 두 섹션을 처리합니다. 먼저 70% 에탄올에 30초 동안 고정하십시오.
그런 다음 5-6 번의 빠른 담그기로 섹션을 씻으십시오. 이후 DPC 처리수에서. 조직을 100% 에탄올에서 1분 동안 탈수하고 이 단계를 반복하고 4분 동안 셀린에서 슬라이드를 배양합니다.
한편, 다른 한 쌍의 섹션의 탈수를 시작하십시오. 마지막으로, 어둠 속에서 3-5분 동안 슬라이드를 자연 건조합니다. 두 개의 슬라이드를 호일에 연달아 배치하여 수분으로부터 조직을 보호하고 자가 형광을 표백으로부터 보호하십시오 50ml 튜브 단면 전에 RNA로 현미경을 청소하고 접착 캡을 robo Mover에 고정합니다.
슬라이드를 s에 삽입tage 및 캡을 건드리지 않고 섹션 위로 밀접하게 이동합니다. 자가형광이 더 나은 세포 영역을 식별하여 구멍을 국소화합니다. 인간 더 나은 세포의 고유 자가형광은 설정에서 노란색으로 나타나는 반면 췌관은 밝은 녹색 자가형광을 나타냅니다.
자유손 선택 도구로 더 나은 세포 영역을 선택하고 레이저를 시작하여 미세 해부합니다. 40-60분 이내에 4개의 경감된 극저온 절편의 구멍을 하나의 접착 캡으로 해부합니다. 원하는 경우 캡을 현미경의 체크포인트로 이동하여 캡처된 조직을 확인합니다.
로보 무버에서 캡을 제거하고 파이프를 연결합니다. 세포 파괴를 위해 캡의 뚜껑에 10마이크로리터 추출 버퍼를 넣습니다. 뚜껑을 섭씨 42도에서 30분 동안 거꾸로 배양합니다.
용해물을 스핀다운하고 튜브에 라벨을 붙인 다음 RNA 추출이 발생할 때까지 섭씨 영하 80도 감소된 온도에서 보관합니다. Ation 레이저, 마이크로 해부 및 용해를 40개의 극저온 절제 모두에서 수행합니다. 그 후, 10개의 용해물을 결합하고 제공된 프로토콜에 따라 UR PU RNA 분리 키트를 사용하여 RNA 분리를 계속하여 11마이크로리터 RNA를 얻습니다.
일반적으로, 우리는 미세해부 조직의 양과 RNA 수율 사이의 직접적인 관계를 발견하지 못했으며, 외과의에 의한 적출과 병리학자에 의한 검사 후 췌장 표본의 동결 사이의 시간 간격의 차이는 회수된 RNA의 질과 양에 부분적으로 설명할 수 있습니다. 고려해야 할 다른 핵심 요소는 더 높은 RNA 무결성을 사용하여 더 낮은 에너지로 미세 해부에 적용되는 레이저 에너지와 레이저 초점 및 레이저 압력 절단기 포인팅 포인트의 거리입니다. 또한 접착 캡과 접착 캡 사이의 거리를 가능한 한 낮게 유지하여 RNA 양을 최적화할 수 있습니다.
레이저 미세 해부 현미경을 사용할 수 있는 경우 캡처 프로세스 중에 미세 절개 조직의 손실을 방지하십시오. 이 절차는 부분 췌장 절제술을 수행하는 모든 연구 기관에서 시행될 수 있으며, 이를 통해 비당뇨병 환자와 당뇨병 환자 모두의 인간 눈꺼풀 물질에 대한 접근성을 높일 수 있습니다.
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개요
이 기사는 수술 시료에서 인간 췌장 도세포를 회수하기 위한 레이저 미세 해체 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 전사체 연구를 위한 베타 세포 수집을 강화합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 전사체학
배경
- 레이저 미세 해체는 특정 세포 집단의 분리를 가능하게 합니다.
- 작은 조직 샘플에 특히 유용합니다.
- 이 기술은 전사체 및 단백체 분석을 포함한 다양한 연구에 적용할 수 있습니다.
- 자가형광 개선은 표적 세포의 수집을 돕습니다.
연구 목적
- 인간 췌장 도세포 획득을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
- 전사체 연구에서 베타 세포 연구를 촉진합니다.
- 수술 시료에서의 세포 수집 효율성을 향상합니다.
사용된 방법
- 췌장 조직에 적용된 레이저 미세 해체 기술.
- 작은 조각으로 자르는 조직 샘플 준비.
- 최적의 해체를 위해 냉각 컴파운드에 조직 매립.
- 추가 분석을 위한 베타 세포 수집.
주요 결과
- 인간 췌장 도세포의 성공적인 분리.
- 베타 세포의 개선된 자가형광 관찰.
- 전사체 연구를 위한 프로토콜 효과성 입증.
- 작은 샘플에서의 표적 세포 집단 수집 촉진.
결론
- 이 프로토콜은 인간 췌장 도세포의 회수를 강화합니다.
- 레이저 미세 해체는 세포 분석에 귀중한 도구입니다.
- 개선된 방법은 전사체 연구에 더 나은 통찰력을 가져올 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables precise isolation of human pancreatic beta cells from limited surgical specimens, addressing a critical bottleneck in transcriptomic studies of diabetes-relevant tissues. By enhancing intrinsic autofluorescence through ice-cold reagent processing, the protocol reduces tissue handling time and improves RNA preservation, directly supporting target validation in metabolic disease research. This approach strengthens mechanistic de-risking by providing purified cell populations for downstream omics applications in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pure beta cell populations for pathway analysis in type 2 diabetes models.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through rapid, accurate identification of target cells via enhanced autofluorescence, reducing false positives in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assay standardization by providing consistent, high-integrity RNA inputs from microdissected islets.
- Operational Value: Supports reproducible quantitative outputs essential for screening readiness and platform reuse in biomarker discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by enabling transcriptomic analysis of human pancreatic islets directly linked to diabetic pathophysiology.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supplying defined cell populations for mechanistic follow-up studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis testing in early biology, supporting assay development through standardized inputs, and informing translational decisions via quantitative molecular profiling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating beta cells for functional target validation in metabolic disease models.
- Screening: Delivers assay-ready samples with reproducible RNA yields, critical for screening compound effects on isolated islets.
- Analytics: Generates quantitative transcriptomic readouts that allow comparison between diabetic and non-diabetic states to inform lead identification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing human-relevant samples that bridge in vitro findings to disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for accessing primary human islets across multiple projects, reducing dependency on variable donor sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in beta cell-specific signaling pathways.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through controlled tissue processing and defined dissection parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement in human-relevant cells, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of diabetes targets based on validated human islet transcriptomic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, cryosectioning, and laser microdissection instrumentation.
- Dependent on access to a PALM MicroBeam system or equivalent LMD platform with AutoLPC capability.
- Necessitates standardized reagent handling protocols to maintain autofluorescence and RNA integrity across users.
- Involves adaptation considerations for varying pancreatic specimen quality and ischemic time between harvest and freezing.
- Limited by RNA yield constraints, necessitating pooling of multiple microdissected samples for sufficient input to downstream kits.
