수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

안녕하세요, 제 이름은 University of Technology, Reen Laser의 Thea Hands Institute의 Dorte입니다. 미세해부는 아주 적은 양의 부모 종양에서 특별한 세포 집단을 얻을 수 있는 기술입니다. 절개된 세포는 전사체 및 단백질체 연구, DNA 평가 또는 염색체 분석에 사용할 수 있습니다.

여기에서는 전사체 연구에 사용할 수술 표본에서 인간 췌장 메타 세포를 획득하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 췌장 조직을 작은 조각으로 자릅니다. 크라이오 몰드의 중앙에 한 조각을 놓고 Chilled embedding compound로 덮습니다.

조직을 즉시 냉장 한 두 가지 재료 부탄으로 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 단면 : 40 개의 접착 슬라이드에 라벨을 붙이고 Christed Chamber 내부를 사전 냉각합니다. cryo block을 트리밍한 후 OCT 화합물로 표본 홀더에 동결된 조직을 고정합니다.

10마이크로미터 두께의 단면 40개를 자릅니다. 손가락으로 슬라이드의 뒷면을 터치하여 한 섹션을 하나의 슬라이드로 옮겨 섹션을 놓는 위치만 따뜻하게 합니다.냉동 데드 내부에 섹션을 2-3분 동안 시도하고 나중에 섭씨 영하 80도에서 보관하고 Ation 시약을 준비하고 셀린을 제외한 모든 액체를 얼음에 식힙니다. 이것은 미세 해부 전에 애완 동물 세포의 고유한 자가형광을 증가시킬 것입니다.

4개의 섹션은 매번 경감됩니다. 한 번에 두 섹션을 처리합니다. 먼저 70% 에탄올에 30초 동안 고정하십시오.

그런 다음 5-6 번의 빠른 담그기로 섹션을 씻으십시오. 이후 DPC 처리수에서. 조직을 100% 에탄올에서 1분 동안 탈수하고 이 단계를 반복하고 4분 동안 셀린에서 슬라이드를 배양합니다.

한편, 다른 한 쌍의 섹션의 탈수를 시작하십시오. 마지막으로, 어둠 속에서 3-5분 동안 슬라이드를 자연 건조합니다. 두 개의 슬라이드를 호일에 연달아 배치하여 수분으로부터 조직을 보호하고 자가 형광을 표백으로부터 보호하십시오 50ml 튜브 단면 전에 RNA로 현미경을 청소하고 접착 캡을 robo Mover에 고정합니다.

슬라이드를 s에 삽입tage 및 캡을 건드리지 않고 섹션 위로 밀접하게 이동합니다. 자가형광이 더 나은 세포 영역을 식별하여 구멍을 국소화합니다. 인간 더 나은 세포의 고유 자가형광은 설정에서 노란색으로 나타나는 반면 췌관은 밝은 녹색 자가형광을 나타냅니다.

자유손 선택 도구로 더 나은 세포 영역을 선택하고 레이저를 시작하여 미세 해부합니다. 40-60분 이내에 4개의 경감된 극저온 절편의 구멍을 하나의 접착 캡으로 해부합니다. 원하는 경우 캡을 현미경의 체크포인트로 이동하여 캡처된 조직을 확인합니다.

로보 무버에서 캡을 제거하고 파이프를 연결합니다. 세포 파괴를 위해 캡의 뚜껑에 10마이크로리터 추출 버퍼를 넣습니다. 뚜껑을 섭씨 42도에서 30분 동안 거꾸로 배양합니다.

용해물을 스핀다운하고 튜브에 라벨을 붙인 다음 RNA 추출이 발생할 때까지 섭씨 영하 80도 감소된 온도에서 보관합니다. Ation 레이저, 마이크로 해부 및 용해를 40개의 극저온 절제 모두에서 수행합니다. 그 후, 10개의 용해물을 결합하고 제공된 프로토콜에 따라 UR PU RNA 분리 키트를 사용하여 RNA 분리를 계속하여 11마이크로리터 RNA를 얻습니다.

일반적으로, 우리는 미세해부 조직의 양과 RNA 수율 사이의 직접적인 관계를 발견하지 못했으며, 외과의에 의한 적출과 병리학자에 의한 검사 후 췌장 표본의 동결 사이의 시간 간격의 차이는 회수된 RNA의 질과 양에 부분적으로 설명할 수 있습니다. 고려해야 할 다른 핵심 요소는 더 높은 RNA 무결성을 사용하여 더 낮은 에너지로 미세 해부에 적용되는 레이저 에너지와 레이저 초점 및 레이저 압력 절단기 포인팅 포인트의 거리입니다. 또한 접착 캡과 접착 캡 사이의 거리를 가능한 한 낮게 유지하여 RNA 양을 최적화할 수 있습니다.

레이저 미세 해부 현미경을 사용할 수 있는 경우 캡처 프로세스 중에 미세 절개 조직의 손실을 방지하십시오. 이 절차는 부분 췌장 절제술을 수행하는 모든 연구 기관에서 시행될 수 있으며, 이를 통해 비당뇨병 환자와 당뇨병 환자 모두의 인간 눈꺼풀 물질에 대한 접근성을 높일 수 있습니다.