Name: 수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 배우세요 레이저 미세절단을 이용해 수술 표본에서 인간 췌장 섬을 분리하는 방법을. 이 기술은 전사체 연구를 위한 베타세포 수집 효율을 높여줍니다.

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우리는이 프로젝트의 여러 단계에 도움, 조언과 중요한 입력을 제공하는 모든 동료에게 감사하고 싶습니다. 이 비디오 문서의 생산은 IMIDIA (의 자금이 지원 된 <a href="http://www.imidia.org" target="_blank">http://www.imidia.org</a> ), 교육 및 당뇨병 연구 독일 센터 (DZD로 연구 (BMBF)에 대한 독일의 성 <a href="http://www.dzd-ev.de" target="_blank">http://www.dzd - ev.de</a> ) 기술 드레스덴 (Dresden)의 대학에서 대학 병원 칼 구스타프 이카루스 호. 이 책자에 이르는 작품 부여 계약을 N ° 155005 (IMIDIA), 유럽 연합 (EU)의 7 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)와 EFPIA에서 금전적 인 기부로 구성되어있는 자원을 아래에 혁신적인 의약품 사업 공동 인수의 지원을 받고 있습니다 회사의 종류 기여 인치

1. 인간 췌장 조직의 동결 <ol><li> 지방 조직, 혈관, 신경 및 메스와 핀셋과 비 parenchymal 조직을 제거하고 조각 (~ 0.5-1 cm 조각)로 췌장 조직을 잘라. </li><li> Cryomold의 중심에 하나 췌장 조직 조각을 놓고, 차가운 조직 - 테크 10월 컴파운드로 완전히 커버. 그의 아래 액체 질소에 미리 냉각 2 Methylbutane와 스냅 - 동결로 덮여 있습니다 병에 Cryomold을 놔. -80 ° C.에있는 냉동 샘플을 저장 </li></ol> 2. 냉동 섹션의 작성 <ol><li> RNA의 변성을 피하기 위해 모든 단계에 걸쳐 장갑을 착용한다. </li><li> 멀리 차가운 100 % 에탄올과 RNase와 그라 이오 스탯 나이프, 표본 홀더와 붓를 청소합니다. 그라 이오 스탯 내부의 냉동 조직을 배치합니다. </li><li> 조직, 칼과 붓 -20 ° C.에 도달 할 때까지 기다리 기다리는 동안 그라 이오 스탯 챔버 내부 SuperFrost 플러스 슬라이드와 사전 시원한 그들을 레이블을조직 -20 ° C.에 도달 할 수에 대한 </li><li> 표본 홀더에있는 조직 - 테크 10월 컴파운드를 적용하고 상단에 고정 된 조직을 배치합니다. </li><li> 조직 - 테크 10월 컴파운드이 고정되면 cryoblock을 다듬과 면도날과 조직 - 테크 10월 컴파운드의 초과를 제거합니다. </li><li> 췌장 조직 블록에서 40 연속 10 μm 슬라이스 총 자른다. 또한 우리는 microdissection 과정에서 조각 안에 섬의 식별을 용이하게 할 수있는 췌장 섹션의 개요 도면에 저장되는 제 1 및 중간 조각을 절단하는 것이 좋습니다. </li><li> 칼 블레이드의 섹션 준수하여야 할 만 지역을 따뜻하게하기 위해 손가락 (장갑으로 덮여)으로 슬라이드의 뒷면을 터치하여 SuperFrost 플러스 슬라이드의 중앙에 섹션을 전송합니다. </li><li> -20에서 그라 이오 스탯 내부의 섹션 1-2 분 ° C, 당신이 드라이 아이스에 배치 슬라이드 상자에 넣어 그 이후에 말린다. 섹션을 저장-80에서 ° C. </li><li> 필요한 경우, 종이 수건과 차가운 100 % 에탄올로 칼 블레이드를 청소. </li></ol> 3. 냉동 섹션 탈수 <ol><li> 시약 준비 : 30 ML 신선하게 조리 된 70 % 에탄올, 30 ML DEPC - 처리 물, 2x30 ML 100 % 에탄올과 50 ML Cellstar 튜브 (팔콘)로 30 ML의 크실렌을 흘려, 오한과 얼음에있는 모든 시약을 (크실렌 제외) 유지. </li><li> 100 % 에탄올과 RNaseZAP와 후드 작업 공간을 청소하십시오. </li><li> 다음과 같은 과정이 cryosections가 : 얼음 차가운 DEPC - 처리 물에 5-6 빠른 딥을 씻고, 30 초에 얼음 차가운 70 % 에탄올에 해결, 크실렌의 4 분에 품다, 얼음 차가운 100 % 에탄올에 1 분에 두 번 탈수 실내 온도 (25 ° C), 3 ~ 5 분에 대한 건조 공기에서. cryosections 또 한 쌍의로이 단계를 반복합니다. </li><li> 빛과 습기에서 보호하기 위해 알루미늄 호일로 싼 50 ML Cellstar 관으로 백업 뒤로 두 건조 cryosections를 삽입합니다. </li></ol> &lt;P 클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. PALM MicroBeam, Zeiss와 베타 세포의 레이저 Microdissection <ol><li> RNaseZAP과 현미경을 청소하고 RoboMover의 접착제 모자를 탑재합니다. </li><li> 필터 세트 09 (여기 : 450-490 nm의, 방출&gt; 515 nm 정도), AutoLPC 모드, 50 %의 레이저 에너지 65 %, 레이저 초점, 100 % 레이저 속도, AutoLPC 샷 사이에 5 μm 거리, 6 μm 거리 다음 설정을 설정합니다 -10,100 : 선에 높이를 작동. </li><li> 무대에 하나의 슬라이드를 삽입합니다. </li><li> 미세 시각화 (5 배 또는 10 배 렌즈) 아래 autofluorescent 베타 세포를 찾습니다. </li><li> 40x 렌즈로 전환, &quot;자유형&quot;선택 도구를 사용하여 베타 세포를 선택하고 레이저를 사용하여 사진을 microdissect. </li><li> 한 AdhesiveCap로 4 탈진 cryosections의 조직을 캡처합니다. 1 주석 : 한 건조 cryosection의 베타 세포를 해부 할 수있는 시간이 될 것입니다 조직 섹션의 rehydration을 피하​​기 위해 10-20 분 이상이 아니어야합니다저하 RNA. 2 의견 : 검사 점으로 무대를 이동 한 후 육안 검사에 의해 성공적으로 microdissection 프로세스를 확인합니다. </li></ol> 5. Microdissected 베타 세포 농축 조직의 용해 <ol><li> RoboMover에서 AdhesiveCap를 제거합니다. </li><li> AdhesiveCap의 뚜껑과 42에서 거꾸로을 길러 ° C를 30 분에에 Pipet 10 μl 추출 버퍼 (XB, PicoPure RNA 분리 키트, 악튜러스). </li><li> 10,000 XG에서 스핀 다운 및 드라이 아이스에 lysate를 넣어. RNA 추출이 수행 될 때까지 -80 ° C에 저장합니다. </li><li> 반복 3 단계를 반복합니다.) 5.) 다른 모든 섹션과. </li></ol> 6. RNA 추출 <ol><li> 10 개의 10 μl lysates을 결합 </li><li> 70 % 에탄올 (DNase 처리 포함)에 1:1 비율 추출 버퍼 (XB)를 사용하여 PicoPure RNA 분리 키트, 악튜러스의 프로토콜에 따라 실온에서 협력하여 RNA 격리와 함께 진행합니다. </li></ol> 7. RNA 분석 <ol><li> 애질런트 2100 Bioanalyser (PicoChip)을 사용하여 품질과 수량의 분석에 대해 1 μl RNA를 사용합니다. 정량 평가는 칩 병렬로로드 표준 RNA를 참조로 이루어집니다. </li></ol>

<ol><li>Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li>
<li>Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+single+cells+from+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of single cells from complex tissues.</a> Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).</li>
<li>Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).</li>
<li>Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-quality+RNA+from+cells+isolated+by+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection.</a> Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).</li>
<li>Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Human+Islets+from+Partially+Pancreatectomized+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients.</a> J. Vis. Exp. (53), e2962(2011).</li>
<li>Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+human+pancreatic+beta-cells+and+RNA+preparation+for+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).</li>
<li>Marselli, L., Thorne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+of+Purified+%7Bbeta%7D-Cell+Tissue+Obtained+from+Human+Pancreas+with+Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection.</a> Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).</li>
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<li>Abdelli, S., Ansite, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+stress+signaling+pathways+activated+during+human+islet+preparation+and+following+acute+cytokine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure.</a> Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).</li>
<li>Negi, S., Jetha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+beta-cell+gene+expression+reveals+inflammatory+signaling+and+evidence+of+dedifferentiation+following+human+islet+isolation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture.</a> PLoS One. 7 (1), e30415(2012).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 수술 췌장 표본의 인간 섬의 레이저 microdissection (LMD)에 대한 신뢰할 수있는 접근 방법을 설명합니다. LMD 현미경을 사용할 수 있다고합니다,이 절차는이를 모두 비 당뇨병과 2 형 당뇨병 환자 과목에서 인간의 작은 섬 소재에 대한 액세스를 증가, 부분 pancreatectomies를 수행하는 연구 기관에서 구현 될 수 있습니다. 이 작은 섬 고립에 제공 pancreata의 소수 주어진 특히 해당됩니다. 의 Favourable 관점이 collagenase의 소화에 의해 작은 섬 고립에 비해 LMD하면 조직의 explantation 및 RNA 추출 7 베타 세포의 농축 7뿐만 아니라 거칠고 기계 및 효소 조작 (8)의 소지를 없애기 위해 섬의 처리 사이의 감소 시간이며, 유전자 발현 프로필을 변경 할 수 9,10. 부분적으로 pancreatectomized 환자의 경우 더 많은 임상 및 신진 대사 정보 기관...

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 2 Methylbutane (이소 펜탄) </td><td> 로스 </td><td> 3927.1 </td><td></td></tr><tr><td> AdhesiveCap (불투명, 500 μl) </td><td> ZEISS </td><td> 415190-9201-000 </td><td></td></tr><tr><td> Cellstar 튜브 (50 ML) </td><td> greiner 바이오 - 원 </td><td> 210 261 </td><td> 지원 스커트로 </td></tr><tr><td> Cellstar 튜브 (50 ML) </td><td> greiner 바이오 - 원 </td><td> 227.261 </td><td></td></tr><tr><td> 디 에틸 pyrocarbonate (DEPC) </td><td> 시그마 </td><td> D 5758 </td><td></td></tr><tr><td> 드라이 아이스 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 절대 에탄올 </td><td> VWR </td><td> 20821.310 </td><td></td></tr><tr><td> 액체 질소 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 브러쉬를 페인트 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PALM MicroBeam </td><td> ZEISS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 필 - 편도 삽입 금형 (립니다), 12 X 12mm </td><td> ProSciTech </td><td> RR12 </td><td> 탑 내부 22x22 mm, 깊이 21mm </td></tr><tr><td> 악튜러스 PicoPure 냉동 RNA 분리 키트 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> KIT 0,204 </td><td></td></tr><tr><td> 플라스틱 클램프 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 면도칼 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> RNase 무료 DNase 세트 </td><td> Qiagen </td><td> 79,254 </td><td></td></tr><tr><td> RNaseZAP </td><td> 시그마 </td><td> R 2020 </td><td></td></tr><tr><td> 메스 /외과 블레이드 </td><td> 테크노는 잘라 내기 </td><td> 2800111 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost 플러스 부착 현미경 슬라이드 </td><td> 열 과학 </td><td> J1800AMN​​Z </td><td> 25x75x1.0 mm </td></tr><tr><td> 조직 - 테크 10월 컴파운드 </td><td> 사쿠라 </td><td> 4583 또는 0807000022 </td><td></td></tr><tr><td> 족집게 </td><td> 브라운 </td><td> BD168R </td><td></td></tr><tr><td> 크실렌 </td><td> VWR </td><td> 28975.291 </td><td></td></tr></table>

수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 microdissection을위한 개선 된 프로토콜

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

레이저 microdissection (LMD)는 실질 1,2의 미세한에서 선택한 셀과 조직의 복구를 할 수있는 기술입니다. 해부 세포는 이러한 transcriptomic 또는 proteomic 연구, DNA 평가 나 염색체 분석 2,3 등 조사의 다양한 사용할 수 있습니다. LMD의 특히 어려운 응용 프로그램은 RNA (4)의 lability로 인해 셀이 같은 췌장 등의 RNases의 풍부 조직 분석하던 때 특히 눈에 띄는 될 수 transcriptome 분석이다. 대상 세포의 빠른 식별 및 수집을 가능하게 microdissection 프로토콜은 조직 처리 시간을 단축 할 수 있으며, 결과적으로, RNA의 보존을 보장하기 위해이 설정에 필수적입니다. 여기 transcriptomic 연구 5에 사용되는 수술 표본에서 인간의 췌장 베타 세포를 획득을위한 프로토콜을 설명합니다. 0.5-1에 대한 C의 췌장의 작은 조각m 3 sectioning 때까지 즉시 2 Methylbutane 차가운에 냉동 조직 - 테크 10월 컴파운드에 포함 resected의 췌장의 표본의 건강 나타나는 여백,에서 절단하고, -80에 저장 ° C 있었다. 10 μm 두께의 40 시리얼 섹션은 1-2 분의 그라 이오 스탯 내부 건조하고, -80에 저장 유리 슬라이드, ° C.에 개별적으로 전송, -20 ° C 설정에 따라 그라 이오 스탯을 삭감했다 즉시 레이저 microdissection 절차 전에 섹션은 얼음 차가운 백퍼센트에서 두 1 분 incubations하여 얼음처럼 차가워에서 수정 갓 30 초에 70 %의 에탄올을 준비, 얼음 차가운 DEPC - 처리 물에 5-6 딥으로 세척하고, 건조 된 에탄올은 4 분 동안 크실렌 (조직 탈수에 사용되는)에 의해 다음, 조직 섹션 3-5 분 동안 나중에 한 후 공기 건조했다. 중요한 것은, 모든 단계는 크실렌의 부화를 제외하고 얼음처럼 차가운 시약을 사용하여 수행되었습니다 - 이전에 설명 된 프로토콜을 6 이상 수정. UT얼음 차가운 시약의 ilization는 베타 세포의 고유 autofluorescence의 발음 증가로 이어진, 그들의 인정을 촉진. microdissection를 들어, 4 개의 섹션은 각 시간 건조했다 : 두 수분과 표백에서 조직을 보호하기 위해 호일로 싼 50 ML 튜브에 배치 된, 나머지 두 사람은 즉시 microdissected되었습니다. 이 절차는 (AutoLPC) 모드를 Catapulting 자동 레이저 압력을 채용 PALM MicroBeam 악기 (Zeiss)를 사용하여 수행되었습니다. 40-60 분보다 더 이상 필요 넷 cryosections에서 베타 세포 / 작은 섬의 해부의 완성. 셀은 한 AdhesiveCap으로 수집, 10 μl 용해 버퍼로 lysed되었습니다. transcriptomic 분석을 위해 각 단일 RNA 시료는 10 셀 microdissected 샘플, 피코 순수 RNA 절연 키트 (악튜러스)를 사용하여 RNA 추출 다음을 조합하여 얻은 것입니다. 이 프로토콜은 따라서 자신의 신속하고 정확한 인식과 C을 촉진, 인간의 베타 세포의 고유 autofluorescence을 향상ollection. 이 절차의 추가 개선 2 형 당뇨병과 관련된 변경 사항을보다 잘 이해 가능한 의미와 함께, phenotypically 다른 베타 세포의 절개를 사용하도록 설정할 수도 있습니다.

그림 1에 도시 된 바와 같이, 수정 건조 프로토콜은 이전의 게시 된 프로토콜 6에 비해 베타 세포의 autofluorescence의 개선을 이끌었다. 설명 프로토콜 적용, 39 수술 췌장 표본의 각 31&#39;544&#39;704 μm 세 조직 / 췌장 표본의 평균 (: - 81&#39;522&#39;153 μm 3 8&#39;742&#39;390 범위) 40 시리얼 cryosections를 생성하는 데 사용 된 표 1에 표시된. 이 150 μm의 직경, 또는 35,000 β-세포의 약 18 췌장 섬의 볼륨을 나타냅니다. 38 다른 섬 / 췌장 표본의 평균 (범위 : 19-80 섬)에서 유래 조직은 각각의는 일반적으로 두 개 이상의 연속 섹션에서 관찰되었다. 다른 표본 간의 섬의 수율에 큰 변화는 감지의 조직 소스, 췌장 머리 나 꼬리하거나,뿐만 아니라 운영자의 진보적 인 개선의 이질성을 반영각 섹션의 검...

레이저 microdissection은 실질의 미세한에서 선택한 셀의 복구를 할 수있는 기술입니다. 여기 transcriptomic 연구에 사용되는 수술 표본에서 인간의 췌장 섬을 획득을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리 프로토콜은 따라서 자신의 컬렉션을 촉진 인간의 베타 세포의 고유 autofluorescence을 향상시킵니다.

수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

안녕하세요, 저는 Reen Laser 기술대학교의 Thea Hands 연구소에서 근무하는 Dorte입니다. 미세절제술(Microdissection)은 매우 적은 양의 모종양으로부터 특정한 세포 집단을 얻을 수 있게 해주는 기술입니다. 절제된 세포는 전사체 및 단백질체 연구, DNA 평가 또는 염색체 분석에 사용될 수 있습니다.본 프로토콜에서는 전사체 연구에 사용하기 위해 수술 검체로부터 인간 췌장 메타 세포(meta cells)를 획득하는 방법을 제공합니다. 췌장 조직을 작은 조각으로 자릅니다. 조각 하나를 크라이오 몰드(cryo mold) 중앙에 놓고 냉각된 매몰제(embedding compound)로 덮습니다.냉각된 2-material Bhutan을 사용하여 조직을 즉시 동결시킨 후 -80 °C에서 보관하십시오. 40개의 접착 슬라이드에 라벨을 붙이고 냉각 챔버 내에서 미리 냉각시킵니다. 크라이오 블록을 트리밍한 후 OCT 화합물을 사용하여 표본 홀더에 동결 조직을 고정하십시오.10 µm 두께의 절편을 40장 제작합니다. 슬라이드 뒷면을 손가락으로 터치하여 절편을 놓을 위치만 따뜻하게 데운 후, 절편 한 장을 슬라이드 위로 옮깁니다. 절편들을 크라이오데크(cryo-desk) 내부에서 2~3분간 건조시킨 후 -80 °C에서 보관합니다. 염색 시약을 준비하고, 셀라인(seline)을 제외한 모든 액체는 얼음 위에서 냉각합니다. 이렇게 하면 미세 절제 전 PET 세포의 고유 자가형광이 증가하게 됩니다.매회 4개의 섹션을 탈색합니다. 한 번에 2개의 섹션을 처리하십시오. 먼저 70% ethanol에 30초 동안 고정합니다.그 다음, DPC 처리된 물에 5~6회 빠르게 담가 절편을 세척합니다. 조직을 100% ethanol에서 1분 동안 탈수하고 이 단계를 반복한 후, 슬라이드를 seline에 4분 동안 배양합니다.그동안 다른 한 쌍의 절편에 대해 탈수를 시작하십시오. 마지막으로, 암실에서 슬라이드를 3~5분 동안 공기 건조합니다. 두 슬라이드를 서로 맞닿게 하여 호일로 감싼 50 ml 튜브에 넣어 조직이 습기에 노출되지 않도록 하고 자가형광이 퇴색되지 않도록 보호하십시오. 절편을 준비하기 전, RNAs away로 현미경을 세척하고 접착 캡을 robo Mover에 고정하십시오.슬라이드를 스테이지에 삽입하고, 섹션에 닿지 않도록 캡을 그 위로 가깝게 이동시킵니다. 자가형광을 띠는 베타 세포 영역을 확인하여 아이렛(eyelets)의 위치를 찾습니다. 본 설정에서 인간 베타 세포의 고유 자가형광은 노란색으로 나타나는 반면, 췌관은 밝은 녹색 자가형광을 보입니다.자유 선택 도구(free hand selection tool)를 사용하여 적절한 세포 영역을 선택하고, 레이저를 작동시켜 미세 절제합니다. 40분에서 60분 이내에 4개의 저등급 동결 절편의 아이렛(eyelets) 부분을 하나의 접착 캡으로 절제하여 수집하십시오. 필요한 경우, 캡을 현미경의 체크포인트로 이동시켜 수집된 조직을 확인하십시오.로보 무버(robo mover)에서 캡을 꺼내고, 세포 파쇄를 위해 캡의 뚜껑 부분에 10 µL의 추출 버퍼를 넣습니다. 캡을 뒤집은 상태로 42 °C에서 30분 동안 배양합니다.용해물을 원심 분리하여 침전시킨 후, 튜브에 라벨을 부착하고 RNA 추출 전까지 -80 °C에서 보관하십시오. 40개의 모든 cryo dissect에 대해 레이저 미세 절단 및 용해를 수행하십시오. 그 후, 10개의 용해물을 합치고 제공된 프로토콜에 따라 UR PU RNA isolation kit를 사용하여 RNA 분리를 진행하여 11 µL의 RNA를 얻으십시오.일반적으로, 마이크로디섹션 조직의 양과 RNA 수율 사이에 직접적인 상관관계는 발견되지 않았습니다. 외과의의 조직 채취 시점부터 병리 의사의 검사 후 췌장 표본을 동결하기까지의 시간 간격 차이가 회수된 RNA의 질과 양에 부분적으로 영향을 미쳤을 수 있습니다. 고려해야 할 다른 주요 요인으로는 마이크로디섹션에 적용된 레이저 에너지(에너지가 낮을수록 RNA 무결성이 높음), 레이저 초점 및 레이저 압력 커터의 지향 지점 간 거리가 있습니다. 또한, 접착 캡과 샘플 사이의 거리를 최대한 짧게 유지함으로써 RNA 양을 최적화할 수 있습니다.레이저 미세 절단 현미경을 사용할 수 있는 경우, 포획 과정 중 미세 절단된 조직의 손실을 방지하십시오. 이 절차는 부분 췌장 절제술을 시행하는 모든 연구 기관에서 구현될 수 있으며, 이를 통해 비당뇨 및 당뇨 환자 모두로부터 인간 눈꺼풀 조직 샘플에 대한 접근성을 높일 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

연구 2 형 당뇨병 아일 레츠의 공급 부족이다. 여기 부분 pancreatectomy를 겪고 환자에서 아일 레츠를 분리를위한 프로토콜을 공유할 수 있습니다. 이 방법은 제 2 형 당뇨병 환자에서 아일 레츠을 얻기위한 독특한 장소를 나타내며 임상 기초 및 임상 연구에 적합한 숫자가 아닌 당뇨병 과목과 일치.

부분 Pancreatectomized 환자에서 인간 아일 레츠의 분리

이 비디오는 hematoxylin 및 eosin (H &amp; E)과 immunohistochemistry (IHC)을 사용하여 인간의 췌장 islets의 특성화를위한 절차를 설명합니다. 머리, 몸, 그리고 꼬리 지역의 췌장 부분은 섬 내분비 성분 (인슐린, 글루카곤, 그리고 췌장 폴리펩티드), 세포 복제 (Ki67) 및 염증 infiltrates (H &amp; E, 인 경우에는 3 번 CD)를 결정하기 위해 H &amp; E와 IHC 모두가 묻은 게있다. uncinate 지역은 췌장 폴리펩티드에 대한 IHC를 사용하여 지역화된됩니다.

인간의 췌장 Islets위한 염색법 프로토콜

랑게르한스의 고립 된 마우스 독도를 이용하여 체외 β-세포 기능을 시금 당뇨병의 병태 생리 및 치료의 연구에 중요한 구성 요소입니다. 많은 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있지만,이 프로토콜은 특히 β-세포의 기능을 결정하는 중요한 매개 변수로 세포 내 순환 아데노신 monophosphate (캠프)의 측정에 대해 설명합니다.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

췌 장 섬 microvascular vasomotion 섬 혈액 분포를 조절 하 고 섬 β 세포의 생리 기능을 유지 합니다. 이 프로토콜은 췌 장 섬 microvascular vasomotion에 vivo에서 의 기능 상태를 확인 하 고 췌 장 섬 미세 췌 장 관련 질병에의 기여를 평가 하는 레이저 도플러 모니터를 사용 하 여 설명 합니다.

레이저 도플러: 췌 장 섬 Microvascular Vasomotion에 Vivo에서 측정 하기 위한 도구

여기, 우리는 프로토콜 사용 하 여 3 차원 (3D) 이미지 인간의 췌 섹션을 최적화 수동 삭제 방법 제시. 이 원고에서는 수동 광 비운 뒤에 여러 면역 형광 인간의 독도 innervating 자율 고 감각 신경 네트워크의 핵심 요소를 식별 하기 위해 얼룩에 대 한이 절차를 보여 줍니다.

인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징

이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

췌 장 섬 연구 비보 전 당뇨병 연구에 대 한 중요 하다. 기존 기술을 그들의 네이티브 3 차원 건축 교양된 독도 공부 시간이 소요, 비효율적이 고, 자주 사용 됩니다. 이 작품 전체 교양된 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하기 위한 새로운 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다.

췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

이 프로토콜은 1차 인간 아일렛 샘플로부터의 베타 세포에서 특히 미토파지 단백질 복합체 형성의 정량적 분석을 위한 방법을 간략하게 설명한다. 이 기술은 이렇게 귀중한 인간 췌장 베타 세포 견본에서 결정적인 한정된 생물학 물자에서 mitophagy의 분석을 허용합니다.

근접 결찰 분석분석서를 활용한 인간 췌장 베타 세포에서 내인성 미토파기 복합체의 시각화

이 연구는 암소 생리학 및 아슬레 면역 세포 상호 작용의 연구에 살아있는 췌장 조직 조각의 응용 프로그램을 제시한다.

살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰

우리는 급성 췌장 조직 조각의 준비와 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사에서의 사용을 제시하여 많은 수의 살아있는 세포, 오랜 기간 동안 그리고 높은 시공간 분해능으로 칼슘 역학을 동시에 연구합니다.

급성 마우스 췌장 조직 조각에서 칼슘 역학의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사

배우세요 레이저 미세절단을 이용해 수술 표본에서 인간 췌장 섬을 분리하는 방법을. 이 기술은 전사체 연구를 위한 베타세포 수집 효율을 높여줍니다.

수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

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