미생물 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 바이오리액터: 제작, 시스템 설정 및 작동

본 실험 절차의 전반적인 목표는 미세 유체 배양 장치를 사용하여 일정한 환경 조건 하에서 단일 박테리아 및 진화하는 동형 미세군집(isogenic microcolonies)을 완전한 공간적 및 시간적 해상도로 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 CAD 소프트웨어를 사용하여 미세 유체 배양 시스템을 설계합니다. 그 다음, 박테리아가 단층으로 성장하도록 높이를 1 micron으로 제한한 피코리터 바이오리액터가 포함된 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane) 재질의 일회용 미세 유체 배양 장치를 제작합니다.

그런 다음 미생물 배양액을 미세유체 장치에 주입하여 바이오리액터 내에 단일 모세포를 접종합니다. 이 세포들은 시스템을 통해 성장 배지를 지속적으로 주입함으로써 증식됩니다. 산업적으로 중요한 Corynebacterium glutamicum 균주의 배양, 성장 데이터 및 세포 간 이질성을 보여주는 자동 타임랩스 현미경 관찰을 통해 결과를 얻습니다.

전통적인 생명공학에서 대부분의 분석은 평균 데이터에 기반합니다. 당사의 미세유체 장치는 시공간적 해상도를 통해 개별 박테리아의 단일 세포 분석을 가능하게 합니다. 이는 이소제닉(isogenic) 마이크로콜로니의 세포 간 이질성을 면밀히 관찰하는 데 유용한 도구입니다.

당사는 일반적인 SU-8 포토리소그래피와 폴리디메틸실록산 칩 몰딩 공정을 적용하여 서브 마이크론 미디어 해상도를 갖는 일회용 미세유체 소자를 제작합니다. 당사는 Escherichia coli 및 Corynebacterium glutamicum과 같은 여러 생명공학 미생물을 통해 이 기술을 성공적으로 입증하였습니다. 우선, CAD 소프트웨어를 사용하여 미세유체 소자를 설계하십시오.

본 프로토콜에서 제시하는 설계는 두 개의 시딩 입구, 두 가지 서로 다른 기질을 혼합하기 위한 구배 생성기, 하나의 출구, 그리고 각각 5개의 바이오 리액터로 구성된 6개의 어레이로 이루어져 있습니다. 클린룸에서 4인치 실리콘 웨이퍼를 준비하고, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 1 µm 두께의 SU-8 2000.5 포토레지스트를 웨이퍼 위에 스핀 코팅합니다. 코팅된 웨이퍼를 95 °C의 핫 플레이트 위에 올려 과잉 용매를 제거한 다음, 피코리터 리액터의 트래핑 영역이 포함된 첫 번째 레이어 포토 마스크와 코팅된 웨이퍼를 마스크 얼라이너 내부에 삽입합니다.

그런 다음, 진공 접촉 모드에서 웨이퍼를 350에서 400 nanometer 광원에 7 milliwatts per square centimeter의 강도로 3초 동안 노광합니다. SU-8의 중합 반응을 개시하기 위해 95 °C로 설정된 수평 핫플레이트에서 노광 후 베이크(post-exposure bake)를 수행합니다. 다음으로, 웨이퍼를 SU-8 현상액 조에 1분 동안 담근 후, 신선한 SU-8 현상액이 담긴 두 번째 용기로 웨이퍼를 옮겨 몇 초 동안 처리합니다.

웨이퍼를 이소프로판올로 헹구어 SU-8 현상액을 제거하고, 질소 기류 또는 웨이퍼 스피너를 사용하여 웨이퍼를 건조합니다. 그 다음, 150 °C에서 10분 동안 웨이퍼를 하드 베이크합니다. 이어서, 마스터 몰드를 완성하기 위해 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 두 번째 층을 제작합니다.

베이스와 경화제를 10:1 비율로 혼합하여 PDMS 칩 제작을 시작합니다. 모든 기포가 사라질 때까지 진공 데시케이터 내부에서 PDMS 혼합물을 약 30분 동안 탈기합니다. 그 다음, SU-8 웨이퍼를 몰딩 장치에 넣고 웨이퍼 위에 PDMS 혼합물을 3 mm 두께로 붓습니다.

그 다음, PDMS를 오븐에서 80 °C로 3시간 동안 굽습니다. 식힌 후, 웨이퍼에서 PDMS 슬래브를 조심스럽게 떼어내고, 깨끗하고 날카로운 메스를 사용하여 슬래브를 개별 칩으로 자릅니다. 칩을 n-pentane 용액에서 90분 동안 세척한 후, 이어서 아세톤 세척 용액에서 각각 90분씩 두 번 세척합니다.

용매 잔여물을 제거하기 위해 칩을 하룻밤 동안 건조합니다. 실험 직전에, 튜빙과 PDMS 칩을 연결하는 데 사용되는 커넥터보다 직경이 약간 작은 바늘이나 홀 펀처를 사용하여 PDMS 칩에 입구와 출구 구멍을 뚫습니다. 그다음, 마이크로플루이딕 PDMS 칩을 이소프로판올로 조심스럽게 세척하고 스카치테이프를 사용하여 부착된 먼지 입자를 제거합니다.

또한, 170 micron 두께의 얇은 유리 슬라이드를 먼저 아세톤, 이소프로판올, 그리고 탈이온수 순으로 세척한 후, 질소 기류로 슬라이드를 건조합니다. 세척 및 건조가 완료되면, 50 Watts의 전력과 20 sccm의 산소 유량을 사용하여 유리 슬라이드와 PDMS 칩을 25초 동안 플라즈마 산화시킵니다. 그 다음, PDMS와 유리 칩의 정렬을 세심하게 맞춘 후 PDMS를 유리 위에 배치하면 수 초 내에 결합됩니다.

설정된 장치를 80 °C에서 10초 동안 가열하여 결합을 고정합니다. 칩 실험을 위해 박테리아를 준비하려면, C.glutamicum과 같은 원하는 박테리아 균주의 단일 콜로니를 20 mL의 신선한 BHI 배지에 접종하고, 120 RPM의 회전 쉐이커를 사용하여 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 스타터 배양액 10 µL를 원하는 배지 20 mL가 들어 있는 두 번째 배양액에 옮기고, 동일한 조건에서 세포를 하룻밤 동안 성장시킵니다.

다음 날, 도립 현미경의 인큐베이터를 30 °C로 예열합니다. 이는 개별 설정에 따라 최대 2시간이 소요될 수 있습니다. 설정이 예열되는 동안, 인큐베이터를 열고 원하는 대물렌즈를 선택한 후 필요한 마운팅 매질로 준비합니다.

그런 다음, 칩을 칩 홀더 내부에 장착하고 단단히 고정합니다. 현미경에서 시료의 중심을 맞춘 후 피코리터 바이오리액터 어레이에 초점을 맞춥니다. 칩의 초점이 맞으면 적절한 튜빙을 사용하여 입구와 출구를 연결하고, 출구 튜빙을 폐액 저장조에 넣습니다.

다음으로, 시린지에 신선한 배지를 채워 시린지 펌프에 장착하고, 칩을 프라이밍하기 위해 200 nanoliters per minute의 유속으로 1시간 동안 미세유체 채널을 헹굽니다. 세포가 여전히 초기 대수 성장기에 있을 때, 박테리아 배양액 1 milliliter를 멸균 시린지로 옮기고, 배지가 들어 있던 시린지와 튜빙을 세포 현탁액과 신선한 튜빙으로 교체합니다. 대부분의 picoliter 바이오리액터가 채워질 때까지 200 nanoliters per minute의 부피 유량으로 세포 현탁액을 채널에 주입합니다.

소수의 바이오리액터만 채워지는 경우에는 유속을 분당 800~1200 nanoliters로 높입니다. 원하는 양의 세포가 시딩되면 세포 현탁액 연결을 해제하고, 칩에 성장 배지를 다시 연결한 후 분당 100 nanoliters의 속도로 신선한 배지를 관류합니다. 그다음, 칩을 스캔하고 타임랩스 이미징을 수행할 특정 바이오리액터를 선택합니다.

그 다음, 바이오리액터를 처음부터 끝까지 촬영하고 실험을 시작하기 위해 타임랩스 현미경 시퀀스를 설정하십시오. 모든 피코리터 바이오리액터 내의 세포가 과성장하면 실험을 중단하고 칩을 적절하게 폐기하십시오. 분석을 시작하려면 먼저 모세포의 수와 위치 등 실험에 필요한 모든 기준을 충족하는 바이오리액터가 무엇인지 결정하십시오.

Image J와 같은 분석 프로그램을 사용하여 각 시점의 세포 수를 측정함으로써 각 미세집락의 성장률을 결정합니다. 시간과 세포 수의 로그 값을 그래프로 나타내어 최대 성장률을 계산합니다. 본 연구에서 제시한 시스템은 성장, 형태 또는 형광 신호와 같은 다양한 생물학적 파라미터와 관련하여 여러 박테리아 종을 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

본 예시에서는 standard cultivation conditions 하에서 C.glutamicum을 배양하였으며, 세 개의 isogenic microcolonies로부터 도출된 성장 곡선을 여기에 나타내었습니다. picoliter bioreactors는 여기에 제시된 바와 같이 time-lapse fluorescence microscopy를 이용한 단백질 생산량 측정에도 유용한 것으로 입증되었습니다. 단백질 유도제인 IPTG를 저농도로 세포에 처리함으로써, 단일 모세포로부터 시작된 colony 내에서 단일 세포 수준의 단백질 세포 간 변이를 연구할 수 있습니다.

시연된 기술은 완벽한 환경 제어 하에 단일 박테리아 세포를 모니터링하고 분석하는 데 적용될 수 있습니다. 이는 기존의 벤치 규모 배양 시스템으로는 거의 불가능한 작업입니다. 이 영상을 시청하고 나면, 유사한 단일 세포 분석을 수행하기 위한 미세유체 배양 칩을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.