흑색종과 편평상피암 줄기세포를 이용한 새로운 수지상 세포 백신의 생성

이 절차의 전반적인 목적은 면역 기능이 정상인 숙주에서 암 줄기세포(cancer stem cell, CSC) 또는 CSC 기반의 수지상 세포(dendritic cell, DC) 백신의 항종양 면역력을 평가하는 것입니다. 이는 우선 이질적인 종양 세포로부터 aldehyde dehydrogenase 양성 또는 A LDH high CSC를 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 CSC DC를 분리한 후, 백신 제작을 위해 용해물(lysate)로 펄싱(pulsing)합니다.

다음으로, CSC 용해물 펄스 DC 또는 TP DC 백신을 정상 동계 면역능력 보유 숙주에게 투여합니다. 그런 다음 마지막 단계에서 C-S-C-T-P-D-C 백신의 항종양 보호 효능을 평가합니다. 최종적으로, 숙주 T세포와 항체에 의한 C-S-C-T-P-D-C 백신 유도 항 CSC 면역력을 평가하기 위해 ELISPOT을 수행할 수 있습니다.

본 프로젝트는 암 연구에서 가장 흥미로운 두 분야인 암 줄기세포 분야와 종양 면역치료 분야를 결합하였습니다. 저희 연구실은 고형암에서 암 줄기세포를 최초로 발견한 곳 중 하나입니다. 암 줄기세포는 암의 성장뿐만 아니라 전이를 주도하는 암의 씨앗과 같습니다.

오늘 보실 내용은 면역 요법을 사용하여 이러한 암 줄기세포를 특이적으로 표적하는 새로운 접근 방식입니다. 저희는 Alde fluoro assay를 통해 검출 가능한 aldehyde dehydrogenase라는 특정 마커를 활용합니다. Lin Liu 박사와 Huon Tau 박사가 Chow Lee 박사와 함께 연구하는 모습을 보시게 될 것입니다.

이러한 암 줄기세포를 표적으로 함으로써 다양한 종류의 암 환자들의 치료 결과를 개선할 수 있기를 기대합니다. 먼저, 대상 종양 세포를 assay buffer에 1×10⁶ cells/mL 농도로 부유시킵니다. 그런 다음, 종양 세포 현탁액 중 3mL를 제외한 나머지를 각각의 샘플 튜브로 옮기고, 네 개의 12×75mm 폴리스티렌 대조군 시험관에 unstained, ALOR, ALOR plus DEAB, 7-AAD라고 각각 라벨을 붙입니다. unstained 및 7-AAD 튜브에는 세포 현탁액 1mL를, ALOR 튜브에는 2mL를 분주합니다.

그런 다음 ALOR plus DEAB 튜브에 DEAB 5 µL를 추가합니다. 튜브를 얼음에 두고, ALOR 튜브에 활성화된 ALOR 기질 10 µL를 넣어 혼합합니다. 즉시 기질 용액 1 mL를 ALOR plus DEAB 튜브로 옮긴 후, 각 샘플 튜브에 세포 100만 개당 활성화된 ALOR 기질 2 µL를 추가합니다.

모든 튜브를 37 °C 항온수조에서 30분 동안 배양한 후, 7-AAD 튜브에 7-AAD 5 µL를 첨가하고 각 샘플 튜브에는 세포 100만 개당 7-AAD 1 µL를 첨가합니다. 이 튜브들을 4 °C에서 10분 동안 유지합니다. 모든 튜브를 상온에서 250 ×g로 5분 동안 원심분리하고, 펠릿을 AldeFluor 분석 버퍼에 재부유시켜 형광 활성 세포 분류(FACS)를 수행합니다.

분류 게이트를 설정하려면, alde Fluor plus DEAB 세포를 음성 대조군으로 사용하고, seven A a D 염색 세포를 생존능 대조군으로 사용하십시오. 이 대조군들을 바탕으로 alor 양성 A LDH, high D five 및 SCC seven 세포를 구별하는 게이트를 설정하십시오. 그런 다음 이를 사용하여 샘플 세포를 alor 양성 A LDH, high D five 및 SCC seven 집단으로 분류하십시오.

수지상 세포를 생성하려면 먼저 C 57 black six 및 C3 H 마우스에서 대퇴골과 경골을 분리합니다. 실온에서 75% ethanol로 1분 동안 뼈를 멸균한 후 HBSS로 세척합니다. 다음으로 뼈의 끝부분을 잘라내고, 21 gauge 바늘이 장착된 10 milliliter 주사기를 사용하여 골수를 페트리 접시에 밀어냅니다. 세포를 몇 번 흡입하고 분사하여 단일 세포 현탁액을 만든 후 세포를 원심 분리합니다.

펠렛을 5 mL의 적혈구 용해 버퍼(red blood cell lysis buffer)에 넣어 37 °C 항온수조에서 1분 동안 배양합니다. 세포 수를 측정한 후, G-M-C-S-F와 IL-4가 첨가된 배양액을 사용하여 세포 농도를 1 × 10⁶ cells/mL로 조정합니다. 그다음 37 °C, 5% CO2 조건에서 세포를 배양하며, 3일마다 배지와 사이토카인을 교체해 줍니다.

5일 차에 미성숙 수지상 세포를 수확합니다. 세포를 원심 분리하여 가라앉힌 후, 펠릿을 5 mL의 배양액에 재현탁하고, 새로 준비한 분리 배지 위에 세포 현탁액을 천천히 층상으로 쌓습니다. 다시 한번 세포를 원심 분리한 후, 배양액 층과 분리 배지 층 사이에 형성된 수지상 세포를 수집합니다.

그 후 세포 수를 측정한 다음, G-M-CSF와 IL-4가 첨가된 배지에서 1×10⁶ cells/mL 농도가 되도록 부피를 조절합니다. 이제 분리된 세포를 4회 빠르게 동결-해동 반복 처리한 후, 원심분리를 통해 용해물의 막 성분을 수집하여 종양 용해물을 제조합니다. 그런 다음, 분리된 자가 A LDH high 세포 유래 용해물로 DCS를 펄싱하여 CSC TPC를 준비합니다.

H-T-P-D-C 펄스를 준비하려면, 실험 대상 동물을 백신 접종하기 위해 정렬되지 않은 이질적 종양 세포 용해물이 포함된 DC를 준비합니다. 100 µL의 PBS에 현탁된 1×10⁶개의 펄스 세포를 각 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하 주사합니다. 백신 접종 후, C57BL/6 수용 마우스에 100 µL의 PBS에 포함된 1×10⁵개의 이질적 D5 종양 세포를 정맥 투여하여 챌린지합니다. SCC7 모델의 경우, DC 백신 접종 반대편에 100 µL의 PBS에 포함된 1×10⁶개의 정렬되지 않은 SCC7 종양 세포를 C3H 수용 마우스에 피하 주사하여 챌린지합니다.

수혜 C3 H 마우스의 비장으로부터 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 그 다음, 적절한 자극제가 첨가된 배양액 내에서 고정화된 anti CD three 및 anti CD 28 단클론 항체를 사용하여 비장의 t 세포와 B 세포를 활성화합니다. 4일 후, 상층액을 수집하고 interferon gamma, G-M-C-S-F 또는 IgG에 대한 항체를 4°C에서 하룻밤 동안 Eliza 플레이트에 코팅합니다. 다음 날, 비특이적 결합을 차단하고 표준 물질과 방금 수집한 상층액을 플레이트에 분주한 후 실온에서 배양합니다. 세척 후, HRP 검출 항체를 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 다음 TMB 기질을 첨가합니다.

마지막으로 반응을 중단시킨 후 30분 이내에 ELISA 플레이트 리더를 사용하여 450 nanometers에서 흡광도를 측정합니다. Alor는 D5 및 SCC7의 두 가지 암 줄기세포 농축 집단을 포함하여 여러 악성 종양에서 줄기세포를 분리하는 마커로 사용되어 왔으며, 특히 이 도트 플롯(dot plot)에서 입증된 바와 같이, Alor 양성 세포는 배양된 D5 및 SCC7 종양 세포주의 각각 약 0.5%와 5.2%를 차지합니다. 갓 수확한 종양 세포 또한 in vivo에서 생성된 D5 및 SCC7 종양에서 각각 2.5%와 4.2%의 Alor 양성 세포를 포함하는 것으로 확인되었습니다.

D-E-A-B-A 특이적 A LDH 억제제로 처리한 종양 세포를 음성 대조군으로 사용하였습니다. 암 줄기세포의 면역원성은 앞서 입증한 백신 접종 모델을 사용하여 CSC TPC에 의해 유도된 보호 항종양 면역을 조사함으로써 평가하였습니다. 이 표에 나타난 바와 같이, H TPC를 투여한 마우스는 PBS만 투여한 마우스보다 폐 전이가 적게 발생하였습니다.

중요한 점은, CSCT PC를 처리한 마우스가 H-T-P-D-C 또는 PBS만 처리한 동물보다 폐 전이가 여전히 더 적었다는 것입니다. SCC seven 모델에서, 대조군과 비교하여 일반 C3 H 동물에게 앞서 입증한 것과 동일하게 백신 접종을 실시했습니다. H TPC는 완만한 항종양 면역을 유도한 반면, CSC TPC는 유의미한 종양 성장 억제를 유도했습니다. 이러한 결과는 종양 세포의 공격에 대해 보호 면역을 유도하기 위해, CSC가 전통적인 비분리 종양 세포보다 DC 로딩을 위한 더 효과적인 항원원으로 사용될 수 있음을 나타냅니다.

관찰된 CSC 유도 항종양 면역 보호 기전을 더욱 깊이 이해하기 위해, DC 백신 접종 동물의 세포를 활성화하고 앞서 시연한 대로 ELISA를 통해 사이토카인 생성을 측정했습니다. 그 결과, D5 CSC TPCs 또는 SCC7 CSC PCs를 접종한 동물에서 수확한 세포의 사이토카인 생성이 D5 HTPCs 또는 SCC7 HTCs를 접종한 동물에서 수확한 세포보다 유의하게 높게 나타났습니다. 지금까지 Alor 분석법을 사용하여 암줄기세포를 분리하는 방법을 살펴보았습니다.

이렇게 분리된 암 줄기세포는 수지상 세포를 이용한 면역 요법을 개발하는 데 사용될 수 있습니다. 이러한 면역 요법이 단독으로 사용되거나 기존 치료법과 병용하여 사용됨으로써 다양한 종류의 암 환자들의 예후를 개선할 수 있기를 기대합니다.