Name: 흑색종과 편평상피암 줄기세포를 이용한 새로운 수지상 세포 백신의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 배우세요 암 줄기세포 기반 수지상 세포 백신을 이용한 항종양 면역 유도 방법을. ALDH 높은 세포를 분리하여 백신을 제조하고 면역 반응을 평가하는 이 기법은 암 면역치료 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 미시간 대학 종합 암 센터의 윌과 Jeanne Caldwell 부여 연구 기금에 의해 지원되었다 부분적으로 NIH 보조금 CA82529 및 길슨 Longenbaugh 재단에 의해.

1. 알데플루어 염색
<ol><li>세포 샘플 준비: 배양된 종양 세포 또는 갓 수확한 종양 샘플에서 종양 세포의 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 세포를 계산하고 ALDEfluOR 분석 버퍼에서 1 x 106 세포/ml의 농도로 세포 현탁액을 조정합니다.</li>
	<li>다음과 같이 컨트롤 튜브로 4 개의 12mm x 75mm 폴리스티렌 테스트 튜브라벨 : #1: 알데플루오르 #2, #3: ALDEFLUOR 플러스 DEAB, 및 #4: 7AAD.</li>
	<li>이러한 제어 튜브의 경우 1ml 셀 서스펜션을 #1 #4 넣고 튜브 #2 2ml를 넣습니다. 튜브 #3 5 μl DEAB (ALDH 억제제)를 추가하고 얼음을 유지합니다. 그런 다음 10 μl 활성 ALDEfluOR 기판을 튜브 #2 넣고 혼합물 1ml를 튜브 #3 즉시 전달합니다.</li>
	<li>동시에, 알데플루오 분석 버퍼에서 1 x 106 세포/ml에서 나머지 세포(샘플 튜브)에 백만 세포당 2μl 활성 ALDEFLUOR 기판을 추가합니다.</li>
	<li>37°C 수조에서 30분 동안 4개의 제어 튜브와 샘플 튜브를 모두 배양합니다.</li>
	<li>인큐베이션에 따라, 제어 관 #4 5 μl 7AAD를 추가하고, 샘플 튜브에 1 μl 7AAD 1 x 106 세포를 추가합니다. 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>원심 분리기는 250 x g에서 5 분 동안 모든 튜브를 제거하고 상류체를 제거합니다.</li>
	<li>알데플루오 분석 버퍼에서 세포를 다시 중단합니다.</li>
	<li>유동 세포측정 기반 정렬을 수행합니다.</li>
	<li>DEAB로 처리된 ALDEFLUOR-스테인드 세포를 사용하여 선별 게이트를 음의 대조군으로 설정하고 생존 가능성을 조절하기 위해 프로피듐 요오드(PI) 7AAD-스테인드 셀을 설정합니다. 이러한 컨트롤에 기초하여, ALDEFLUOR+/ALDH높은,D5 및 SCC7 세포를 구별하기 위해 게이트가 설치되었다. 이러한 게이트는 ALDEFLUOR+/ALDH높은 D5 및 SCC7 세포를 위해 위에서 준비된 모든 샘플 세포를 정렬하는 데 사용됩니다.</li>
</ol>2. 암 줄기 세포 용해 성 수지상 세포 (CSC-TPDC) 백신 의 준비
<ol><li>CO2 및 상립 대퇴골 및 경골 뼈를 사용하여 마우스 (syngeneic B6 및 C3H, 각각)를 안락사시합니다.</li>
	<li>실온에서 1 분 동안 75 % 에탄올에 뼈를 넣습니다. 그런 다음 HBSS를 사용하여 뼈를 씻으시면 됩니다.</li>
	<li>뼈를 잘라 내고 21 G 바늘과 10ml 주사기를 사용하여 세포를 접시에 밀어 넣습니다.</li>
	<li>주사기를 사용하여 세포를 흡인시키고 날려 단일 세포 현탁액을 만듭니다.</li>
	<li>원심분리 후 1,500rpm에서 5분 동안, 상체를 폐기하십시오. 그런 다음 RBC 용해 버퍼 5ml를 추가하여 37°C 수조에서 1분 동안 RBC를 용해합니다.</li>
	<li>셀 수를 카운트하고 10 ng/ml GM-CSF 및 10 ng/ml IL-4를 포함하는 완전한 매체(CM)에서 1백만 개의 세포/ml 농도로 세포 현탁액을 조절한다.</li>
	<li>세포를 배양하고 CM 플러스 IL-4 및 GM-CSF를 3 일 후에 보상합니다.</li>
	<li>5일째에는 미숙한 수지상 세포(DC)를 수확하고 4.2ml 용액 C+ 1ml OptiPrep 밀도 그라데이션 배지를 함유한 DC 절연 배지를 준비한다.</li>
	<li>5ml CM의 세포 펠릿을 중단합니다. 셀 서스펜션을 격리 배지에 천천히 넣습니다. 실온에서 2,000 rpm의 원심분리기.</li>
	<li>CM과 격리 매체 사이에 DC를 수집합니다. 셀 수를 카운트하고 10 ng/ml GM-CSF 및 10 ng/ml IL-4를 포함하는 배양 배지에서 1백만 개의 세포/ml 농도로 세포 현탁액을 조절한다.</li>
	<li>배양 배지에서 ALDH높거나 정렬되지 않은 D5 또는 SCC7 세포를 일시 중단하고 급속동결 해동 노출에 4회 인하여 종양 용액을 준비한 다음 5분 동안 ~100 x g에서 스핀을 하여 용액의 막 부분을 수집한다.</li>
	<li>CSC-TPDC를 준비하려면 자가 알DH고세포의 용액으로 DC를 펄스합니다. H-TPDC를 준비하려면 분류되지 않은 이질성 종양 세포용재로 DC를 펄스합니다. DC와 종양 세포 리스의 비율은 동일합니다.</li>
</ol>3. 예방 접종 및 효능 평가
<ol><li>2,500D5 CSC-TPDC 또는 D5 H-TPDC 종양 세포를 피하(s.c)로 각각 정상 B6 마우스를 예방접종한다. 5,000 SCC7 CSC-TPDC 또는 SCC7 H-TPDC 종양 세포를 각각 접종하여 정상 C3H 동물 s.c.</li>
	<li>예방 접종 후, 이질D5 종양 세포 i.v. CO20 일 후 CO를 사용하여 마우스를 안락사시키는 이질D5 종양 세포로 B6 마우스에 도전하십시오. 폐를 수확하고 폐 전이를 예추합니다.</li>
	<li>SCC7 모델에서, DC 백신의 반대편에 .c 분류되지 않은 SCC7 종양 세포로 C3H 마우스에 도전한다. 종양 크기를 모니터링합니다.</li>
	<li>실험이 끝나면 CO2를사용하여 B6 및 C3H 마우스를 안락사시한다. 첫 번째 백신 후 34 일째에, CO2로마우스를 안락사시키고 동시에 무균 시술로 각 그룹의 비장을 수집합니다.</li>
	<li>고동된 안티 CD3 플러스 hrIL-2 또는 LPS 플러스 안티 CD40 (FGK45) mAb 배분을 포함하는 CM에서 안티 CD28 mAbs와 비장 T 및 / 또는 B 세포를 활성화합니다.</li>
	<li>활성화 후, 슈퍼 나츠퍼를 수집하고 ELISA 분석에 사용합니다.</li>
	<li>ELISA 분석의 경우, 4°C O/N에서 IFNγ, GM-CSF 및 IgG용 항체를 가진 코트 플레이트.</li>
	<li>차단 버퍼를 적용한 후 샘플 및 표준을 추가하고 실온에서 배양합니다.</li>
	<li>플레이트를 세척하고 인큐베이션을 위해 HRP 검출 항체 및 TMB 기판을 추가합니다.</li>
	<li>반응을 중지한 후 30분 이내에 450nm에서 ELISA 플레이트 판독기의 흡광도를 측정합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1%2Fp53-mediated+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li>
<li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li>
<li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoresistant+colorectal+cancer+cells%2C+the+cancer+stem+cell+phenotype%2C+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li>
<li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice%3A+an+opposite+effect+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li>
<li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li>
<li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li>
<li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine%3A+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li>
<li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li>
<li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li>
<li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li>
<li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li>
</ol>

STEMCELL Technologies는 오픈 액세스 게시 수수료를 지원했습니다.

SCID 마우스와 같은 면역 손상된 호스트는 호스트 내의 적응성 면역의 부족으로 인해 CSC의 면역 학적 평가를 배제합니다. 이 연구에서는, 우리는 면역 무능한 호스트에 있는 CSCs의 면역genicity를 평가했습니다, 이는 환자 설정을 더 밀접하게 모방할 수 있었습니다. 농축 된 CSC는 면역 원소이며 선택되지 않은 종양 세포 용해 성 DC에 비해 백신으로 그들의 lysates가 DC에 로드될 때 보다 효과적인 종양 보호 면역을 유도할 수 있습니다.  기계적으로, 보호는 CSC 반응성 항체 및 T 세포8의 선택적 유도뿐만 아니라 IFNγ 및 GM-CSF와 같은 타입-1 사이토카인의 생산에 의해 부여되었다.
수지상 세포 기반 백신 및 입양 T 세포 전달을 포함한 현재 면역 요법의 대부분은 종양-분화 항원들을 표적으로 하기 위해 고안되었습니다. 이러한 분화된 항원들을 발현하지 않을 수 있는 CSCs는 그러므로 이러한 면역학적 표적을 피할 수 있다. 대조적으로, 암줄기세포를 구체적으로 표적으로 하기 위하여 설계된 CSC 백신은 암세포의 이 특별한 인구를 파괴하고, 따라서 종양 재발 및 전이를 방지해서 백신의 치료 효험을 향상시킬 수 있다.
배양된 종양 세포와 갓 수확한 종양 모두에서, 우리는 높은 알데히드 탈수소 효소 활성에 기초한 혈류 세포측정에 의하여 CSC 농축 인구를 확인했습니다. 이러한 ALDH고세포는 CSC-TPDC를 생성하는 CC-TPDC를 생성하는 항원 소스로 사용되는 흐름 분류에 의해 단화될 수있다. 이 결과는 배양된 종양 세포에서 또는 임상 신청을 위한 갓 수확한 종양에서 고립된 CS를 사용하는 잠재력을 밝혔습니다.
임상적으로 관련성이 있기 위해서는 치료 환경에서 백신을 검사해야 합니다. 이 실험은 지금 우리의 실험실에서 수행되고 있습니다.

암 줄기세포는 종래의 화학요법 및 방사선 요법에 상대적으로 저항력이있다 1,2. 한편, 세포의 이 인구는 전통적인 암 치료1-4후에 암의 재발 그리고 진행을 책임지는 세포일지도 모릅니다. 암 줄기 세포에 분화 한 종양 항원의 발현의 부족으로 인해, 암 줄기 세포는 주로 분화 된 종양 세포에 항원을 대상으로 설계 암에 대한 치료의 현재 면역 학적 개입을 탈출 할 수있다. 따라서, 암줄기세포를 구체적으로 표적으로 하고 파괴하는 새로운 전략의 개발은 현재암 치료의 치료 효능을 증가시키는 약속을 지킬 수 있다. 이를 위해, 우리는 2개의 동물종양 (흑색종 D5 및 편평세포 암 SCC7)에서 암 줄기 세포 (CSC)를 풍부하게 한 인구를 격리하고, CSC-TPDC 백신을 준비하기 위하여 항원 제시 세포 (수지상 세포, DC)를 펄스하는 항원 근원으로 이용했습니다. 그런 다음 합성 면역 능력 호스트, B6 마우스 및 C3H 마우스에서 CSC-TPDC 백신에 의해 유도된 항종양 면역을 각각 평가하였다. CSC-TPDC 유도 항종양 효능은 이전에 우리 그룹5,6에서사용되어 온 분류되지 않은 이질성 종양 세포(H-TPDC)로부터 용액으로 펄스된 기존의 DC 백신과 비교되었으며, 다른조사자들(7)은 전임상 연구와 임상 시험 모두에서 비교하였다.

<table><tbody><tr><td>ALDHEFLOUR KIT</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-4</td><td>Pepro Tech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>Murine GM-CSF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>마우스 GM-CSF ELISA KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>555167</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep 밀도 구배 매체</td><td>시그마 Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>BD OptEIA TMB 기질 시약 세트</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria 세포 분류기</td><td>BD Biosciences</td><td>336834</td><td></td></tr><tr><td>Kcjunior</td><td>Bio-Tek 기기</td><td>176058</td><td></td></tr></tbody></table>

흑색종과 편평상피암 줄기세포를 이용한 새로운 수지상 세포 백신의 생성

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

우리는 암 줄기 세포 (CSC)-농축 된 인구는 Murine 흑색종 D5 합성C5/6 마우스와 편평상피암 SCC7 합성을 알데플루OR/ALDH를 마커로 사용하여 C3H 마우스에 합성, 맥박 세포에 항원 용액의 소스로 세포 용해성을 테스트 (DCs). ALDH높은 CSC lysates와 펄스 된 DC는 모델 과 폐 전이 설정 및 s.c 모두에서 분류되지 않은 전체 종양 세포 리스의 lysates로 펄스 DC보다 훨씬 더 높은 보호 항종양 면역을 유도한다. 종양 성장 설정, 각각. 이 현상은 CSC 백신 유도 된 유머뿐만 아니라 세포 항 CSC 반응 때문이었다. 특히, CSC-DC 백신을 실시하는 호스트로부터 분리된 비장세포는 분류되지 않은 종양 세포 용해 펄스-DC 백신을 실시하는 숙주로부터 분리된 비장세포보다 훨씬 더 많은 양의 IFNγ 및 GM-CSF를 생산하였다. 이러한 결과는 보조 제 환경에서 임상 사용을 위한 자가 CSC 기반 치료 백신을 개발하는 노력을 지원합니다.

ALDEFLUOR/ALDH는 다중 악성 종양에서 줄기 세포를 분리하는 단일 마커로서 사용되어왔다 8-11. 우리는 알데플루어를 마커로 사용하여 2개의 종양 모형 D5 및 SCC7에 있는 암 줄기 세포 농축인구를 확인했습니다. 우리는 뮤린 흑색종 B16-D5및 편평상피 세포암 SCC7에 있는 ALDEfluOR+ 세포를 검출했습니다. 우리는 ALDEFLUOR+ 세포가 배양D5 및 SCC7 종양 세포주에서 각각 약 0.5% 및 5.2%를 기여한다는 것을 것을을 발견했습니다(그림 1). 확립된 종양에서 갓 수확한 종양 세포는 ALDEFLUOR+ 세포의 존재를 확인하기 위해 분석되었다. 도 1에도와 같이, 생체 내에서 ALDEfluOR+ 세포의 2.5% 및 4.2%가 각각 D5 및 SCC7 종양을 확립하였다. 이들 선별된 D5 및 SCC7 ALDEFLUOR+/ALDH높은 집단의 종양성 및 자체 갱신 능력은 각각8개의합성 면역능력 숙주에서 평가되었다.
우리는 동물 연구 와 임상 시험 에서 모두 MC (H-TPDC)를 펄스하기 위해 이질성 무분류 종양 세포 용액을 사용하였다5,6. CSC의 면역원성을 조사하기 위해, 우리는 CSC-TPDC(그림 2)를생성하기 위해 CSC의 용액으로 ALDH높은 CSC 및 펄스 DC를 분리하고 CSC-TPDC가 종양 성장을 방지하는 데 유익한 효과가 있는지 테스트하기 위해 종래의 암 백신 제어로 H-TPDC를 사용했습니다.
우리는 CSC-TPDC에 의해 유도된 보호 항종양 면역을 검토해서 CSC의 면역원성을 평가했습니다. D5 모델에서, 순진한 면역 무능마우스는 CSC-TPDC 또는 H-TPDC (동일 lysate에서: DC 비율)를 가진 s.c 백신 접종을 했습니다. 제어 그룹은 식염수(PBS)를 받았습니다. 마지막 백신 후 1 주일, 마우스는 정맥으로 분류되지 않은 D5 종양 세포(즉,v.)로도전하고 폐는 폐 전이를 예매하기 위해 3 주 후에 수확되었다. 표 1에도시된 바와 같이, PBS 그룹과 비교하여, H-TPDC로 처리된 마우스는 더 적은 폐 전이를 개발하였다. 중요한 것은, CSC-TPDC로 처리된 마우스는 두 실험에서 H-TPDC 백신 단보다는 훨씬 적은 폐 전이가 있었습니다. SCC7 모델에서 정상적인 C3H 동물.c은 SCC7 CSC-TPDC 또는 H-TPDC를 각각 오른쪽 측면에 접종한 후, 분류되지 않은 SCC7 종양 세포s.c 좌측으로 도전하였다. PBS 그룹과 비교하여 H-TPDC는 종양 성장에 대한 겸손한 항종양 면역을 유도했습니다. 그러나, 대조군 및 H-TPDC 군(p<0.05, 도 3)과 비교했을 때 CSC-TPDC로 치료된 마우스에서 종양 성장의 현저한 억제가있었다. 이러한 결과는 CSC가 종양 세포의 도전에 대한 보호 면역을 유도하는 전통적인 분류되지 않은 종양 세포보다 DC를 로드하는 보다 효과적인 항원 소스로 사용될 수 있음을 나타냅니다.
관찰된 CSC 유도 된 보호 항종양 면역의 기본 메커니즘을 더 이해하기 위해 실험이 끝날 때 DC 예방 접종을 받는 동물로부터 비장을 수확했습니다. 비장 세포는 그 때 반대로 CD3/CD28/IL-2 또는 반대로 CD3/CD28/IL-2 + LPS/안티 CD40에 의해 활성화되었다. 이어서 배양 슈퍼나탈이 수집되어 사이토카인 및 항체의 발현을 검출했다.  D5 CSC-TPDC 또는 SCC7 CSC-TPDC(도 4)로 예방 접종된 동물로부터 비장 세포에 의해 IFNγ 및 GM-CSF의생산량이상당히 높았다. 더욱이, D5 CSC-TPDC 또는 SCC7 H-TPDC와 비교하여 D5 CSC-TPDC 또는 SCC7 CSC-TPDC로 예방 접종된 동물로부터 수집된 LPS/안티 CD40 활성화 비장 세포에 의한 IgG 생산량이 현저히(p<0.05) 높았다. 이들 항체는 각각 D5 및 SCC7 CSC에 결합하는 것으로 나타났으며, 이러한 결합은 보완8의존재속에서 CSC 리시스를 초래할 수 있다.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> 그림 1. ALDHFLUOR+/ALDH높은 인구는 새로 수확된 신선한 뮤린 D5 흑색종 및 SCC7 편평상피 세포 종양뿐만 아니라 배양에서 검출되었다. 50mmol/L DEAB로 처리된 종양 세포는 특정 ALDH 억제제로서, 음성 대조군으로 사용되었다.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> 그림 2. 수지상 세포 기반 암 줄기 세포 백신의 생성. CSC-TPDC 및 H-TPDC의 제조를 위해, 골수 유래 수지상 세포는 각각 ALDH높거나 분류되지 않은 종양 세포 용액으로 펄스되었다.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> 그림 3. CSC 용해 펄스 DC (CSC-TPDC) 백신은 s.c에서 보다 효과적인 보호 항종양 면역을 유도할 수 있었습니다. SCC7 종양 모델. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 

<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> 그림 4. CSC-TPDC로 예방 접종된 면역 능력 호스트에서 보다 강력한 전신 세포 반응.  비장세포는 H-TPDC 또는 CSC-TPDC 예방 접종을 받은 동물로부터 수확되었으며, 표시된 대로 활성화되었다. 배양 슈퍼넌트는 ELISA를 사용하여 사이토카인 검출을 위해 수집되었다.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

합성 면역 능력 호스트에서 평가, 암 줄기 세포 (CSC) 기반 수지상 세포 (DC) 백신은 이질 적인 대량 종양 세포와 펄스 전통적인 DC 백신 보다 상당히 높은 항 종양 면역을 입증.

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

이 절차의 전반적인 목적은 면역 기능이 정상인 숙주에서 암 줄기세포(cancer stem cell, CSC) 또는 CSC 기반의 수지상 세포(dendritic cell, DC) 백신의 항종양 면역력을 평가하는 것입니다. 이는 우선 이질적인 종양 세포로부터 aldehyde dehydrogenase 양성 또는 A LDH high CSC를 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 CSC DC를 분리한 후, 백신 제작을 위해 용해물(lysate)로 펄싱(pulsing)합니다.다음으로, CSC 용해물 펄스 DC 또는 TP DC 백신을 정상 동계 면역능력 보유 숙주에게 투여합니다. 그런 다음 마지막 단계에서 C-S-C-T-P-D-C 백신의 항종양 보호 효능을 평가합니다. 최종적으로, 숙주 T세포와 항체에 의한 C-S-C-T-P-D-C 백신 유도 항 CSC 면역력을 평가하기 위해 ELISPOT을 수행할 수 있습니다.본 프로젝트는 암 연구에서 가장 흥미로운 두 분야인 암 줄기세포 분야와 종양 면역치료 분야를 결합하였습니다. 저희 연구실은 고형암에서 암 줄기세포를 최초로 발견한 곳 중 하나입니다. 암 줄기세포는 암의 성장뿐만 아니라 전이를 주도하는 암의 씨앗과 같습니다.오늘 보실 내용은 면역 요법을 사용하여 이러한 암 줄기세포를 특이적으로 표적하는 새로운 접근 방식입니다. 저희는 Alde fluoro assay를 통해 검출 가능한 aldehyde dehydrogenase라는 특정 마커를 활용합니다. Lin Liu 박사와 Huon Tau 박사가 Chow Lee 박사와 함께 연구하는 모습을 보시게 될 것입니다.이러한 암 줄기세포를 표적으로 함으로써 다양한 종류의 암 환자들의 치료 결과를 개선할 수 있기를 기대합니다. 먼저, 대상 종양 세포를 assay buffer에 1×10⁶ cells/mL 농도로 부유시킵니다. 그런 다음, 종양 세포 현탁액 중 3mL를 제외한 나머지를 각각의 샘플 튜브로 옮기고, 네 개의 12×75mm 폴리스티렌 대조군 시험관에 unstained, ALOR, ALOR plus DEAB, 7-AAD라고 각각 라벨을 붙입니다. unstained 및 7-AAD 튜브에는 세포 현탁액 1mL를, ALOR 튜브에는 2mL를 분주합니다.그런 다음 ALOR plus DEAB 튜브에 DEAB 5 µL를 추가합니다. 튜브를 얼음에 두고, ALOR 튜브에 활성화된 ALOR 기질 10 µL를 넣어 혼합합니다. 즉시 기질 용액 1 mL를 ALOR plus DEAB 튜브로 옮긴 후, 각 샘플 튜브에 세포 100만 개당 활성화된 ALOR 기질 2 µL를 추가합니다.모든 튜브를 37 °C 항온수조에서 30분 동안 배양한 후, 7-AAD 튜브에 7-AAD 5 µL를 첨가하고 각 샘플 튜브에는 세포 100만 개당 7-AAD 1 µL를 첨가합니다. 이 튜브들을 4 °C에서 10분 동안 유지합니다. 모든 튜브를 상온에서 250 ×g로 5분 동안 원심분리하고, 펠릿을 AldeFluor 분석 버퍼에 재부유시켜 형광 활성 세포 분류(FACS)를 수행합니다.분류 게이트를 설정하려면, alde Fluor plus DEAB 세포를 음성 대조군으로 사용하고, seven A a D 염색 세포를 생존능 대조군으로 사용하십시오. 이 대조군들을 바탕으로 alor 양성 A LDH, high D five 및 SCC seven 세포를 구별하는 게이트를 설정하십시오. 그런 다음 이를 사용하여 샘플 세포를 alor 양성 A LDH, high D five 및 SCC seven 집단으로 분류하십시오.수지상 세포를 생성하려면 먼저 C 57 black six 및 C3 H 마우스에서 대퇴골과 경골을 분리합니다. 실온에서 75% ethanol로 1분 동안 뼈를 멸균한 후 HBSS로 세척합니다. 다음으로 뼈의 끝부분을 잘라내고, 21 gauge 바늘이 장착된 10 milliliter 주사기를 사용하여 골수를 페트리 접시에 밀어냅니다. 세포를 몇 번 흡입하고 분사하여 단일 세포 현탁액을 만든 후 세포를 원심 분리합니다.펠렛을 5 mL의 적혈구 용해 버퍼(red blood cell lysis buffer)에 넣어 37 °C 항온수조에서 1분 동안 배양합니다. 세포 수를 측정한 후, G-M-C-S-F와 IL-4가 첨가된 배양액을 사용하여 세포 농도를 1 × 10⁶ cells/mL로 조정합니다. 그다음 37 °C, 5% CO2 조건에서 세포를 배양하며, 3일마다 배지와 사이토카인을 교체해 줍니다.5일 차에 미성숙 수지상 세포를 수확합니다. 세포를 원심 분리하여 가라앉힌 후, 펠릿을 5 mL의 배양액에 재현탁하고, 새로 준비한 분리 배지 위에 세포 현탁액을 천천히 층상으로 쌓습니다. 다시 한번 세포를 원심 분리한 후, 배양액 층과 분리 배지 층 사이에 형성된 수지상 세포를 수집합니다.그 후 세포 수를 측정한 다음, G-M-CSF와 IL-4가 첨가된 배지에서 1×10⁶ cells/mL 농도가 되도록 부피를 조절합니다. 이제 분리된 세포를 4회 빠르게 동결-해동 반복 처리한 후, 원심분리를 통해 용해물의 막 성분을 수집하여 종양 용해물을 제조합니다. 그런 다음, 분리된 자가 A LDH high 세포 유래 용해물로 DCS를 펄싱하여 CSC TPC를 준비합니다.H-T-P-D-C 펄스를 준비하려면, 실험 대상 동물을 백신 접종하기 위해 정렬되지 않은 이질적 종양 세포 용해물이 포함된 DC를 준비합니다. 100 µL의 PBS에 현탁된 1×10⁶개의 펄스 세포를 각 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하 주사합니다. 백신 접종 후, C57BL/6 수용 마우스에 100 µL의 PBS에 포함된 1×10⁵개의 이질적 D5 종양 세포를 정맥 투여하여 챌린지합니다. SCC7 모델의 경우, DC 백신 접종 반대편에 100 µL의 PBS에 포함된 1×10⁶개의 정렬되지 않은 SCC7 종양 세포를 C3H 수용 마우스에 피하 주사하여 챌린지합니다.수혜 C3 H 마우스의 비장으로부터 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 그 다음, 적절한 자극제가 첨가된 배양액 내에서 고정화된 anti CD three 및 anti CD 28 단클론 항체를 사용하여 비장의 t 세포와 B 세포를 활성화합니다. 4일 후, 상층액을 수집하고 interferon gamma, G-M-C-S-F 또는 IgG에 대한 항체를 4°C에서 하룻밤 동안 Eliza 플레이트에 코팅합니다. 다음 날, 비특이적 결합을 차단하고 표준 물질과 방금 수집한 상층액을 플레이트에 분주한 후 실온에서 배양합니다. 세척 후, HRP 검출 항체를 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 다음 TMB 기질을 첨가합니다.마지막으로 반응을 중단시킨 후 30분 이내에 ELISA 플레이트 리더를 사용하여 450 nanometers에서 흡광도를 측정합니다. Alor는 D5 및 SCC7의 두 가지 암 줄기세포 농축 집단을 포함하여 여러 악성 종양에서 줄기세포를 분리하는 마커로 사용되어 왔으며, 특히 이 도트 플롯(dot plot)에서 입증된 바와 같이, Alor 양성 세포는 배양된 D5 및 SCC7 종양 세포주의 각각 약 0.5%와 5.2%를 차지합니다. 갓 수확한 종양 세포 또한 in vivo에서 생성된 D5 및 SCC7 종양에서 각각 2.5%와 4.2%의 Alor 양성 세포를 포함하는 것으로 확인되었습니다.D-E-A-B-A 특이적 A LDH 억제제로 처리한 종양 세포를 음성 대조군으로 사용하였습니다. 암 줄기세포의 면역원성은 앞서 입증한 백신 접종 모델을 사용하여 CSC TPC에 의해 유도된 보호 항종양 면역을 조사함으로써 평가하였습니다. 이 표에 나타난 바와 같이, H TPC를 투여한 마우스는 PBS만 투여한 마우스보다 폐 전이가 적게 발생하였습니다.중요한 점은, CSCT PC를 처리한 마우스가 H-T-P-D-C 또는 PBS만 처리한 동물보다 폐 전이가 여전히 더 적었다는 것입니다. SCC seven 모델에서, 대조군과 비교하여 일반 C3 H 동물에게 앞서 입증한 것과 동일하게 백신 접종을 실시했습니다. H TPC는 완만한 항종양 면역을 유도한 반면, CSC TPC는 유의미한 종양 성장 억제를 유도했습니다. 이러한 결과는 종양 세포의 공격에 대해 보호 면역을 유도하기 위해, CSC가 전통적인 비분리 종양 세포보다 DC 로딩을 위한 더 효과적인 항원원으로 사용될 수 있음을 나타냅니다.관찰된 CSC 유도 항종양 면역 보호 기전을 더욱 깊이 이해하기 위해, DC 백신 접종 동물의 세포를 활성화하고 앞서 시연한 대로 ELISA를 통해 사이토카인 생성을 측정했습니다. 그 결과, D5 CSC TPCs 또는 SCC7 CSC PCs를 접종한 동물에서 수확한 세포의 사이토카인 생성이 D5 HTPCs 또는 SCC7 HTCs를 접종한 동물에서 수확한 세포보다 유의하게 높게 나타났습니다. 지금까지 Alor 분석법을 사용하여 암줄기세포를 분리하는 방법을 살펴보았습니다.이렇게 분리된 암 줄기세포는 수지상 세포를 이용한 면역 요법을 개발하는 데 사용될 수 있습니다. 이러한 면역 요법이 단독으로 사용되거나 기존 치료법과 병용하여 사용됨으로써 다양한 종류의 암 환자들의 예후를 개선할 수 있기를 기대합니다.

generation-novel-dendritic-cell-vaccine-using-melanoma-squamous

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 세포 기반 종양 백신 접종 분석을 보여줍니다. 종양 형성을 위해 B16-F10 흑색종 세포를 피내 주입한 마우스는 발병한 종양 근처에서 Flt3L 사이토카인을 분비하는 B16-F10 세포를 접종합니다. 백신에서 분비된 Flt3L은 수지상 세포의 성숙 및 증식을 촉진한 후 림프절의 T 세포에 종양 항원을 제시하여 표적 항종양 면역 반응을 유발합니다.

Tumor Implantation and Injection of a Tumor Vaccine in a Mouse 모델에서의 종양 백신

종양 면역 요법에 사용하기 위해자가 수지상 세포의 큰 숫자 (DCS)를 생성하기위한 가장 일반적으로 사용되는 방법을 설명합니다. 방법은 단핵 세포에서 수지상 세포를 분화하는 IL-4, GM-CSF를 사용합니다. 그들은 환자에게 다시 주입하기 전에 미성숙 수지상 세포는 성숙하고 항원과 함께로드를 자극한다.

면역 요법에 대한 종양 항원로드 성숙 수지상 세포의 준비

이 문서는 기본 셀 문화, 및 종양 세포에서 적혈구와 섬유 아세포의 contaminations를 제거하는 방법에 신선한 얻은 흑색 증 조직의 준비에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 어떻게 묘사...

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연<sup&gt; +</sup흑종에서&gt; Putative 암 줄기 세포

이 프로토콜의 목표는 흑색종 종양 침투 림프구를 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는 프로토콜을 보여주는 것입니다.

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

본 문서에서는 3차원(3D) 흉선 배양 시스템에 의해 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 흉선 이주자(iTE)를 생성하는 새로운 방법을 설명한다. iTE는 증식, 기억 형성 및 종양 억제 능력을 가진 순진한 T 세포와 밀접하게 관련된 T 세포의 균질한 서브세트이다.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

체 외 광 화학요법 (ECP)의 핵심 기능을 복제 하기 위해 실험 설정에서 생리 활성, 가변 수지상 생산을 가능 하 게 하는 (TI) 장치 또는 플레이트 및 관련 프로토콜이 개발 되었습니다. 암 면역 요법을 위한 세포 (DCs).

생리 적 면역 원 성 수지상 세포 생성을 위한 새로운 프로토콜

이 문서에서는 OP9/DLL1 공동 배양 시스템을 사용하여 기능성 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 CD8αβ+ 단일 양성 T 세포를 생성하는 방법을 설명한다.

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

여기에 제시된 것은 줄기세포 유래 바이러스 항원(Ag)-특이적 T 림프구의 입양세포 전달(ACT)을 이용하여 마우스에서 B형 간염 바이러스(HBV) 복제의 효과적인 억제를 위한 프로토콜이다. 이 절차는 HBV 감염의 잠재적인 ACT 기지를 둔 면역 요법을 위해 적응될 수 있습니다.

줄기 세포 유래 바이러스 Ag 특이적 T 림프구는 마우스에서 HBV 복제를 억제

이 프로토콜은 Flt3L 발현 B16-F10 흑색종으로 세포 기반 종양 백신 접종을 사용하는 암 면역 요법 모델을 제시합니다. 이 프로토콜은 배양된 종양 세포의 준비, 종양 이식, 세포 조사, 종양 성장 측정, 종양내 면역 세포의 분리 및 유세포 분석을 포함한 절차를 보여줍니다.

조혈 사이토카인을 사용한 종양 백신 접종을 이용한 실험적 흑색종 면역요법 모델

시알리다아제 처리를 사용하여 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 탈시알릴화된 인간 단핵구 유래 수지상 세포(mo-DC)를 생성하는 독특하고 포괄적인 프로토콜이 제시됩니다. 또한, mo-DC의 표현형 및 기능적 특성을 평가하고, 시알리다아제 처리가 mo-DC의 성숙 수준을 어떻게 향상시키는지를 평가하는 방법이 기재되어 있다.

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differenting Sialylated Phenotypes (시알릴화 표현형이 다른 단핵구 유래 수지상 세포 생성)

이 프로토콜은 전사 인자 PU.1, IRF8 및 BATF3의 강제 발현을 통해 마우스 암세포를 종양 미세 환경 내에서 유형 1 수지상 유사 세포로 생 체 내 재프로그래밍하는 것을 설명합니다.

종양 세포를 제1형 기존의 수지상 세포 유사 세포로 다루기 쉬운 생체 내 재프로그래밍

배우세요 암 줄기세포 기반 수지상 세포 백신을 이용한 항종양 면역 유도 방법을. ALDH 높은 세포를 분리하여 백신을 제조하고 면역 반응을 평가하는 이 기법은 암 면역치료 연구에 활용됩니다.

흑색종과 편평상피암 줄기세포를 이용한 새로운 수지상 세포 백신의 생성

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