곤충 비행 동작 모니터링에 대한 초기 변성 삽입 기술

안녕하세요, Albert Bos 박사 연구실의 Alex Derber입니다. 저는 노스캐롤라이나 주립대학교 전기공학과 소속입니다. 오늘은 초기 변태 단계의 manica sex에 전극을 이식하는 새로운 수술 절차를 시연하겠습니다.

Early Metamorphic insertion 기술이라 불리는 이 절차에서는, 번데기 변태 단계 동안 삽입된 전극을 곤충의 조직에 통합시킵니다. 이 절차의 주요 장점은 신경근 조직과 기계적으로 안정적이고 전기적으로 신뢰할 수 있는 결합을 형성하여 곤충의 비행 신경생리학 연구가 가능하다는 점입니다. 성충 단계에서 IC Mensa는 약 40일 동안 지속되는 변태 생애주기를 거칩니다.

Mensa는 알 단계에서 생애 주기를 시작합니다. 7~10일 후, 유충은 부화하여 3단계 별 유충(star larval stage)에 도달합니다. 별 유충 단계는 총 5단계로 구성되며, 각 단계에서 유충은 에너지 수집과 성장을 거칩니다.

5령 유충 단계 후 5~6일이 지나면, 곤충은 초기 번데기 단계로 진입합니다. 번데기 단계 동안에는 곤충 조직의 광범위한 퇴화와 그에 따른 재생이 일어납니다. 성충 나방으로 우화하기 위해 곤충은 17~19일 동안 이 단계를 거칩니다.

초기 번데기 단계, 후기 번데기 단계 진입 전, 그리고 후기 번데기 단계 동안, 우리는 번데기의 등쪽 흉부에 전기 전도성 전극을 외과적으로 삽입합니다. 조직이 삽입된 전극 주변으로 성장하여 전극이 곤충의 몸에 고정되도록 합니다. 며칠에 걸쳐, 번데기의 흉부에 삽입된 전극은 최종 성충 단계인 나방의 신체 일부로 나타나게 되며, 이를 통해 곤충의 전체 조직 시스템이 재구성되는 과정을 활용하게 됩니다.

변태 발달 과정 동안, 전극을 흉부의 간접 비행 근육에 삽입합니다. 날개 움직임에 간접적으로 관여하는 이 근육 그룹은 배측-복측 근육과 배측-종단 근육입니다. 여기서는 날개의 상향 스트로크에 간접적으로 관여하는 배측-복측 근육에 전극을 삽입하는 방법을 시연하겠습니다.

이 삽입 과정을 통해, 야(ya) 움직임 동안 등-배측 근육에서 근전도를 무선으로 기록하게 됩니다. 곤충은 움직임을 자극하는 LED 아레나 내의 전자기 부상 플랫폼에 매달려 있게 됩니다. 초기 변태 삽입 기술 절차는 삽입된 전극과 기록 장치 사이의 인터페이스로 사용될 인쇄 회로 기판의 제작부터 시작됩니다.

와이어 전극은 인쇄 회로 기판(PCB) 위에 납땜되며, 이는 평면 유연 케이블 커넥터에 연결됩니다. 먼저 세밀한 팁의 유성 마커와 가위를 사용하여 0.5 by 5 cm² 크기의 동박 적층판 조각을 측정하고 자릅니다. 동일한 세밀한 팁의 유성 마커를 사용하여 에칭 마스크 패턴으로 0.1 by 5 cm² 크기의 패드 3개를 그립니다.

자 등의 직선 도구를 사용하여 구리 적층판 컷아웃의 전체 길이를 따라 표시를 합니다. 표시가 뚜렷하고 서로 겹치지 않도록 주의하십시오. 표시선이 서로 겹치면 전극 간에 단락이 발생합니다.

플랫 유연 케이블 커넥터에 연결할 때 보드가 손상되는 것을 방지하기 위해, 구리 라미네이트 컷아웃을 환기 시설이 갖춰진 구역(가급적 흄 후드가 있는 곳)으로 옮겨 구리 라미네이트 위에 표시된 부분을 식각합니다. 인쇄 회로 기판 식각제는 독성이 있으므로 취급 시 주의하십시오. 섭취하거나 삼켰을 경우 위험하며 피부 접촉 시 자극을 유발할 수 있습니다. 구리 라미네이트 컷아웃의 한쪽 끝에 테플론 테이프를 길이 방향으로 약 1cm 정도 덮도록 부착하십시오.

다음으로, 구리 적층판 컷아웃의 절반이 식각액에 잠기도록 스카치테이프를 사용하여 눈금 비커 내부에 부착합니다. 비커를 회전 플랫폼 위에 놓고 20분 동안 둡니다. 식각된 구리 적층판을 비커에서 꺼내어 물이 채워진 비커에 10분 동안 담가 둡니다.

잔여물을 헹구기 위해, 정밀 와이프 티슈에 이소프로필 알코올을 묻혀 표시된 부분을 닦아내어 식각되지 않은 구리 패드를 노출시킵니다. 유성 매직의 흔적을 모두 제거하십시오. 인쇄 회로 기판을 약 1cm 길이의 작은 정사각형 모양으로 자릅니다.

인쇄 회로 기판의 에칭이 완료되었으므로, 전극을 부착하기 위한 준비 과정이 필요합니다. 이 단계들은 현미경을 통해 시각적 도움을 받으며 수행하는 것이 권장됩니다. 날카로운 칼날을 사용하여 코팅된 니켈 도금 스테인리스 스틸 와이어(코팅 직경 0.11 inch, 노출 직경 0.008 inch)를 각각 3cm 길이로 두 조각 자릅니다.

이 스테인리스강 와이어 조각들은 곤충의 흉부에 삽입될 활성 전극입니다. 면도날을 사용하여 각 와이어 양끝에서 4~5mm의 플라스틱 코팅을 제거하십시오. 그다음, 절단하십시오.

접지 전극의 팁 연장선을 만들기 위해 0.7 cm 길이의 절연 스테인리스 스틸 와이어 한 개를 준비합니다. 이전 단계에서 수행한 것과 같이 면도날로 코팅을 조심스럽게 제거하거나 인두기의 열로 녹여냅니다. 다음으로, 리티츠(lititz) 와이어 한 개를 4.5 cm 길이로 자릅니다.

이 납땜에는 인덕터 와이어를 사용할 수도 있습니다. 이전에 준비한 0.7 centimeter 길이의 스테인리스 스틸 팁을 리티츠 접지 연결 와이어에 연결합니다. 접지 연결 끝부분에 스테인리스 스틸 팁이 노출되어 있어야 합니다.

테플론 테이프를 사용하여 식각된 회로 기판을 솔더링 작업대에 고정합니다. 전극을 기판에 솔더링할 수 있도록 패드의 1~2mm 정도가 노출되게끔 회로 기판 위에 테이프를 붙입니다. 마스킹되어 솔더링이 되지 않은 패드의 끝부분은 FCC 커넥터에 삽입됩니다.

세 개의 전극 와이어를 테플론 테이프로 정렬하여 각 끝단을 전극 보드의 해당 패드에 납땜할 수 있도록 합니다. 두 개의 활성 전극은 보드 가장자리 근처의 패드에 납땜해야 합니다. 접지 전극은 중앙 패드에 납땜해야 합니다.

납땜을 용이하게 하기 위해 전극 패드 전체에 스테인리스 스틸 플럭스를 도포합니다. 납을 너무 많이 사용하여 패드 연결 부위가 단락되지 않도록 주의하십시오. 전극을 아세톤과 이소프로필 알코올에 각각 10분 동안 담급니다.

납땜 잔여물을 세척하기 위한 단계입니다. 세척액은 별도의 접시나 비커에 부어 사용할 수 있습니다. 세척 성능을 높이려면 침지 과정 중에 전극을 초음파 세척기에 넣을 수 있으며, 이때 세척액도 함께 넣습니다. 곤충들은 낮과 밤이 바뀌는 전환기에 가장 활발하게 활동할 것입니다.

따라서 자동 콘센트 타이머를 사용하여 곤충 사육실 내에 인공적인 명암 주기를 설정해야 합니다. 이는 7시간의 암기 및 17시간의 명기로 구성된 주기를 모방하도록 설정해야 합니다. 적절한 삽입 시간을 결정하기 위해 manduka sex eye pu eye를 매일 관찰하십시오.

번데기 눈은 날개보다 약 하루 뒤에 삽입 준비가 됩니다. 어두운 반점이 나타나는 시기에 삽입하는 것이 번데기 폐쇄 7~4일 전으로 가장 성공적입니다. 하단의 더 어두운 번데기는 마취 후 전극의 외과적 삽입 준비가 된 상태입니다.

이를 4 °C의 냉장고에 약 6시간 동안 보관하십시오. 다음으로, 삽입 작업 공간을 준비하십시오. 작업 공간에는 isopropyl alcohol, 날카로운 핀셋, 그리고 30 gauge 하이포더믹 바늘이 포함되어야 합니다.

선택적으로 전극 고정을 강화하기 위해 cyanoacrylate 접착제를 사용할 수 있으며, 니들 트위저와 전극을 iso propyl alcohol에 담그거나 닦아내어 멸균합니다. 6시간 후 냉장고에서 동공을 꺼내 작업 공간으로 옮깁니다. 관심 있는 근육 그룹에 해당하는 등쪽 흉부의 위치를 결정합니다.

여기서는 날개의 상향 스트로크(upstroke) 움직임을 담당하는 등쪽-배쪽 근육(dorsal ventral muscles)에 주목합니다. 날카로운 칼날이나 하이포더믹 바늘을 사용하여 외각질층(exo cuticle layer)에 1x1 cm 크기의 정사각형 영역을 조심스럽게 긁어냅니다. 핀셋을 사용하여 이 조각들을 천천히 벗겨냅니다.

핀셋을 사용하여 흉부의 노출된 부위에서 날개 털을 제거합니다. 세척 과정을 돕기 위해 선택적으로 진공 흡입기를 사용할 수 있습니다. 삽입된 전극에 방해가 되지 않도록 가능한 한 많은 털을 제거하는 것이 중요합니다.

날개가 흉부에 부착되는 중흉부(mesothorax)에 바늘을 약 5mm 천천히 삽입하여 근육군을 겨냥한 두 개의 삽입 지점을 만듭니다. 삽입 지점을 놓치면 다시 찾기 어려울 수 있으므로 구멍이 뚫린 위치를 기억하십시오. 기계적 내구성을 높이기 위한 선택 사항으로, 번데기를 테이블 위에 고정하고 핀셋을 사용하여 두 개의 기록 전극을 두 삽입 지점에 안내하여 삽입하십시오.

전극 주변의 털을 모두 제거하고, 와이어 어플리케이터를 사용하여 흉부의 각 삽입 지점 주변에 ciano accolate 접착제를 충분히 도포합니다. 곤충이 기어오를 수 있도록 벽면과 천장을 거칠고 질감이 있는 재질로 덮어 ELO용 케이지를 준비합니다. 우화 후에는 타공 판지 상자나 포장지를 사용할 수 있습니다.

강성 고정 장치를 준비합니다. 길이 약 6cm, 직경 2mm의 막대를 사용하십시오. 돌출된 pros 아래의 구멍을 통해 이 막대를 조심스럽게 밀어 넣으십시오.

플라스틱 교반기를 사용합니다. 이 단계에서는 면봉이나 금속선을 사용할 수 있습니다. 번데기가 굴러다니지 않도록 막대의 양쪽 끝을 케이지 표면에 고정하십시오.

번데기의 가슴 중앙(mesothorax)이 위를 향하도록 케이지 내부에 배치합니다. 과도한 움직임은 전극 손상, 림프액(heli) 손실을 유발하거나 삽입 과정을 무효화할 수 있습니다. 접지 전극은 복부 또는 가슴의 말단 부위에 삽입해야 합니다.

신호 결합을 방지하기 위해, 접지 전극 삽입은 번데기 발달 후기 단계 또는 곤충이 우화한 후에 수행할 수 있습니다. 번데기 단계 삽입 또는 성충 단계 삽입 중 어느 쪽을 선택하든, 이 번데기 단계에서 접지 전극 삽입 부위를 준비해야 합니다. 여기서는 성충 단계의 접지 전극 삽입 방법을 설명합니다.

나방을 4°C의 냉장고에 6시간 동안 둡니다. 저온 처리 고정을 위해 이소프로필 알코올, 날카로운 핀셋, 30게이지 피하 주사 바늘, 크레올 접착제, 접착제 도포용 와이어, 선택 사항인 열 소작기와 치과용 왁스 스틱을 포함한 삽입 작업 공간을 준비합니다. 이전과 마찬가지로, 삽입 지점의 나방과 접촉시키기 전 주사 바늘을 이소프로필 알코올에 담급니다. 후방 복부를 따라 기록 전극에서 약 1~2cm 떨어진 삽입 지점에서 바늘을 천천히 삽입하여 복부를 천공하고 삽입 부위를 확보합니다.

바늘은 4 mm 이상 삽입되지 않아야 합니다. 삽입 부위에서 혈림프가 흘러나온다면 바늘을 너무 깊게 삽입한 것이며, 이 경우 절차의 성공 가능성이 낮아집니다. 핀셋을 사용하여 접지 전극을 삽입 부위에 조심스럽게 넣고, 3~4 mm 깊이가 될 때까지 압력을 가하십시오.

전극을 제자리에 고정하고, 선택 사항으로 삽입 부위 주변에 접착제를 바르기 위해 와이어를 사용합니다. 삽입 부위의 기계적 강도를 더욱 높이려면, 열 소작기를 사용하여 팁 끝에 2~3mm의 작은 왁스 덩어리를 모읍니다. 팁을 삽입 부위에 가깝게 대고 열을 가하여 왁스가 전극을 둘러싸고 단단히 고정되도록 합니다.

냉각 후, 실험을 수행하기 전에 곤충이 삽입 과정에서 회복할 수 있도록 하루 동안 둡니다. 곤충에 장착된 전극 보드를 Triangle Biosystems international 헤드 스테이지 유닛에 연결하려면 플랫 플렉시블 케이블 커넥터가 포함된 어댑터 보드가 필요합니다. 어댑터 보드에는 에칭된 구리 적층판이 사용되며, 이는 앞서 설명한 전극 보드 준비 단계에 따라 준비해야 합니다. 솔더링 스테이션에서 준비된 보드의 한쪽 끝에 플랫 플렉시블 케이블 커넥터를 납땜합니다.

10핀 플랫 플렉시블 케이블 커넥터를 보드에 납땜할 때는 커넥터 가장자리의 핀 두 쌍과 중앙 핀 쌍이 세 개의 구리 패드와 접촉하도록 합니다. 다음으로 30 AWG 훅업 와이어 3개를 세 개의 패드에 납땜합니다. 보드의 반대편 끝에는 설명된 바와 같이 오실로스코프 측정을 위해 어댑터 보드의 세 패드에 세 개의 미니 커넥터를 납땜합니다.

다음 단계에서는, 두 개의 커넥터를 보드 가장자리에 수직으로 배치하십시오. 중앙 커넥터는 보드 평면에서 약간 위쪽으로 각지게 배치해야 하며, 이 세 가닥 전선의 반대쪽 끝을 Triangle Biosystems International에서 제공하는 헤드 스테이지 커넥터에 연결하십시오.

그 다음, 전극의 신뢰도를 높이고 신호 대 잡음비를 관찰하기 위해 헤드 스테이지 회로 기판을 부양 프레임 상단에 고정해야 합니다. 유선 오실로스코프 기록을 얻을 수 있습니다. 무선 기록 시스템을 배치하기 전에, 오실로스코프를 다채널 AC 신경 기록 증폭기에 연결하십시오.

증폭기 파라미터를 하이패스 차단 주파수 1 Hz, 로우패스 차단 주파수 20 kHz 및 이득 100으로 설정하십시오. 어댑터 보드의 각 암컷 미니 와이어 커넥터를 증폭기 입력 채널에 연결하십시오. 전극 보드가 이식된 곤충을 케이지에서 꺼내십시오.

활성 상태일 때, 핀셋을 사용하여 측정 전 나방이 내려앉을 수 있도록 조직 조각을 나방 아래에 배치하고, 전극 보드를 어댑터 보드의 평면 유연 케이블(flat flexible cable) 연결 리셉터에 밀어 넣으십시오. 곤충 아래의 조직을 제거하고 근전도(electromyogram) 스파이크의 발생을 관찰하십시오. 곤충이 날개를 퍼덕일 때 오실로스코프에서 데이터를 캡처하고 저장하십시오.

이 그림은 날갯짓 전과 도중에 오실로스코프를 통해 획득한 근육 중 하나의 근전도 신호를 보여줍니다. 신호는 100배 증폭, 1 Hz의 하이패스 필터 및 20 kHz의 로우패스 필터 처리와 정지기 처리를 거쳤습니다. 근전도는 관찰되지 않습니다.

날개짓 동안의 근전도는 약 15에서 20 hertz에서 발생합니다. 오실로스코프 측정이 수집되고 검증되면, 무선 EMG 신호를 수집해야 합니다. 구속된 Manus sex의 비행 중 EMG 신호를 무선으로 기록하기 위해 전자기 부상 플랫폼을 구축할 수 있습니다.

부양 플랫폼은 테더링 메커니즘의 균형을 맞추도록 설계된 프레임으로 구성됩니다. 자유 부유식 부양을 통해 프레임과 그에 따른 곤충이 자유롭게 움직일 수 있습니다. 테더링 와이어의 제약이 없는 테스트 단계에서는 융합 적층 모델링(fused deposition modeling) 장비를 사용하여 프레임을 신속하게 프로토타이핑할 수 있습니다.

이 자석 장착 프레임은 베이스 플랫폼에 있는 일련의 전자석에 의해 부양됩니다. 이 부양 플랫폼은 5x7 배열의 개별 LED로 구성된 60개의 패널을 사용하여 제작된 LED 아레나 내부에 위치합니다. 아레나는 APIC 18 F 45 20 마이크로컨트롤러로 제어되어, 시계 방향 및 반시계 방향 회전의 시뮬레이션과 회전 속도 조절이 가능합니다.

TBSI 무선 기록 시스템을 설정합니다. TBSI 헤드 스테이지를 부양 플랫폼의 어댑터 보드 커넥터에 연결하십시오. 곤충이 활발하게 움직일 때, 가급적이면 새벽 시간대에 케이지에서 꺼냅니다.

핀셋을 사용하여 전극 보드를 부상 프레임의 플랫 플렉시블 케이블 수신기에 조심스럽게 삽입하여, 곤충이 장치 내에 단단히 고정되도록 합니다. 무선 데이터 전송을 활성화하기 위해 헤드 스테이지의 자기 스위치 근처에 마그네틱 완드를 배치합니다.

헤드 스테이지가 활성화되어 기록 준비가 완료되었음을 나타내는 청색등이 켜집니다. 완전한 암실 상태를 만들기 위해 실내 조명을 끄고, 컴퓨터에서 TBSI neuro aware 소프트웨어를 실행하십시오. 실내에 추가 조명이 필요한 경우 적색등을 사용할 수 있습니다.

적절한 구성 파일을 선택하십시오. 본 절차에서 사용되는 구성 파일은 기본 W five 설정입니다. 그런 다음 초기 인터페이스의 왼쪽 상단에 있는 start deck 버튼을 클릭하십시오.

신호를 확인하기 시작하려면, TBSI 기록 시스템에서 EMG 신호를 관찰하기 위해 모든 채널 창 탭을 선택하십시오. 안정적인 무선 연결과 전극 작동을 위해 모든 LED 아레나 구성 요소, 정전압 DC 전원 공급 장치 및 마이크로컨트롤러를 켭니다. 아레나 내의 부상 플랫폼의 균형을 천천히 맞추십시오.

NOR Aware 인터페이스의 왼쪽 패널에서 Record to Binary 탭을 선택하십시오. 녹화 시간과 파일 저장 경로를 지정하십시오. 데이터를 저장하기 위해 적절한 출력 설정을 선택하십시오.

TBSI 녹화 소프트웨어에서 녹화 세션을 시작하려면 시작 버튼을 클릭하십시오. 이렇게 하면 파일이 .next 파일로 저장되며, 이는 일반적으로 사용되는 데이터 처리 프로그램으로 가져올 수 있습니다.

곤충이 LED의 움직임과 일치하는 방향으로 비행하는지 관찰하십시오. LED의 방향을 반대로 바꾸어 곤충이 방향을 전환하는지 확인하십시오. 이 과정을 원하는 횟수만큼 반복합니다. 표시된 화살표는 LED 패턴의 회전 방향을 나타냅니다.

화살표가 노란색으로 변합니다. 곤충이 반시계 방향으로 회전하면 화살표가 파란색이 되며, 곤충이 시계 방향으로 회전하면 화살표가 파란색이 됩니다. 영상에 표시된 음성은 평소보다 50% 빠르게 재생됩니다.

이 그림은 휴지기 동안 날개짓 전후로 무선 계측 장치를 통해 획득한 단일 근육의 근전도 신호를 보여줍니다. 휴지기에는 근전도가 관찰되지 않습니다. 날개짓 중의 근전도는 약 15에서 20 hertz의 빈도로 발생합니다.

지금까지는 단일 채널 기록을 보여드렸습니다. 하지만 이 설정을 통해 얻은 다채널 기록은 비행 기동 중 여러 근육군 사이의 협응을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 지금까지 성충으로 변태하기 전 단계의 번데기 단계에서 전극을 삽입하는 방법을 보여드렸습니다.

삽입 시기는 동공기(pupil stage) 후반에 맞추어 너무 빠르거나 늦지 않게 조절하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 신뢰할 수 있는 전극 설정을 확보하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한, 곤충이 LED 아레나에서 공중 부양해 있는 동안 간접 비행근으로부터 EMG 데이터를 무선으로 기록하는 데 필요한 전기 부품을 조립하는 방법도 함께 설명해 드렸습니다.

시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.