쥐에서 동맥 경화 수스 Myointimal 증식을 유도 : 두 개의 유효한 모델의 소개

다음 실험의 전반적인 목표는 서로 다른 기전에 의해 대동맥 협착을 유도하는 두 가지 유효한 동물 모델을 소개하는 것입니다. 첫 번째 모델은 대동맥의 풍선 카테터 삽입술을 통해 근중막 증식을 유발하는 모델입니다. 우선, 신하부 복부 대동맥을 노출시키고 클램프로 고정합니다.

그 다음 대동맥을 횡절개하여 개방하고 풍선 카테터를 삽입합니다. 팽창된 카테터로 대동맥의 내피를 박리하면 수술이 완료됩니다. 두 번째 모델은 APOE 결핍 형질전환 마우스의 식이 조절을 통해 죽상경화반을 생성하는 방식입니다.

이 마우스들은 표준 조건에서 사육되었으며, 4~6개월 동안 고지질 서구식 식단을 섭취하였습니다. 결과적으로, 수술로 유도된 근내막 증식과 식단 제한 모델의 조직학적 분석을 통해 두 모델이 서로 다른 내강 협착을 유발한다는 것을 알 수 있습니다. 오늘은 풍선 카테터를 사용하여 혈관 손상을 유도하는 마우스 모델과 동맥경화 모델이라는 두 가지 서로 다른 내강 협착 유도 모델을 보여드리겠습니다.

서구식 식이요법을 적용한 형질전환 생쥐와 풍선 카테터 모델을 통해 협착증 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 형질전환 동형 접합 upper E 변이 생쥐 모델은 죽상동맥경화증의 병태생리를 연구하는 데 사용됩니다. 내막 증식 모델의 경우, 무게가 약 25g인 C 57 black six J 생쥐를 준비하십시오.

일반적인 식단과 함께 정상 조건에서 마우스들을 사육합니다. 2% isof fluorine으로 마우스를 마취시킨 후, 복부 털을 제거하고 진통을 위해 carprofen을 피하 주사합니다. 다음으로, Provo iodine과 80% ethanol을 사용하여 피부를 두 차례 교대로 소독합니다.

이제 발가락 집기(toe pinch)를 통해 반사 반응이 없는지 확인합니다. 백선(linear alba)을 따라 피부와 근육을 분리하여 수술을 시작합니다. 다음으로, 식염수에 적신 장갑으로 장을 감싼 후, 주의 깊게 지방 조직을 제거하여 복부 대동맥을 노출시킵니다.

이제 신장하 대동맥을 분지 지점까지 노출시키십시오. 이때 분지 혈관이 손상되지 않도록 주의하십시오. 이제 대동맥을 클램프로 차단하십시오.

먼저, 혈류를 차단하기 위해 신장하 대동맥 근위부에 미세 수술용 클램프를 장착합니다. 둘째로, 대동맥 분지부 옆에 두 번째 원위부 클램프를 장착합니다. 혈류가 차단되면, 근위부 클램프 근처의 대동맥에 작은 절개를 가합니다.

대동맥의 원위부 클램프 방향으로 카테터를 삽입하여 내피 세포 손상을 유도합니다. 카테터 풍선을 팽창시킨 후, 근위부 클램프 방향으로 카테터를 천천히 조심스럽게 끌어당겨 대동맥 내피를 제거합니다. 이 과정을 두 번 더 반복하여 총 세 번의 대동맥 팽창을 수행합니다.

이제 카테터를 제거하고 10 au proline 연속 봉합사를 사용하여 대동맥 절개 부위를 폐쇄합니다. 봉합이 완료된 후, AOR 자절 부위에 출혈이 있는지 확인하며 원위부 클램프를 조심스럽게 엽니다. 다시 클램프를 닫고 출혈 지점을 찾아 추가적인 단속 봉합으로 지혈합니다.

출혈이 없을 때 근위부 클램프를 천천히 엽니다. 절개 부위 원위부에서 대동맥 맥박이 확인되어야 합니다. 이제 장을 C2 위치에 배치하십시오.

다음으로, 6개의 OTT 프로린 연속 봉합사를 사용하여 근육층부터 복벽을 닫습니다. 그런 다음 5개의 OTT 봉합사로 피부를 닫고 마우스를 케이지로 다시 옮깁니다. 수술 후 첫 3일 동안은 통증 조절을 위해 음용수에 메타졸(metrazole)을 첨가하여 제공합니다.

약 28일이 소요되는 회복 기간 동안 동물을 모니터링하십시오. 죽상동맥경화증 모델의 경우, 4주령의 A POE 결핍 마우스를 준비합니다. 이 마우스들을 고지질 서구식 식단(high lipid western diet)과 함께 표준 조건에서 4~6개월 동안 사육하십시오.

실험 전 기간 동안 이 식단을 유지하십시오. 대동맥을 적출하기 6시간 전에 사료 공급을 중단하십시오. 그 다음, 이전 섹션에서 설명한 대로 마우스 수술 준비를 진행하십시오.

흉부를 절개하여 수술을 시작합니다. 다음으로 심장의 심첨부를 절단하고, 대동맥근을 통해 4% Paraform aldehyde 3 mL를 완만한 압력으로 관류하여 대동맥을 고정합니다. 그 후 대동맥근부터 분기점까지 대동맥을 분리합니다.

지방 조직을 최대한 많이 제거하십시오. 다음으로, 대동맥궁을 절단하여 4% para formaldehyde에 보관하십시오. 이제 심장과 대동맥 나무를 PBS가 담긴 실리콘 라인 디쉬로 옮기십시오.

대동맥 나무의 한쪽 끝을 자르고 미세 핀을 사용하여 실리콘 층에 고정합니다. 대동맥을 세로 방향으로 절개하고 대동맥 조직이 실온의 PBS에 몇 분간 놓여 있게 합니다. 그런 다음 조직을 50% ethanol로 한 번 헹구고 Sudan 용액에 담급니다.

셋째, 약 15분 동안 염색액으로 처리합니다. 염색 후, 과잉의 Sudan만을 제거하기 위해 50% ethanol로 조직을 몇 초간 빠르게 헹굽니다. 과하게 헹구면 염색약이 너무 많이 제거될 수 있으므로, 즉시 증류수로 조직을 헹구고 이미징을 진행합니다. 중막 내막 증식 모델의 경우, 내피가 제거된 마우스 대동맥을 채취하여 파라핀 포매 후 chrome으로 염색하였습니다. tri chrome 염색 단면에서 내막과 중막의 두께를 측정하여 비율을 산출하였습니다.

컴퓨터 분석 후 비율을 계산하여, 최대 플라크 두께는 컴퓨터 모포 트리(morpho tree)를 통해 루멘 내의 최대 내막 두께로 측정하였습니다. 루멘 폐쇄율은 이전 루멘 대비 새로운 내부 루멘의 비율로 계산하였습니다. 플라크 면적은 이전 루멘에서 새로운 내부 루멘을 빼서 계산하였습니다.

동일한 분석을 죽상동맥경화증 모델의 대동맥판막, 대동맥궁 및 하행대동맥의 트라이크롬(tri chrome) 염색 횡단면에서 죽상동맥경화증 모델에 대해서만 수행하였습니다. 하행대동맥을 세로 방향으로 절개한 후 Sudan red로 염색하였습니다. 두 모델의 분석을 위해 컴퓨터의 도움을 받아 플라크 면적과 전체 대동맥 면적을 측정하였습니다.

강내 폐쇄, 형태 및 세포성 등의 질문에 답하기 위해 조직 병리학 및 공초점 면역형광 현미경법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.