복셀에서 지식 : 복잡한 전자 현미경 3D-데이터의 분할에 대한 실용 가이드
August 13th, 2014
셀룰러 차원 전자 현미경을위한 병목 고도로 복잡한 3D 밀도 맵에서 피쳐 추출 (분할)된다. 우리는 따라서 효율적인 세그멘테이션 대한 시작점을 제공하고, 분할 방식 (수동, 반자동 또는 자동으로)가 상이한 데이터 유형에 가장 적합 관한 지침을 제공하는 기준의 세트를 개발했다.
다음 실험의 전반적인 목표는 3D 조직 국가를 분석하기 위해 세포 및 조직의 복잡한 3D 전자 현미경 데이터 세트에서 관심 있는 기능을 분류하는 것입니다. 이는 개별 전자 현미경 이미지로 구성된 데이터 세트를 수집하여 달성됩니다. 그런 다음 원시 2D 데이터를 3D 볼륨으로 재구성하고 필터링하여 노이즈를 줄이고 관심 기능을 향상시킨 두 번째 단계로 데이터의 객관적 및 주관적 특성을 평가하여 세분화를 위한 최상의 방법을 선택합니다.
다음으로, 수동 추상화, 모델 생성, 관심 기능의 수동 추적. 자동화된 밀도 기반 세분화 또는 맞춤형 자동 세분화를 수행하여 관심 있는 기능을 추출합니다. 그 결과, 최적의 세분화 접근 방식을 선택하기 위한 분류, 이미지 특성 및 개인 목표를 기반으로 관심 기능의 최종 3D 분할 모델을 보여줍니다.
서로 다른 데이터 세트에 대한 다양한 접근 방식을 비교하면 올바른 세분화 전략을 선택하는 데 도움이 됩니다. 관심 있는 특징을 추출하기 위한 다양한 방법을 보여줍니다. 세포 내 전기 현미경 볼륨의 복잡성을 감안할 때 각 접근 방식에는 장점과 한계가 있습니다.
일반적으로 세분화를 처음 접하는 개인은 다양한 데이터 세트에 대한 최상의 접근 방식을 식별하는 것이 항상 명확하지 않기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 대학원생의 환기와 함께. 절차를 시연하는 Tai는 자동차 박사후 연구원으로 BU가 될 것입니다.
제 연구실의 연구원인 아미트 하산(Amit Hassan)과 컴퓨터 시스템 엔지니어인 호아킨 코리아(Joaquin Korea)는 기하학적 측정을 위해 기하학적 모델을 생성하는 것이 유일한 목표일 때 수동 추상화 모델 생성을 사용합니다. 시작하려면 데이터 볼륨을 적절한 프로그램으로 가져옵니다. 이 데모에서는 수동으로 추상화된 모델 생성을 위해 kymera 소프트웨어가 사용됩니다.
먼저 파일을 선택하고 열어 열린 파일 대화 상자를 불러오고 원하는 지도의 파일 위치로 이동합니다. 그런 다음 볼륨 뷰어를 끌어오고 피쳐 표시 스타일을 선택하여 다른 렌더링 스타일로 데이터를 표시합니다. 볼륨 뷰어 창에서 히스토그램의 수직 막대를 드래그하여 디스플레이의 임계값을 조정합니다.
3D 볼륨을 탐색하여 세분화할 관심 영역을 선택하고 필요한 경우 더 작은 하위 볼륨을 잘라냅니다. Volume Viewer 대화 상자에서 features, subregion selection을 선택하고 클릭하고 드래그하여 관심 영역 주위에 직사각형 상자를 만듭니다. 다음으로, 관심 피쳐를 따라 마커를 배치하고 모델이 완성될 때까지 적절한 경우 링커로 연결합니다.
volume viewer 메뉴 바에서 이 작업을 수행하려면, tools, volume tracer dialogue를 선택하십시오. 거기에서 볼륨 추적기 대화 상자를 열려면 파일, 새 마커를 선택합니다. 집합. 볼륨 추적기 대화 상자에서 마우스를 선택하고, 고밀도에 마커를 배치하고, 데이터에 마커를 배치하고, 평면이 이동하고, 마커를 ize하면 새 마커가 선택한 마커에 연결되고 연속적으로 선택된 마커가 연결됩니다.
그런 다음 볼륨 추적기 창에서 마우스 오른쪽 버튼을 사용하여 마커 배치를 선택하고 마커 및 링크에 대한 반경을 삽입합니다. 다음으로, 볼륨 데이터를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 마커를 배치하기 시작합니다. 마커는 볼륨 트레이서 대화 상자에서 자동으로 연결됩니다.
파일을 선택하고 현재 마커를 저장합니다. 파일 닫기 마커를 설정합니다. 집합. 새 마커 세트를 열어 원하는 두 번째 피쳐로 모델을 구축하기 시작합니다.
마커 세트 간의 대비되는 색상을 활용하여 기능의 차이를 강조합니다. 관심 피처의 수동 추적은 인구 밀도가 상대적으로 작고 피처 추출의 정확성이 가장 중요한 경우에 사용되는 시간 소모적인 접근 방식입니다. 시작하려면 수동 추적 옵션이 있는 프로그램으로 볼륨 데이터를 가져옵니다. 소프트웨어.
이 기능을 사용하면 일반적으로 기본 페인트 브러시 도구를 제공합니다. 이 데모에서는 대형 토모에 Amira 소프트웨어가 사용됩니다. open data를 선택하고 파일 이름 rec를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.
그런 다음 형식을 클릭하고 원시 디스크 데이터를 대용량 디스크 데이터로 선택하십시오. 좋아, 그리고 로드. 헤더 정보에서 적절한 원시 데이터 매개변수를 선택하고 확인을 클릭합니다.
토글하고 새 파일 이름으로 저장합니다. AM 파일. 3D 이미지 시퀀스의 경우 열린 데이터를 선택하고 파일 이름 tiff 또는 파일 이름 dot mrmc를 선택합니다.
그런 다음 토글하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 파일 이름으로 저장을 선택합니다. 3D 뷰어 창에서 직교 슬라이스를 선택하여 이미지 파일을 엽니다. 그런 다음 아래쪽에 있는 슬라이더를 사용하여 슬라이스를 탐색하여 큰 디스크 데이터로 열린 더 큰 데이터를 자릅니다.
풀 창에서 파일 이름을 전환하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 격자 액세스를 선택합니다. 원하는 상자 크기를 입력하고 상자를 원하는 영역으로 이동한 다음 적용을 클릭합니다. 새 파일을 저장합니다.
다음으로, 풀 창에서 파일을 전환하여 세분화 파일을 만듭니다. 그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 라벨링 라벨 필드를 선택합니다. 새 파일이 생성되고 세그멘테이션 편집기 탭과 개체 풀에 자동으로 로드됩니다.
페인트 브러시 도구를 사용하여 관심 있는 첫 번째 피처의 테두리를 추적합니다. 브러시 크기를 원하는 대로 변경한 다음 마우스 포인터를 사용하여 관심 피쳐의 테두리를 추적합니다. 그래프선 영역을 바로 가기 F로 채웁니다.더하기 기호가 있는 버튼을 클릭하여 선택 영역을 추가합니다.
모든 슬라이스를 통해 관심 있는 기능을 따르고 수동 추적 세분화를 반복합니다. 시각화 및 기본 정성적 또는 정량적 분석을 위한 표면 렌더링을 생성합니다 소프트웨어 사용자 가이드 지침에 따라 개체 풀 탭에서 풀 창에서 파일 이름 레이블 am을 토글합니다. 그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 surface gen을 선택합니다.
원하는 표면 특성을 선택하고 적용을 클릭합니다. 풀에 새 파일 파일 이름 surf가 생성됩니다. 분할된 볼륨을 시각화하려면 풀 창에서 파일 이름 surf를 토글합니다.
그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 표면 뷰를 선택합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 시각화 및 정성적 분석을 위한 표면을 생성합니다. 자동화된 밀도 기반 세분화는 다양한 대비, 선명도 또는 혼잡도를 가진 데이터 세트에 사용되어 관심 있는 밀도를 회수하고 임계값 마술 지팡이 또는 자동 세분화를 위한 기타 밀도 기반 도구가 장착된 프로그램으로 볼륨 데이터를 가져오기 시작합니다.
관심 기능의 수동 추적 기술에서 수행된 것처럼 이 데모에서는 명확하게 구별할 수 있는 여백이 없는 기능에 대해 Amira 소프트웨어가 사용됩니다. 임계값 아이콘을 선택하여 임계값 도구를 사용합니다. 슬라이더를 조정하여 원하는 범위 내에서 밀도를 조정하면 관심 있는 기능만 마스킹됩니다.
선택 버튼을 클릭한 다음, 더하기 기호가 있는 버튼을 클릭하거나 바로 가기를 사용하여 선택 항목을 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 시각화 및 정성적 분석을 위한 표면을 생성합니다. 모두 네 번째 접근 방식입니다.
맞춤형 자동 세분화를 사용하여 대규모 데이터 세트를 효율적으로 분할할 수 있지만 matlab과 같은 프로그램에 대한 지식이 필요합니다. 이 방법에 대한 단계별 지침은 맞춤형 세분화에 대한 보충 비디오를 참조하십시오. 6개의 예시 데이터 세트는 4개의 접근 방식으로 세분화되었습니다. 수동 추상화된 모델 생성, 관심 있는 기능의 수동 추적, 자동화된 밀도 기반 세분화 및 맞춤형 자동 세분화 수동 추상화된 모델 생성은 수지에 효과적이었습니다.
입체섬모의 임베디드 염색 단층 촬영은 식물 세포벽의 수지 내장 염색 단층 촬영에 대한 정확한 밀도를 추출하는 것이 아니라 정량적 목적을 위한 모델을 만드는 것이 목적이었습니다. 자동화된 밀도 기반 세분화는 많은 슬라이스를 통해 셀룰로오스를 빠르게 추출하는 데 가장 효과적이었습니다. 수동 방법은 몇 개의 데이터 조각에만 더 많은 노력을 기울였습니다.
수동 추상화 모델 생성은 키노실리움의 스테이지 단층촬영에서 미세소관 삼중항을 생성했으며, 두 가지 자동화된 접근 방식은 밀도를 더 빨리 추출했기 때문에 집속 이온 빔의 미토콘드리아의 모양, 유방 상피 세포의 주사 전자 현미경으로 인해 선호되었습니다. 수동 추적은 가장 깨끗한 결과를 제공했으며 인구 밀도가 낮아 빠른 세분화가 가능했습니다. 세분화해야 하는 양이 많기 때문에 맞춤형 자동 세분화는 직렬 블록 얼굴 주사 전자 현미경 박테리아 데이터를 분할하는 데 가장 효율적인 것으로 입증되었습니다.
시간이 많이 걸리지만 유방 상피 세포막의 집속 이온 빔 주사 전자 현미경을 추출하는 유일한 방법은 수동 추적이었습니다. 세분화 접근법의 개발은 구조 세포 생물학의 새로운 분야인 이 분야의 연구자들이 다양한 세포 배양, 오가노이드 배양 또는 모델 유기체에서 고분자 복합체, 세포 소기관 및 세포 수준에서 세포 3D 아키텍처를 탐구하고 결정할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 데이터 세트에 대한 최적의 세분화 접근 방식을 선택하고 적용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
개요
이 연구는 3D 전자 현미경 데이터의 특징 추출 과정에서 직면하는 문제를 다룹니다. 다양한 데이터 유형에 가장 적합한 분할 방법을 선택하는 데 연구자들에게 지침을 제공하는 기준 집합을 제시합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물학
- 전자 현미경
배경
- 3D 전자 현미경은 세포 구조에 대한 상세한 통찰력을 제공합니다.
- 분할은 복잡한 3D 밀도 맵을 분석하는 데 중요합니다.
- 다양한 분할 방법에는 수동, 반자동, 자동화된 접근법이 포함됩니다.
- 연구자들에게 적합한 방법을 선택하는 것은 어려울 수 있습니다.
연구 목적
- 복잡한 3D 전자 현미경 데이터셋에서 관심 특징을 분할합니다.
- 분할 선택을 위한 데이터 특성을 평가합니다.
- 최적의 특징 추출을 위한 다양한 분할 전략을 비교합니다.
사용된 방법
- 개별 전자 현미경 이미지 수집.
- 원본 2D 데이터를 3D 볼륨으로 재구성합니다.
- 노이즈를 줄이고 특징을 강화하기 위한 필터링.
- 분할 방법 선택을 위한 데이터 특성 평가.
주요 결과
- 특징 추출의 다양한 방법을 시연했습니다.
- 선택된 분할 전략에 기반한 최종 3D 분할 모델을 보여주었습니다.
- 각 분할 접근법의 장점과 한계를 강조했습니다.
- 분할에 처음 접하는 연구자들에게 지침을 제공했습니다.
결론
- 3D 전자 현미경 데이터를 분석하기 위해서는 효과적인 분할이 필수적입니다.
- 적합한 방법의 선택은 데이터셋의 특정 특성에 따라 다릅니다.
- 이 연구는 연구자들이 분할 관행을 개선할 수 있는 프레임워크를 제공합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
In biopharma R&D, accurate 3D ultrastructural analysis of cellular components is critical for target validation and mechanistic de-risking. This guide provides a decision framework for selecting optimal segmentation strategies based on data characteristics, directly supporting reproducible phenotypic screening and assay development. By enabling precise visualization and quantification of macromolecular complexes and organelles, it enhances predictive confidence in preclinical models and reduces biological ambiguity in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by clarifying 3D organization of adhesion complexes and cytoskeletal structures.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional target validation via direct visualization of macromolecular machines in native context.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing quantitative structural data to assess target engagement and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating reproducible 3D segmented models of organelles and cellular structures.
- Operational Value: Addresses assay standardization and scalability through consistent surface rendering and quantitative analysis outputs.
- Strategic Value: Enables reliable compound evaluation by ensuring segmentation readiness across diverse data sets with varying signal-to-noise ratios and feature densities.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking ultrastructural changes in organelles to pathophysiological mechanisms in model systems.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-platform comparison of segmentation outcomes.
- Predictive Value: Focuses on mechanistic de-risking by reducing ambiguity in target pathway interpretation via objective feature extraction.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to lead identification and preclinical validation, supporting data-driven decisions at each stage based on ultrastructural fidelity.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking by enabling direct visualization of feature interactions in 3D space.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs through standardized surface rendering and feature extraction across manual, semi-automated, and automated approaches.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, and statistical outputs such as volume, surface area, and morphological parameters that help teams compare conditions and assess compound effects.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity and biomarker alignment by linking ultrastructural phenotypes to functional outcomes in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, enabling cross-project standardization and knowledge transfer across teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in ultrastructural biology and 3D data interpretation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including EM imaging platforms and segmentation software (e.g., Amira, Kymera, MATLAB).
- Cross-team standardization requirements for consistent thresholding, tracing, and algorithm application across sites.
- Adaptation considerations across model systems such as cells, tissues, organoids, and model organisms.
- Practical limitations including time investment for manual methods and computational demand for custom automated pipelines.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
4:47
Manual Tracing of Features of Interest
2:04
Manual Abstracted Model Generation
8:10
Automated Density-based Segmentation
9:15
Custom-tailored Automated Segmentation
9:41
Results: Application of Four Segmentation Approaches to Example Data Sets
11:29
Conclusion
