Zebrafish의 성인 Telencephalon의 자상 부상 : 척추 동물의 뇌 신경 발생과 재생을 조사하는 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 성인 신경 발생 및 중추 신경계 재생 및 복구와 관련된 세포 반응과 분자 메커니즘을 조사하는 것입니다. 제브라피시의 경우, 이것은 먼저 성인 제브라 피쉬의 오른쪽 두부 반구에 구멍을 뚫어 수동으로 부상을 발생시켜 달성됩니다. 다음으로 부상 후 5일째가 되면 물고기를 희생시키고 뇌를 해부하여 오메(ome)를 절편화하기 위해 아로스(aros)에 박습니다.

그런 다음 뇌 절편은 면역조직화학(immunohistochemistry) 또는 C에서 적절한 마커를 가진 두 개의 혼성화(hybridization)에 의해 염색됩니다. 세포 증식을 관찰하기 위해 증식 마커, PCNA, 무선 신경교세포 마커 S 100 베타 및 찌르기 상처 시 심실 영역에서 표지된 두 개의 EGFP 표지된 희소돌기아교세포 전구세포의 상향 조절을 보여주는 신경교세포, 무형성 및 신경 발생 결과를 얻습니다. 조직 또는 세포 유형 특이적 절제를 생성하기 위한 형질전환 접근법에 대한 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 단순성, 속도 및 원인 효율성으로 단시간에 많은 손상된 뇌를 생산할 수 있다는 것입니다.

성체 얼룩말 물고기를 마취한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 위에서 내려오는 빛으로 해부 현미경 아래 트리카에 적신 티슈 페이퍼 블록의 슬릿에 개별 물고기를 놓습니다. 한 손으로 물고기를 부드럽게 잡고 30게이지 바늘이 장착된 주사기로 위에서 머리에 접근할 수 있는 방향으로 물고기의 방향을 잡습니다. 다른 한편으로, 바늘을 두개골을 통해 수직으로 밀어 넣고, 2mm 이하로 한쪽 두부 반구의 내측 영역으로 밀어 넣습니다.

두부 부상을 입은 후 생선을 민물고기 물에 넣으십시오. 완료되면 물고기를 물 흐름 시스템으로 다시 옮깁니다. 물고기가 원하는 시간 동안 회복되도록 하고 텍스트 프로토콜에 따라 안락사시킨 후 얼음 위에 제물로 바치고 날카로운 가위를 사용하여 아가미 뒤를 잘라 머리와 몸통을 분리합니다.

출혈이 가능하도록 5분 동안 하나의 XPBS에 머리를 배양합니다. 그런 다음 머리를 PBS의 4%파라 포름알데히드로 옮기고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 또는 고정 후 실온에서 4시간 동안 배양합니다. 페트리 접시에 하나의 XPBS를 사용하여 머리를 두 번 씻으십시오.

그런 다음 해부 현미경으로 PBS의 뇌를 조심스럽게 해부합니다. 눈에 띄는 병변이 없는 뇌는 모두 버리십시오. 1.5밀리리터의 100% 메탄올로 채워진 두 개의 밀리리터 반응 튜브로 뇌를 옮기고 튜브를 5번 뒤집은 후 영하 20도에서 최소 16시간 동안 배양합니다.

면역조직화학을 위해 조직을 재수화하려면 PBS 트윈 20 또는 PTW를 사용하여 뇌를 5회 세척하기 전에 하강 메탄올 시리즈로 각각 5분 동안 뇌를 배양합니다. 각각 5분씩. 뇌를 삽입하려면 전사 피펫을 사용하여 폴리에틸렌 성형 컵 트레이의 구멍에 넣고 600와트의 전자레인지로 가열하여 1개의 XPBS에 2%아그로스를 용해합니다.

사용하기 전에 아그로스를 3분 동안 식히십시오. 그런 다음 aros를 사용하여 곰팡이를 완전히 채우기 전에 한쪽 뇌에서 PTW를 조심스럽게 제거합니다. 해부 바늘을 사용하여 아로스에서 뇌를 소용돌이쳐 PTW를 씻어내고 복부 쪽이 아래로, 등쪽이 위로 향하게 하여 뇌를 똑바로 세우고 아그로스가 식도록 합니다.

해부 바늘을 사용하여 금형에서 agros 블록을 제거합니다. 그런 다음 날카로운 면도날로 뇌의 뒤쪽 끝에 있는 발톱 두팔론과 평행하게 아그로스를 자릅니다. 이제 블록을 뒤집기 전에 뇌의 앞쪽 끝에서 아그로스를 잘라서 뒤쪽 평면에 서도록 합니다.

뇌의 등쪽과 복부와 평행하게 절단하여 과도한 아그로스를 제거하십시오. 그런 다음 뇌를 뒤로 뒤집어 복부 쪽에 놓이게 합니다. 마지막으로, 블록을 세팔론이 더 작은 평면에 위치한 잘린 삼각형으로 자릅니다.

제조업체의 지침에 따라 바이옴을 준비한 후 하나의 XPBS를 사용하여 버퍼 배스를 채워 블레이드 바닥에 닿도록 합니다. 다음으로 바이브레이터의 표본 디스크 상단에 작은 초강력 접착제 점을 놓습니다. 그런 다음 뇌 뒤쪽에 위치한 블록의 평면을 초강력 접착제에 조심스럽게 놓습니다.

마이크로톰 매니퓰레이터를 사용하여 표본 디스크를 버퍼 트레이에 삽입하고 표본 디스크를 원하는 위치로 회전합니다. 그런 다음 3mm 육각 렌치를 사용하여 나사를 조이고 매니퓰레이터를 제거합니다. 두판이 표면 바로 아래에 있고 뇌의 등쪽이 칼날을 향하여 뇌를 절단하도록 블록을 완충 수조에 배치합니다.

진동하는 마이크로톰이 있는 플레이트의 웰에 뇌당 1ml의 차단 버퍼를 추가하여 섹션을 수집하기 위한 24웰 플레이트를 준비합니다. 50마이크로미터 두께, 초당 1밀리미터 속도, 70헤르츠 주파수로 절편을 시작합니다. 합성 브러시를 사용하여 칼날에서 떨어지는 얇은 아로스 조각을 집어 24웰 플레이트에 모읍니다.

면역조직화학을 수행하려면 실온에서 1시간 동안 비특이적 부위를 차단합니다. 배양 후 완충액을 제거하고 차단 완충액에 희석된 항체 250마이크로리터를 첨가하여 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 또는 실온에서 2시간 동안 배양한 후 PTW를 사용하여 각각 1분씩 3회 샘플을 세척합니다. 실온에서 2시간 동안 2차 항체를 배양한 후.

섹션을 세 번 씻으십시오. 수용성 비형광 장착 매체를 사용하여 섹션을 장착합니다. 그런 다음 화합물 또는 컨포칼 현미경으로 샘플을 분석합니다.

적절하게 수술을 받으면 상처는 등쪽에서 배쪽까지 뻗어 있는 세팔론의 손바닥을 통해 35일 후에 치유되는 병변관으로 이어집니다. 이전에는 면역조직화학을 사용하여 표시되었습니다. 이러한 상처는 PCNA, S 100 베타의 상향 조절을 유발하고, 병변 발생 후 3-7일째에 중첩 패턴이 나타나는데, 이는 방사상 신경교세포의 증식을 나타냅니다.

이 그림은 병변 후 35일째까지 더 이상 관찰되지 않는 형질전환 올리그 2 EEG FP 어류에서 유도된 찌른 상처에 근접한 희소돌기아교세포 전구세포 또는 OPC의 일시적인 축적을 보여줍니다. 병변이 제대로 도입되지 않으면 병변관이 보이지 않습니다. PCNA 및 S 100 베타의 상향 조절 또는 OPC의 축적은 검출할 수 없습니다.

여기에 제시된 바와 같이, 병변이 있는 물고기의 뇌에 있는 전사 조절자와 야생형 뇌를 비교하는 전신 발현 검사는 망원두팔론에서 발현되고 손상에 대한 반응으로 상향 조절되는 여러 요인을 확인했습니다. 예를 들어, RNA 심층 염기서열분석 및/또는 현장 교잡법과 결합된 계단식 방법은 제브라피시 성체 신경 발생, 재생 및 복구에 관여하는 새로운 유전자를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.