Name: 단백질 삭제의 유도를 통해 자궁 내 일렉트로는 형질 전환 모델에서 신경 세포의 마이그레이션에 적자를 정의하려면 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: 학습하세요 자궁 내 전기천공법을 이용한 형질전환 마우스 모델에서 신경 발달 및 이동 결함 분석 방법을. CRE 매개 유전자 절제를 통해 특정 뉴런 집단에서 세포 자율적 기전을 연구할 수 있습니다.

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우리는 자궁 내 전기천공법을 도와준 Pierre Mattar와 Freda Miller, 그리고 다이어그램을 만든 Noel Ghanem과 Bensun Fong에게 빚을 지고 있습니다. 뛰어난 기술 지원을 제공해 주신 Linda Jui와 Jason G. MacLaurin에게 감사드립니다. 장비는 뇌졸중 회복 센터(Centre for Stroke Recovery)의 지원을 받았습니다.
이 작업은 HSFO와 OGS에서 D.S.S.에 수여하는 장학금과 R.S.S.에 대한 CIHR 보조금의 지원을 받았습니다.

참고 : 모든 실험 동물 관리에 캐나다위원회의 가이드 라인을 준수, 오타와의 동물 관리 윤리위원회의 대학에 의해 승인되었다. 1. 수술 전 준비 및 재료 <ol><li> 플라스미드 준비 : <ol><li> 제조업체의 프로토콜에 따라 키아 MegaPrep를 사용하여 플라스미드를 준비합니다. 높은 DNA 수율을 보장하고 밤새 품어 변형 박테리아 LB 배지의 적어도 400 ml에 Innoculate. </li><li> 적어도 5 ㎍ / μL 최종 농도 100-200 μL에 재현 탁 TE 플라스미드. -20 ° C에서 나누어지는 DNA를 저장. 농도가 너무 낮 으면, 석출되지 않고 불순물이 추가로 재현 탁. 새로운 준비를 시작. </li><li> 수술하기 전에, 0.1 % 희석 플라스미드 용액 10 또는 20 μL 당 (w / v)의 빠른 그린 염료의 1 μL에 멸균 물에 2 ㎍ / μL에 하나의 플라스미드 (예를 들어 Cre 호텔 - GFP)을 희석. GFP 경우GFP로​​ 표시된 모든 셀 모두 - 일렉트로 공동되는 가능성을 최대화하기 위해 4 : 관심있는 유전자는 GFP 플라스미드 1의 비율로 목적 유전자를 운반하는 플라스미드를 주입​​, 별도의 플라스미드 상에 공동 전기 천공하여야하며 플라스미드. </li></ol></li><li> 62 ° C에서 한 단계 끌어 오기를 사용하여 표준 바늘 풀러에 - 유리 마이크로 모세관 튜브 (이하 바늘로 언급 1mm 외경)을 당깁니다. </li><li> 다음이 포함 된 수술 팩 압력솥 : 니들 홀더, 상처 견인기, 집게, 수술 가위, 바늘 가위, 스테이플러, 스테이플, 거즈, 상처 커버, 수술 용 드레이프 (그림 1A, B, 재료 표). </li><li> 다른 필요한 도구를 수집 : Electroporator, Femtojet Microinjecter, Tweezertrodes (5 ~ 7 mm)를, 식염수, 봉합, 5 ML의 주사기 (자료 표). </li></ol> 2. 수술을 위해 마우스를 준비 <ol><li> 통증 관리를 위해 타임-P를 주입일시간 수술 전 부 프레 놀핀 (0.05 ㎎ / kg 체중)에 우세한 마우스. E17.5에 배아 일 12.5 (E12.5)에서 아무 곳이나 초과 마우스에이 프로토콜을 적용합니다. </li><li> 백로드하는 microloader 피펫 팁을 사용하여 플라스미드 솔루션 바늘을 뽑아. 이 바늘이 막힐하는 원인이됩니다 아직 바늘의 끝으로 모든 방법을 기입하지 마십시오. </li><li> 1 L / 분 O 2 2-5% 이소 플루 란 가스를 사용하여 마우스를 마취시키다. 일단 움직이지, 얼굴에 마스크를 취하게하고 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. 1 ml의 생리 식염수 다시 (0.9 % 염화나트륨) 피하에 주입한다. 참고 : 이소 플루 란 가스로 작업 할 경우, 초과 가스를 탈환하고 방으로 탈출을 방지하기 위해 가스 제거제를 사용합니다. </li><li> 복부를 면도. , Chlorohexadine 스크럽으로 복부를 씻어 물로 씻어 및 chlorohexadine 및 70 % 에탄올의 최종 준비 솔루션을 적용 할 수 있습니다. 멸균 드레이프 또는 거즈 커버 마우스 모피를 포함하지만 복부 노출 (그림 1C, D)을두고있다. </li></ol>자궁 전기 천공 법 (electroporation)에서 <ol><li> 낮은 유두 사이의 복부를 통해 피부에 절개를합니다. 결합 조직을 찢어서 멀리 하부 근육층으로부터 피부를 당겨, 다음 백선 알바 따라 복강 복막 통해 잘라. 떨어져 상처의 가장자리를 당겨 상처 견인기를 삽입합니다. </li><li> 복강에서 자궁을 제거하고 그림 (그림 1E)로 배치. <ol><li> 다른 새끼 (예 관심 유전자 GFP 대 GFP와 같은) 다른 플라스미드를 주입 할 경우, 각 측면에 새끼를 카운트하고 각 플라스미드 얼마나를 주입하는 것을 결정하고. 다시 따뜻한 윤활 배아를 유지하기 위해 복부에 자궁의 한쪽을 교체합니다. 즉시 식염수 노출 자궁 (바람직하게는, 체온으로 가온)을 적시고. </li><li> 같은 플라스미드 모든 새끼를 주입하면 ONL (예 : 유전자 변형 배아에 Cre 호텔 - GFP를 주입 할 때 등)Y는 한 번에 자궁의 하나의 뿔을 제거합니다. </li></ol></li><li> 작은 수술 가위 또는 미세 집게 한 쌍의 끝을 잘라 조심스럽게 주입 지팡이의 손잡이 머리에로드 된 바늘을 넣고. 여전히 유체 (그림 1Ji-IV)를 통과 할 수 있도록하는 동안 바늘만큼 가능한 한 유지되도록 끝을 잘라. <ol><li> 풋 패드 누를 때 0.1-0.2 μL의 작지만 쉽게 볼 액 적이 바늘의 팁에 나타나도록 마이크로 인젝터에서 (초)의 주사 길이와 분사 압력을 조정한다. 다른 바늘 사이에 최대한의 일관성이 방울의 볼륨을 유지합니다. 참고 :이 단계는 배아의 생존 (설명 참조) 매우 중요하다. </li><li> Femtojet에 대해 다음 주입 매개 변수를 사용하여 압력을 주입 (PI) = 250 ~ 300 헥토 파스칼; 주입 시간 (TI) = 0.8 ~ 1.2 초; 보상 압력 = 10 ~ 50 헥토 파스칼. 필요한 경우, 바늘 사이의 변화를 수용하기 위해 이러한 매개 변수를 조정합니다. </li></ol></li><li> 에스배아을 선출하고 부드럽게 다시 위쪽으로 기울어 진 머리 (그림 1 층)에 위치. 참고 :이 켜거나 배아를 이동해야 할 수 있습니다; 너무 많은 압력을 적용하고 배아를 조작하는 동안 양막의 파열을 방지하지 않도록주의하십시오. </li><li> 배아가 작성되면, 시상 동에 초승달 모양의 그림자 병렬로 제시 뇌실을 찾습니다. 약간의 각도에서 심실 위의 자궁에 바늘의 끝 부분을 터치하고 자궁 벽을 통해 바늘을 안내합니다. 설정 압력의 크기는 바늘의 선명도에 의존한다. 뇌실에 피질을 통해 바늘을 밀어 넣습니다. 참고 : 거의 모든 추가 검출 저항 없지만 태아의 머리는 종종 약간 멀리 밀려 후 바늘이 뇌실 내로 통과 피질로 젖혀. </li><li> 플라스미드 솔루션을 주입하기 위해 발 패들 펌프. 녹색 영역이 표시되고 준수 될 때까지 펌프 계속뇌실 (그림 1G)의 아크 모양. 젊은 배아 (E14.5에 E12.5)에서 염료는 종종 반대편 심실로 확산됩니다. 주 : 펌프 수가 바늘 끝의 직경에 따라, 태아 (및 결과적인 심실의 크기)과 원하는 주입량의 연령. 볼륨을 유지하는 것은 배아 사이에 가능한 한 일치 주입. </li><li> 서너 배아를 주입한다. 절차를 통해 식염수와 습기 노출 된 배아를 유지합니다. </li><li> 다시 주입 된 최초의 배아로 이동하고 양극은 뇌 (그림 1H)의 원하는 영역에 플라스미드를 그릴 것 같은 패를 놓습니다. 각도가되도록 음극 전극 사이의 최단 경로는 전기를 대상으로 구조 (도 2)를 통해 직접 통과한다. </li><li> 패 자리에되면, 충격을. 배아의 나이와 크기에 따라 35 ~ 50 V의 5 펄스를 사용 (T 참조수 1). 전기 천공 다음 파라미터를 사용하여 5 msec의 펄스의 길이를 950 밀리 초 펄스 간격으로. 모든 주입 배아와 반복합니다. </li><li> 마지막 바늘 가능성이 건조 단계 3.9 동안 막힘 등의 단계 3.3에서와 같이 새로운 사전로드 된 바늘의 끝을 잘라. 같은 플라스미드 또는 다른 플라스미드 중 세 가지 또는 네 개의 배아의 다음 세트를 주입 한 후 단계 3.9에서와 같이 충격을. 자궁의 한쪽에있는 모든 새끼가 주입 될 때, 여성의 복부에서 자궁의 두 번째면을 제거하고 따뜻하게 유지하기 위해 완성 된면을 교체합니다. </li><li> 양수 주머니에 외상을 방지하기 위해 너무 많은 압력을 적용 식염수가 아닌 촉촉한 표면을 유지하기 위해주의하면서 여성에게 자궁의 양쪽 모두를 돌려줍니다. 단순한 연속하여 스티치를 폐쇄 근육층 봉합사. 스테이플 피부가 닫힙니다. 스테이플을 사용할 수없는 경우, 간단한 인터럽트 스티치 피부를 봉합. (그림 1I) </li><li> suturi 동안NG, 점진적으로 임신 여성의 마취 밝게 할 수 있도록 이소 플루 란을 줄이십시오. 주 : 수술이 완료되면이 댐의 각성을 촉진한다; 배아 생존율을 향상 가능한 한 짧은 시간 동안 마취를 유지 여성. 총 수술 시간, 여성이 먼저 마취 때부터 시작하여, 약 30 분이어야한다. </li></ol> 4. 애프터 케어 <ol><li> 인큐베이터 또는 마취에서 회복하기 위해 가열 패드에 봉합 여성을 놓습니다. 깨끗한 침대에 그녀를 침대와 케이지의 표준 복구 젤은 수분을 유지 놓습니다. 다음 수술 통증 관리를 들어, 수술 후 8 시간 간격으로, 12 시간 간격으로 네 개의 추가 용량으로 부 프레 놀핀 (0.05 ㎎ / kg 체중)의 투여 량 세 여성을 준다. </li></ol> 5. 수확 두뇌 참고 : 두뇌는 성인에 대한 연령까지 수확 할 수있다. 다음이 적용됩니다이전에 출생 두뇌를 수집합니다. 새끼가 태어난 후, 자궁 내 순서는 쓰레기의 모든 강아지 중 하나가 같은 플라스미드를 주입​​해야하므로, 분실, 또는 제어 및 실험 동물을 구별하는 다른 방법이 고안되어야합니다. <ol><li> 감기 (4 ° C에서)를 준비, 여성 안락사 이전에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 필터링. </li><li> 펜 토바 비탈 나트륨 (100mg / kg 체중)의 치사량의 복강 내 주사를 사용하여 여성을 안락사 개방 복부 잘라. 자궁의 양쪽을 잡아 당겨 새끼가 초기에 주입 된 경우와 같이 배치. <ol><li> 모든 새끼는 트랜스 제닉 깔짚 Cre 호텔로 주입 할 때와 같은 플라스미드를받은 경우, 배아 순서에 따라서 PBS 여성 및 여길 자궁 잘라, 중요하지 않다. </li><li> 강아지가 다른 플라스미드를 주입​​ 한 경우, 죽은 새끼를 지적, 각각의 강아지를 찾을 수 있는지, 그리고 제어 및 experimen 주입 된 것 확인여성에서 자궁을 제거하기 전에 탈 플라스미드. 강아지가 자궁 PBS에있는 그룹 후에 속한 추적주의하십시오. </li></ol></li><li> 개별적으로 각각의 강아지를 제거 날카로운 가위 또는 면도날로 목을 베다와 PBS에 머리를 배치합니다. 트랜스 제닉 마우스의 경우, 유전자형 분석을위한 조직 샘플을 수집 및 12 웰 플레이트와 같이, 각 개별 헤드를 유지한다. </li><li> 해부 범위에서 닉에주의하면서 두개골에서 피질 뇌를 제거하거나 중간 선을 찢어. 형광 현미경을 사용하여 성공적 전기 천공 된 것을 나타내는 뇌가 GFP + 패치가 있는지 확인합니다. </li><li> 4 ° C에서 하룻밤 PFA에 침수로써의 머리를 고정합니다. 참고 : PFA는 종종 신호를 소멸하기 때문에 이전의 고정에 GFP의 발현을위한 두뇌를 확인합니다. </li><li> 이전 동결에 적어도 3 일 동안 20 % 자당의 침수를 통해 Cryoprotect 두뇌. t 자당 ​​10 %의 구배, 15 % 및 20 % (각 솔루션에 24 시간)을 사용하여O 삼투압으로 인한 조직 손상을 방지한다. -80 ° C에서 냉동 두뇌를 저장하고 10 ~ 14 μm의 두께 부분에서 저온 유지 장치에 잘라. </li></ol> 안티 GFP 6. 공동 염색 주 : 항원 검색 공동 얼룩 방지와 GFP를 위해 필요한 경우에는 GFP 신호를 손상시키지 않는 부드러운 항원 검색 프로토콜을 사용하는 것이 중요하다. 일부 항원 검색 프로토콜 (심지어 GFP에 대한 항체를 사용) GFP 염색과 함께 사용하기에 너무 가혹. 선행 차 항체의 적용에 염기성 시트르산 전처리 가장 에피토프 24 성공적이다. <ol><li> DDH 2 O. 시트르산 0.01 M 용액을 제조 보정 된 pH 미터를 사용하여 pH 6. </li><li> 구연산 산까지 전자 레인지 또는 물을 욕조에 염색 실에서 열 구연산은 75 ~ 80 ° C를 도달한다. 10 ~ 15 분 동안 염색 실에 슬라이드를 넣습니다. 가능한 한 안정적으로 온도를 유지한다. </li><li> PBS에서 슬라이드를 씻으3X 실온에서 3 분. 차 항체를 적용하고 표준 프로토콜에 따라 면역 염색 진행합니다. </li><li> (그림 3A)를 허물고 확인 GFP를위한 공동 라벨링 및 관심의 유전자에 의해 Cre 호텔 매개 절제의 유효성을 검사합니다. </li></ol>

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자궁의 electroporations에서 수행의 기본 과제의 두 배 치사 및 2) electroporations 사이의 변동성을 감소 방지) 일 수 있습니다. 무딘 바늘 배아에 더 손상을 입힌다으로 사멸을 방지하는 가장 중요한 요소 중 하나는, 바늘 품질이다. 바늘을 절단 할 때에는 여전히 발 패들 (그림 1J)의 펌프 다음 나타나는 유체의 0.1 ~ 0.2 μL의 볼 방울을 허용하면서, 가능한 한 오랫동안 팁을 유지. 바늘이 너무 무딘거나 축이 너무 짧은 경우, 그 결과 조직의 손상은 태아를 죽일 수있다. 바늘의 선단이 지나치게 좋으면 반대로, 충분한 양의 플라스미드를 주입​​하기 위해 너무 오래 걸릴 것이다; 때문에 연구자의 손을 피할 수없는 진동과 배아의 약간의 회전에 너무 오래 원인 손상에 대한 뇌의 바늘을 떠나. 또한, 젊은으로 주사 할 수 있도록 날카로운, 경 사진 팁 바늘을 만들기 위해 microbeveler를 사용더 깨지기 쉬운 배아,이 배아 E13.5 이상 필요하지...

레이디 얼 이주 초기 대뇌 피질의 개발에 중심 과정이다. 여기에는 올바른 유사 분열 출구 및 신경 분화, 세포 극성 골격 역학과 막 관통 수용체의 발현의 조절뿐만 아니라 반경 폐해 지지체의 형성과 같은 비 세포 자율 요소와 같은 셀 자율 다양한 요인에 의존 철새지도의 분비 1-3 분자. 이러한 메커니즘의 임의의 중단 때문에 복잡하고 어려운 과정이 될 수있는 이주에서의 결함의 근본 원인을 판정하는, 트랜스 제닉 마우스 모델 4-8 신경 마이그레이션을 방해 할 수있다. 자궁 전기 (IUE) 보체 간소화하는데 사용될 수있다 이에 따라 유전자 녹아웃 모델의 표현형과의 해석은 반경 마이그레이션 7,9-11에 필요한 중요한 메커니즘을 해명. 자궁 내에서 전기 천공 (IUE)가 프로세스되는 플라스미드에 의해 carryi<html> 관심의 유전자와 기자 모두 ng를하는 것은 마우스 나 쥐 태아의 뇌의 뇌실에 주입 한 후 전류 12 ~ 14의 사용을 통해 심실을 안감 세포로 그려집니다. 이 연구자가 또는 개발 또는 electroporation하여 신경 세포의 기능에 대한 관심이 유전자의 규제 아래의 효과를 분석 할 수 있습니다. IUE 다음, 두뇌는 면역 조직 화학 7,9-11, 전기 생리학 (15) 또는 세포 배양 (16, 17)에 대해 처리 할 수 있습니다. IUE의 주요 이점은 유전자 발현이 고도로 특이 조작 할 수있게된다. 또한, IUE는 지시 전류 (그림 2)을 통해 개발 뇌의 특정 영역을 대상으로하는 데 사용할 수 있습니다. IUE 또한 다양한 프로모터 플라스미드 또는 활성화 시스템의 제어하에 유전자를 운반하는 플라스미드의 주입을 통해 특정 세포 타입을 표적하는 데 사용할 수 10,18-21 (테트라 사이클린 유도 유전자 발현은 예이다). &gt; IUE가 치운다 훈제 연어 매개 유전자 절제 시스템 7-9,11,22와 함께 사용될 수있다 jove_content는 &quot;. Cre 호텔 단백질의 메시지를 인코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드 floxed 대립 유전자 배아 동형 접합체 (에 electroporation 수 하는 유전자 또는 특정 DNA 영역은 Cre 호텔 중재 DNA 재조합에 대한 두 가지에 loxP 사이트)에 의해 측면에 있습니다. Cre 호텔은 다음 구체적으로 electroporation하여 신경 전구체에 대한 관심의 유전자의 재조합을 유도 할 것이다,의 floxed allele.The 효과를 노크 아웃을 생성 신경 영동 개별 뉴런 내 개발 단백질 분해 후 연구 될 수있다. Cre 호텔의 일렉트로 그대로지지 환경을 떠나는 영향 세포의 작은 집단에서 재조합을 유도한다. 반대로, 특정 세포 유형의 제어하에 Cre 호텔의 조직 특이 적 발현 프로모터, 조직 전체에 걸쳐 발생 모두 마이그레이션 neuroblasts 및 주변 환경의 영향을받을 수있다. 따라서, 그렇게 jux이 두 가지 방법의 taposition은 주어진 마이그레이션 결함이 자율적 또는 셀이 아닌 자율적 인 메커니즘을 세포에 의한인지 여부를 확인 할 수 있습니다. 두 실험 시스템의 결함 마이그레이션이 제안 셀 자치기구에서 관찰 된 표현형 결과 그; 조직 특이 Cre 호텔 모델에서 결함이 이주 Cre 호텔의 전기 다음 정상 마이그레이션은 관심의 유전자가 아닌 세포 자율 메커니즘을 통해 작동하고 있음을 나타냅니다. 또한 IUE 녹아웃 동물 7,9,10 전위에 작용하는 유전자를 구조 electroporating하여 실험을 수행하는 데 사용될 수있다. 예를 들어, 연구자는 다운 스트림 대상을 electroporating 및 마이그레이션 결함이 일렉트릭 뉴런에서 해결 여부를 결정하여 형질 전환 모델의 마이그레이션 표현형을 구출하려고 시도 할 수 있습니다. 이것은 성공적인 구조 정상적인 마이그레이션 SPE에서 단백질 발현을 조작함으로써 복원 될 수 있음을 나타낸다 추가적인 이점을 갖는다cific 뉴런, 주위 환경​​이 여전히 표적 유전자 결핍에도. 다시,이 방법은 더 많은 시간과 불량 메커니즘 자율 셀인지 여부를 판단하는 추가적인 이점과 함께, 트랜스 제닉 라인들을 교차하거나 발생보다 비용 효과적이다. IUE는 노크 배아 (그림 4C)에 리포터 플라스미드의 전기를 통해 신경 세포 마이그레이션을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 수술시 심실 안감에만 뉴런 17 일렉트로됨에 IUE는 생체 내에서, 형태의 시각화 이점과 특정 시간에 태어난 뉴런을 수행하는데 사용될 수있다. 마지막으로, 이러한 내측 등쪽 telencephalon, 해마 신경절 또는 융기 (도 2)와 같은 뇌 영역을 대상 IUE를 사용하는 것이 가능하다. 이는 연구자에게 합병증 결과 특정 영역에서 독립적 유전자 기능을 연구 할 수있는 능력을 준다이웃 구조에서 단백질 분해에서 보내고. 망막 모세포종 단백질 (pRb와는), P107과 P130은 포켓 단백질 가족을 포함하고 잘 세포주기 출구의 규제를 설정됩니다. 그러나, 이들 단백질은 또한 신경 발달의 세포주기 독립적 양태를 조절한다는 증거가 증가하고있다. 우리는 앞에서 설명한 것처럼, pRb와 및 P107은 모두 접선 4,23 및 방사형 마이그레이션 6에 중요한 역할을한다. 여기, 우리는 유전자 변형 모델에 Cre 호텔의 자궁 전기에서의 사용을 예시하는 신경 마이그레이션 6 포켓 단백질 가족 PRB 할당과 P107의 역할을 보여줍니다. 요약하면, IUE 유전자 삭제 (또는 과발현)의 셀 자치 효과를 분석하는 강력한 방법을 제공합니다. 모델을 노크 특정 조직과 함께 사용하면 IUE 신경 마이그레이션을 제어 메커니즘에 관한 추가 정보를 제공 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Square Wave Electroporator</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td>Electroporator only &ndash; 케이블을 별도로 구매하십시오 (45-0204)</td></tr><tr><td>1250FS ECM 830</td><td>BTX Harvard Apparatus</td>용 풋스위치 <td>45-0211</td><td>Foot paddle은 핸즈프리 전기천공법을 위해 필요합니다</td></tr>. <tr><td>Tweezertrodes</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0489 (5mm)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 45-0488 (7mm)</td><td>플래티넘 포셉트</td></tr><tr><td>스타일 전극 Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td>Microinjector</td></tr><tr><td>Griphead 0</td><td>Eppendorf</td><td>920007414</td><td>당겨진 바늘을 고정합니다.</td></tr><tr><td>범용 모세관 홀더</td><td>Eppendorf</td><td>920007392</td><td>그립헤드를 튜브에 연결합니다</td></tr><tr><td>. 주입 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>920007431</td><td>모세관 홀더를 Femtojet에 연결합니다</td>.</tr><tr><td>Foot Control</td><td>Eppendorf</td><td>920005098</td><td>핸즈프리 주입을 위한 풋 패들</td></tr><tr><td>Microloader Tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Pulling Capillary Tubes 로딩 팁</td></tr><tr><td>Plasmid Mega Kit</td><td>Qiagen</td><td>12181</td><td>5 QIAGEN-tip 2500, 시약, 완충액</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>무독성 염료</td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>정밀 과학 도구</td><td>14084-08</td><td>바늘 다듬기 용</td></tr><tr><td>Bonn Strabismus 가위</td><td>정밀 과학 도구</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 집게</td><td>정밀 과학 도구</td><td>11050-10</td><td>스트레이트</td></tr><tr><td>Colibri 견인기</td><td>정밀 과학 도구</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>스테이플러</td><td>정밀 과학 도구</td><td>12031-07</td><td>7mm 클립 용</td></tr><tr><td>Castroviejo 바늘 홀더</td><td>의료 도구</td><td>SNH-6737</td><td>스트레이트, 잠금</td></tr><tr><td>바늘 풀러</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>마이크로 커패시터 당기기용</td></tr><tr><td>마이크로 모세관</td><td>Drummond</td><td>1-000-800</td><td>0.4 mm 내경 유리 모세관</td></tr></tbody></table>

단백질 삭제의 유도를 통해 자궁 내 일렉트로는 형질 전환 모델에서 신경 세포의 마이그레이션에 적자를 정의하려면

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

트랜스 제닉 마우스 라인 치운다 된 LOX 시스템을 사용하여 유전자 결실은 단백질의 기능을 연구하는데 사용되는 강력한 툴이다. 그러나, 매우 구체적인 Cre 호텔 모델을 제외하고, 조직 또는 세포 인구에 걸쳐 단백질의 삭제는 종종 여러 상호 작용 메커니즘에 의한 복잡한 표현형에 연결됩니다. 문제, 또는 해당 셀의 환경 손상으로부터 초래 비 자율기구 셀로부터 셀로의 극한이다 자율 셀기구의 파괴로부터 표현형 결과를 분별하기 어려운 될 수 있는지 여부를 결정하는 단계. 자궁 전기에서, 생체 맥락에서 단백질의 기능에 대한 통찰력을 얻으려면 (IUE)가 개발 피질 또는 다른 선택 뇌 영역 내 세포의 작은 하위 집합 유전자 삭제를 할 수 있습니다. IUE는 지느러미 telencephalon, 중간 telencephalon, 해마, 또는 신경절 예하을 포함한 뇌의 특정 영역을 대상으로하는 데 사용할 수 있습니다. 이 관찰 O를 용이하게건강한 환경의 컨텍스트에서 자율적 셀 유전자 결실의 결과 F. 이 프로토콜의 목적은 IUE 단백질 결실 셀 자율 및 비 - 셀 자율 효과 구별 중시, floxed 트랜스 제닉 마우스 선에서 방사상 이동의 결함을 분석하는 방법을 보여주는 것이다. 뇌 발달에 단백질 기능에 한정된 세포 집단에서 IUE 매개 유전자 결실 대 전체 피질 내의 유전자 결실로 인한 표현형,보다 정밀한 분리하여 비교함으로써 어느 기술을 이용하여보다 더 얻을 수있다.

배아의 머리 위에서 패들 전극의 방향을 달리함으로써 뇌의 서로 다른 영역을 전기천공 타겟으로 설정할 수 있습니다(그림 2). 전뇌의 모든 부위의 경우, 플라스미드를 외측 뇌실에 주입합니다(후뇌는 제4뇌실에 주입하여 타겟팅할 수 있습니다). 일반적으로 두 전극 사이의 직선이 관심 영역을 지나도록 전극을 배치하며, DNA는 양극 쪽으로 끌려갑니다. 외측 피질을 타겟팅하려면(그림 2A), 양극을 녹색 초승달 모양의 상단에 약간의 주둥이 쪽 각도를 주어 배치합니다. 내측 피질의 경우(그림 2B), 양극이 주입되지 않은 반대편 뇌실 위에 오도록 방향을 바꾸며, 이때는 앞쪽 각도를 더 크게 줍니다. 해마를 타겟팅하려면(그림 2C), 양극을 반대편에 배치하되 양극의 각도를 꼬리 쪽으로 줍니다(전기천공은 신경 전구세포가 해마의 최종 위치로 이동하기 전, 여전히 피질 반구의 일부일 때 수행해야 합니다). 신경절 융기를 타겟팅...

뉴런 이동은 수많은 세포 자율 및 비세포 자율 요인에 의해 조절됩니다. 이 프로토콜은 유전자 변형 마우스의 표현형이 세포 고유 메커니즘의 파괴 또는 뉴런과 환경 간의 상호 작용 손상으로 인한 것인지 여부를 결정하기 위해 자궁 내 전기천공법을 사용하는 방법을 보여줍니다.

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

다음 실험의 전반적인 목표는 배아 전뇌의 다양한 영역에 대한 자궁 내 전기천공법을 사용하여 형질전환 마우스 모델에서 신경 발달 및 이동의 결함을 분석하는 것입니다. 이것은 크리(Cree)와 GFP와 같은 리포터 단백질을 운반하는 플라스미드를 배아 뇌의 심실에 주입하고 머리에 전류를 가하여 그 플라스미드를 심실의 세포 내벽으로 끌어들임으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 배아를 댐의 복강으로 되돌려 배아가 계속 발달할 수 있도록 하는 한편, 전기천공된 뉴런에서 특이적으로 유전자 절제를 발현하고 매개합니다.다음으로, 배아를 채취하고 분석을 위해 뇌를 고정하여 전기천공된 뉴런에서 CRE 매개 유전자 절제 및 후속 단백질 녹다운의 효과를 확인하기 위해 관심 유전자의 절제가 면역조직화학을 사용하여 세포 특이적 방식으로 신경 발달 및 이동을 조절하는 방법을 보여주는 결과를 얻습니다. 조직 특이적 형질전환 CRE 라인과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 Cree의 전기천공법이 연구자가 선택한 뇌 영역의 작은 뉴런 집단에서만 관심 유전자를 절제한다는 것인데, 이는 결과를 크게 단순화하고 표현형 분석을 용이하게 합니다. 이 기술의 시각적 시연은 수술 단계를 배우기가 매우 어려울 수 있고 이 단계의 배아는 매우 섬세하여 실수로 손상되기 쉽기 때문에 매우 중요합니다.수술 전에 단일 플라스미드를 멸균수에서 마이크로리터당 2마이크로그램으로 희석하고 희석된 플라스미드 용액 10 또는 20마이크로리터당 부피당 0.1% 중량의 빠른 녹색 염료를 사용합니다. 다음으로, 표준 마이크로 피펫 폴라의 유리 마이크로 모세관 튜브를 섭씨 62도의 단일 단계로 당깁니다. 그런 다음 마이크로 로더 피펫 팁을 사용하여 당겨진 바늘에 플라스미드 용액을 다시 로드합니다.바늘 끝을 끝까지 채우면 바늘이 막힐 수 있으므로 바늘 끝까지 채우지 마십시오. 이 절차에서는 마취된 임신한 마우스의 아래쪽 젖꼭지 사이의 복부 위 피부를 절개합니다. 결합 조직을 찢어 밑에 있는 근육층에서 피부를 떼어냅니다.그런 다음 선형 팔꿈치를 따라 복막을 통해 복강으로 자릅니다. 감긴 견인기를 삽입하여 가장자리를 당겨 분리합니다. 그런 다음 복강에서 자궁을 제거하고 그림과 같이 배치합니다.다른 새끼에게 다른 플라스미드를 주입해야 하는 경우, 양쪽에 있는 새끼를 세고 각 플라스미드로 주입할 새끼와 개수를 결정하고 자궁의 한쪽을 복부로 되돌려 배아를 따뜻하게 유지하고 윤활제를 바르기 위해 노출된 자궁을 즉시 따뜻한 식염수로 적십니다. 다음으로, 주입봉의 그립 헤드에 장전된 바늘을 넣습니다. 작은 수술용 가위나 가는 집게로 바늘 끝을 조심스럽게 잘라 바늘이 액체가 통과할 수 있도록 가능한 한 오래 유지합니다.그런 다음 주입 길이와 마이크로 주입기의 주입 압력을 조정하여 0.1-0.2 마이크로 리터의 작지만 쉽게 볼 수있는 방울이 바늘 끝에 나타나도록합니다. 발 패들을 눌렀을 때 다른 바늘 사이에서 이 물방울의 부피를 가능한 한 일정하게 유지하십시오. 이제 배아를 선택하고 머리를 위로 기울인 상태에서 배아를 등에 부드럽게 눕힙니다.배아가 제자리에 놓이면 시상동과 평행한 초승달 모양의 그림자로 나타나는 심실을 찾습니다. 바늘 끝으로 심실 위의 자궁을 약간 비스듬히 터치하고 바늘이 자궁벽을 통과하도록 유도합니다. 그런 다음 피질을 통해 바늘을 심실로 밀어 넣습니다.다음으로, 발 패들을 펌핑하여 플라스미드 용액을 주입합니다. 녹색 영역이 보이고 심실의 호 모양에 맞을 때까지 계속 펌핑합니다. 어린 배아에서는 염료가 종종 반대쪽 심실로 확산됩니다.총 3개 또는 4개의 배아를 주입하고 노출된 모든 배아를 시술 내내 식염수로 촉촉하게 유지합니다. 첫 번째 배아를 주입하는 것부터 시작하여, 양극이 플라스미드를 뇌의 원하는 영역으로 끌어들일 수 있도록 패들을 배치합니다. 전극 사이의 최단 경로가 전기천공의 대상 구조를 직접 통과하도록 음극의 각도를 조정합니다.패들이 제자리에 놓이면 충격을 가합니다. 배아의 나이와 크기에 따라 35-50볼트의 5개 펄스, 5밀리초 펄스 길이 및 950밀리초 펄스 간격을 사용합니다. 전기천공법의 경우 주입된 모든 배아에 대해 반복합니다.그 후, 자궁의 양쪽을 마우스에게 되돌려 줍니다. 표면을 식염수로 촉촉하게 유지하고 양수에 외상을 입히지 않도록 너무 많은 압력을 가하지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 간단한 연속 스티치를 사용하여 근육층을 봉합합니다.그런 다음 피부를 스테이플러로 닫습니다. 이제 섭씨 4도에서 여과된 4%PFA를 준비합니다. 치사량의 펜토바르비탈 나트륨을 복강내 주사로 동물을 안락사시킨 후 복부를 잘라냅니다.그런 다음 자궁의 양쪽을 당겨 강아지가 처음 주사를 맞았을 때와 같이 놓습니다. 새끼에게 다른 플라스미드를 주입한 경우, 죽은 새끼가 있는지 확인하고 어떤 새끼가 대조군 및 실험용 플라스미드를 주입했는지 확인하십시오. 암컷의 자궁을 제거하기 전에 자궁과 양수에서 각 새끼를 개별적으로 제거하십시오.날카로운 가위나 면도날로 목을 베고 머리를 PBS에 넣습니다. 형질전환 마우스의 경우, 유전형 분석을 위한 조직 샘플을 수집하고 해부 범위 아래의 12웰 플레이트와 같이 각 머리를 분리하고 두개골에서 뇌를 제거하되 피질에 흠집이 나거나 정중선이 찢어지지 않도록 주의합니다. 형광 현미경을 사용하여 뇌에 성공적으로 전기천공되었음을 나타내는 GFP 양성 패치가 있는지 확인합니다.그 후, 하룻밤 동안 PFA로 뇌를 고정합니다. 이제 pH가 이전에 6으로 설정되었던 구연산을 마이크로파 또는 수조의 염색 챔버에서 섭씨 75-80도에 도달할 때까지 가열합니다. 그런 다음 슬라이드를 염색 챔버에 10-15분 동안 넣습니다.그 후, PB S3로 슬라이드를 실온에서 매번 3분씩 세탁합니다. 1차 항체를 적용하고 표준 프로토콜에 따라 면역 염색을 진행합니다. 그런 다음 GFP와 관심 유전자에 대한 공동 라벨링을 통해 CRE 매개 절제를 검증하여 knockdown을 확인합니다.이 그림은 삭제된 유전자의 downstream target에 대한 cos staining에 의한 CRE 매개 절제의 확인을 보여줍니다. RB Flock, P 1 0 7 knockout P 1 30 무리 배아를 빈 PCI 2 플라스미드 또는 PCI 2 Cree 플라스미드로 전기 천공하고 GFP 및 KI 67에 대해 염색했습니다. 세포 증식의 마커.이중 염색 세포는 Cree로 전기천공된 뉴런에서 관찰되었지만 뉴런에서는 관찰되지 않았습니다. psig로 전기천공. 둘이서.RB의 절제는 슬라이드에서 제거된 조직 절편에서 추출한 DNA에 대한 유전형 분석 프라이머로 PCR을 수행함으로써 확인되었습니다. 위쪽 밴드는 F 플록스 대립유전자를 나타내고 아래쪽 밴드는 야생형 대립유전자를 나타냅니다. 화살표는 뇌의 전기천공된 쪽에서 절제된 대립유전자를 나타냅니다.CRE 매개 절제술만이 플록 스톱 코돈과 함께 플라스미드를 사용하여 in vitro에서도 확인할 수 있습니다. NL DS Red RFP와 같은 RFP의 업스트림은 HEK 2 93 세포에서 Cree GFP로 cot transfection했을 때만 EK 세포에서 발현되며, 이는 이 기술에 따라 절제가 성공적이었음을 나타냅니다. 세포 배양, 면역조직화학 또는 전기생리학과 같은 다른 방법을 사용하여 c 매개 유전자 절제 후 개별 뉴런의 발달 및 기능에 관한 추가 질문에 답할 수 있습니다.이 기술을 본 후에는 자궁 내 전기천공법이 뇌의 다른 영역을 표적으로 하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 알 수 있으며, 이는 다양한 형질전환 동물에서 가지고 있는 복잡한 표현형 중 일부를 이해하는 데 실제로 도움이 될 수 있습니다.

induction-protein-deletion-through-utero-electroporation-to-define

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

이 프로토콜은 자궁 내 전기천공법을 통해 C57BL/6 중추신경계의 다른 영역을 구체적으로 transfection하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에는 피질, 해마, 시상, 시상하부, 외측 중격 핵 및 선조체로 발달하는 영역의 형질주입에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.

코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em&gt; 자궁 내</em&gt; C57BL / 6 마​​우스에서 Electroporation에

뇌 결 heterotopia (PNH) 성인에서 대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형의 가장 일반적인 형태는 그러나 그것의 유전으로 가장 산발적 인 경우 알 수 없는 남아 있다. 우리는 최근 MCDs에 대 한 비 발한 후보자 유전자를 식별 하 고 직접 그들의 원인이 역할 비보를 확인 하는 전략을 개발 했습니다.

배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

이 논문은 단일 세포 수준과 형광 표지 된 뉴런의 흥분성 뉴런의 연결 구조를 설명하는 자궁 전기 (IUE)에서 사용하는 프로토콜을 제공한다. 조직학은 수지상 및 축삭 돌기를 특성화하는 데 사용됩니다. 급성 슬라이스 전체 셀 기록 흥분성을 조사하기 위해 사용된다.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

두뇌에 있는 유전자의 세포 자치 기능 손실을 유도 하 여 공부 될 수 있다 또는 셀의 스파스 인구에 있는 기능을 얻을. 여기, Cre recombinase 함수 비보의 손실에 floxed 유전자와 대뇌 피 질의 뉴런 개발의 부족 인구에 제공 electroporation utero에서 설명 합니다.

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 라이브 이미징 기술을 위해 적당 한 마우스 배아에서 electroporated 뇌 organotypic 슬라이스 문화를 생성 하는 저렴 하 고 안정적인 방법을 제공 합니다.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.

자궁에서 두 배의 자궁 전기화는 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 세포 인구를 표적으로 합니다

이 프로토콜에서는 E7.5의 마우스 양수에 렌티 바이러스를 주입하여 생존 또는 배아 발달에 미치는 해로운 영향을 최소화하면서 전체 신경판을 균일하게 형질 도입하는 방법을 설명합니다.

배아 일 7.5에서 자궁 내 나노 주사 (NEPTUNE)에 의한 뮤린 신경 판 표적화

학습하세요 자궁 내 전기천공법을 이용한 형질전환 마우스 모델에서 신경 발달 및 이동 결함 분석 방법을. CRE 매개 유전자 절제를 통해 특정 뉴런 집단에서 세포 자율적 기전을 연구할 수 있습니다.

단백질 삭제의 유도를 통해 자궁 내 일렉트로는 형질 전환 모델에서 신경 세포의 마이그레이션에 적자를 정의하려면

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