말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

이 절차의 전반적인 목표는 혈액 세포에서 신경 줄기 세포를 직접 유도하는 것입니다. 이것은 먼저 혈액에서 CD 34 양성 조혈전구세포를 농축함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 CD 34 세포를 전사 인자를 함유한 센디 바이러스로 transfection하는 것입니다.

다음으로, 신경 줄기세포는 선택적 배지를 사용하여 유도됩니다. 마지막 단계는 유도된 신경줄기세포를 뉴런(neuron), 성상아교세포(astroglia), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 분화시키는 것입니다. 궁극적으로 면역형광 현미경 검사는 생성된 세포를 특성화하는 데 사용됩니다.

섬유아세포에서 직접 뉴런의 지속 시간, IPS 생성과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 IPS 생성 및 계산의 지루한 과정을 우회하지만 여전히 뉴런과 관련될 수 있고 뉴런과 분화할 수 있는 많은 양의 뉴런 세포를 제공한다는 것입니다. 제가 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올린 것은 부착된 형질주입된 CT 34 세포가 실제로 1차 배양된 신경 전구 세포와 매우 유사하다는 것을 알았을 때였습니다. 텍스트 프로토콜의 지시에 따라 말초 혈액 단핵 세포에서 CD 34 세포를 분리한 후, Resus에 의해 CD 34 세포를 배양하는 과정을 시작하고, CD 34 배지에 CD 34 세포를 현탁시킨 다음, 1 밀리리터의 배지에서 웰 당 5 세포까지 3 배 10 내지 5 개의 세포로 세포를 24 웰 플레이트에 파종한다.

5%의 이산화탄소가 함유된 섭씨 37도의 조직배양기에서 24시간 동안 배양한 후, 부유세포를 채취하여 실온에서 110배G의 세포현탁액을 원심분리한다. 그런 다음 상등액을 버리고 새로운 CD 34 유지 배지에 세포를 재현탁합니다. 새로운 24 웰 플레이트를 1 밀리리터의 배지에서 웰 당 10-5 개의 셀로 한 번에 확인하고, 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소 인큐베이터에서 추가로 5 일 동안 배양하고 격일로 배지의 절반을 교체하십시오.

CD 34 세포가 5일째에 본 바와 같이 웰 바닥에 있는 동안 상등액의 상반부를 조심스럽게 흡인합니다. 도금 후, CD 34 세포를 채취하고 실온에서 10 분 동안 170 배 G로 세포를 원심 분리 한 후 상등액을 버리고 이전과 같이 세포를 재현탁 한 다음 1 밀리리터의 배지에서 웰 당 5 번째 세포에 1 회 10 개의 신선한 24 웰 플레이트를 파종합니다. 다음으로 cyto tune IPS Sendi 재프로그래밍 키트를 해동합니다.

먼저 튜브 바닥을 섭씨 37도의 수조에 10초 동안 담근 다음 실온에서 완전히 해동합니다. 튜브를 간단히 원심 분리하고 얼음 위에 놓습니다. 해당 로트에 대해 분석 증명서에 기재된 각 바이러스의 권장 부피를 혼합하여 센다이 바이러스 혼합물을 준비합니다.

15의 감염 배수가 권장됩니다. 센다이 바이러스 믹스를 CD 34 세포의 각 웰에 첨가합니다. 그런 다음 접시를 부드럽게 흔들어 우물을 섞습니다.

24시간 후 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. transduction efficiency를 관찰하십시오. 여기에 표시된 것과 같은 세포 응집체와 구(spheres)는 성공적인 transduction의 지표입니다.

그런 다음 부착된 세포가 나타나고 격일로 여기에 표시된 것처럼 30-50% 합류점에 도달할 때까지 5-7일 동안 조직 배양 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 매체의 위쪽 절반을 다른 웰로 조심스럽게 옮겨 매체의 절반을 변경합니다. 세포 구체가 새로운 세포로 옮겨지면 동일한 양의 새로운 배지를 추가하십시오.

도립 현미경을 사용하여 세포의 co-fluency를 확인합니다. 세포가 30-50% 합류할 때 상등액과 예비액을 흡인하고 각 웰에 1밀리리터의 신경전구 배지를 추가하여 상등액 원심분리기의 구를 사용하여 예비 상등액을 10분 동안 170배 G로 만듭니다. 그런 다음 상등액을 흡인하고 펠릿을 matrigel 코팅된 24웰 플레이트의 신경 전구 매체 플레이트에 재현탁합니다.

이전과 마찬가지로 세포가 60-80% 합류점에 도달할 때까지 격일로 세포의 각 플레이트에서 배지를 변경합니다. 보통 일주일 후. 세포가 필요한 합류점에 도달하면 상층액을 흡인하고 각각에 1ml의 신경 줄기 세포 배지를 추가합니다.

그런 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 분리한 다음 매우 부드러운 피펫팅을 수행합니다. 다음으로, 24웰 플레이트의 1 웰에서 6 웰 플레이트의 1 웰로 세포를 옮깁니다. 웰 플레이트.

웰에 또 다른 밀리리터의 배지를 추가하고 모든 웰에 대해 절차를 반복한 후 6개의 웰 플레이트를 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다. 세포가 60% confluence에 도달할 때까지 격일로 전체 부피의 배지를 변경한 후 분화되지 않은 신경 줄기 세포의 일부를 동결하는 것처럼 1:3 비율로 세포를 해리하고 재분해합니다. 먼저 신경 줄기세포 배지에 20%디메틸설프옥사이드(DMSO)를 첨가하여 줄기세포 동결 배지를 준비하고 얼음 위에 놓습니다.

그런 다음 6개의 웰 플레이트에서 세포를 해리합니다. 세포 스크레이퍼와 부드러운 피펫팅을 사용합니다. 세포 계수를 위해 현탁액의 분취액을 예약한 다음 세포가 회전하는 동안 실온에서 10분 동안 170배 G로 세포를 원심분리하고, 혈류, 세포 분석기 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 현탁액 부분 표본의 세포를 계수하고, 밀리리터당 6개의 세포에 10 곱하기 10의 세포 농도를 제공하는 데 필요한 배지의 부피를 계산합니다.

스핀이 끝난 후, 상등액을 버리고 펠릿을 신경 줄기 세포 배지에 1 회 10에서 6 개의 세포로 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 1밀리리터 부피의 다섯 번째 세포에 동일한 부피의 동결 배지 피펫을 10배로 동일한 부피의 동결 매체 피펫을 cryo 바이알에 넣고 제조업체의 지침에 따라 냉동 용기에서 세포를 동결합니다. 6웰 플레이트의 신경 줄기 세포가 80% 합류점에 도달하면 고무 경찰관을 사용하여 분리한 다음 부드러운 피펫팅으로 해리합니다.

세포 현탁액을 멸균 튜브에 모읍니다. 혈구, 세포 분석기 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 신경 줄기 세포 배지를 사용하여 세포 현탁액의 농도를 10의 1배로 10으로 1밀리리터당 5번째 세포로 조정합니다. 그런 다음 세포 현탁액 1ml를 폴리 D 라이신에 피펫팅하고 라미네이트 코팅된 커버를 원하는 웰 수에 대해 절차를 반복한 후 24웰 플레이트의 한 웰에 밀어 넣습니다.

24시간 동안 이전과 같이 배양합니다. 배양 시간이 경과한 후 배지를 흡인하고 신경 분화로 교체합니다. 배지는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 2주 동안 배양하고 2주 후 일주일에 두 번 배지를 변경합니다.

신경 세포 줄기 세포는 여기에 표시된 것처럼 완전히 분화되어야 하며 면역형광 염색과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 준비가 되어야 합니다. 처음 두 이미지는 신경 줄기 세포가 둥지를 발현하고 SOX 2를 표현하는 것을 보여줍니다. 세 번째 이미지는 OCT four가 표현되지 않았음을 보여주지만 DPI는 핵 마커로 사용되며 눈금 막대는 200미크론을 나타냅니다.

비디오에 설명된 분화 프로토콜을 따른 후, 분화된 뉴런은 뉴런 마커 베타 3 튜불린을 발현합니다. 인간의 신경 줄기 세포는 또한 신경교세포(glial cell)로 분화될 수 있습니다. 성상세포로 분화될 때, 세포는 성상세포 마커 GFAP를 발현합니다.

마지막으로, 이 이미지에서 세포는 희소돌기아교세포로 분화되어 희소돌기아교세포 마커를 발현합니다. 오 넷. 일단 숙달되면 말초 혈액에서 유도된 인간 신경 줄기 세포의 생성은 약 3주 안에 완료될 수 있습니다.

적절하게 수행된다면 신경줄기세포는 더욱 분화된 뉴런이 될 수 있으며 길고 복잡한 IPS 생성 과정으로 인해 방법이 불분명할 수 있으며 발달 후 환자 특이적 신경세포 배양을 생성하는 쉬운 옵션이 될 수 있습니다. 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 다양한 신경 장애에 대한 개별 세포 배양 모델링을 탐구할 수 있는 방법이며, 이는 특히 개별 환자 샘플에서 특정 장애의 유전적 차이를 더 잘 나타낼 수 있습니다.