Name: 성인 마우스의 중간 뇌 도파민 뉴런의 수의 환경 변조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 배우세요 성인 마우스 중간 뇌 도파민 뉴런의 환경 변조 방법을 통해 뇌 가소성과 행동 변화를 연구하는 기법입니다. 이 프로토콜은 성별 짝짓기와 환경 풍요화를 활용하여 신경과학 및 행동 생물학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 호주 국립보건의료연구위원회(National Health and Medical Research Council of Australia, NHMRC)의 프로젝트 보조금 1022839의 지원을 받았습니다. AJH는 호주 연구 위원회(ARC) FT3 미래 펠로우(FT100100835)입니다. Florey Institute of Neuroscience and Mental Health는 빅토리아 주 정부의 운영 인프라 지원 보조금의 지원을 인정합니다.

참고 : 동물의 모든 실험 절차는 신경 과학 및 정신 건강 동물 윤리위원회의 플로리 연구소의 승인을 호주의 국립 보건 의학 연구위원회 (Medical Research Council)을 준수 하였다는 과학적인 목적을 위해 동물의 관리 및 사용에 대한 실천의 코드 (7 번째 버전을 발표 2004). 1. 환경 노는 <ol><li> 성별 페어링 <ol><li> 성적으로 성숙 (&gt; 8 주 이전), 연령대 남성과 여성의 마우스를 사용합니다. 참고 : 우리는 일반적으로 C57BL / 6 마​​우스를 사용하지만,이 프로토콜에 스위스의 마우스를 사용하여 동일한 결과가 있었다. 우리는 일반적으로 N = (N = 4 수컷) N = 2 남성에서 남성 쌍으로 나누어, 각 실험에 대해 N = 8 수컷 및 N = 8 암컷을 사용하여 2 암형 암 쌍 (N = 4 암컷), 및 N = 4 남성 여성 쌍 (N = 4 남성과 N = 4 여성). </li><li> 동물 지주 시설, 그룹-집에 도착하자마자&gt; 3 일간 성별 마우스는 순응한다. 여기 통해 서심은 성별 페어링, 외부 환경의 자극을 유지 (예 : 주위 온도, 빛 : 어두운주기, 음식, 물, 처리 및 청소) 상수 또는 모든 마우스에 동일하게 배포 할 수 있습니다. </li><li> 무작위로 남성 - 남성 쌍, 여성 - 여성 쌍, 또는 암수 한 쌍의 각각의 마우스를 할당합니다. 음식과 물에 대한 광고 무제한 액세스 격리에 깨끗한 케이지 (2 마우스 / 케이지)에 각 쌍을 배치하고 단지 7 일간 계속이 방법으로 집. 참고 : 일상적인 축산이 기간 동안 OK이지만 모든 마우스에 동등하게 분배해야합니다. 남성과 여성의 한배 새끼의 페어링 않도록주의하십시오. </li></ol></li><li> 환경 심화 <ol><li> 성적으로 성숙 (&gt; 8 주 이전), 연령대 남성 또는 여성 마우스를 사용합니다. 참고 : 우리는 일반적으로 N = 6 / 치료 그룹으로 나누어 각 실험에 대한 N = 18 마우스를 사용합니다. </li><li> 그룹 보관 동일한 표준에 수납을 유지 동물 보유 시설에 도착하면 (SH) (예 : </em&gt; 삼일이 순응하기&gt;이 단계에서) 아래의 조건을 참조하십시오. 다음과 실험을하는 동안, 외부 환경의 자극을 유지 (예 : 주위 온도, 빛 : 어두운주기, 음식, 물, 처리 및 청소) 상수 또는 모든 마우스에 동일하게 배포 할 수 있습니다. </li><li> 환경 농축을 시작하려면, 무작위로 세 그룹 중 하나에 각 마우스 할당 : SH를; 실행 휠 (RW), 또는 환경 농축 (EE)과 함께 음식과 물에 대한 광고 무제한으로 액세스 할 수있는 동일한 깨끗한 케이지에 마우스의 각 그룹을 배치합니다. 참고 : 모든 그룹은 여기, 더 큰 쥐 잡고 케이지, 42cm 길이, 폭 27cm를 측정하고, 깊은 16cm 사용 하였다. <ol><li> 또한, 다음의 각 그룹의 환경 조건을 제공한다 : 유일한 바닥에 쓰레기를 포함 SH (종이 펠렛 또는 톱밥); RW 포함 SH 플러스 2 실행 바퀴; EE는 (로프, 사다리, 터널, 빈 종이 타월 롤과 조직 종이 조각 같은 개체) RW 플러스 장난감을 포함하는과 전에plore, 놀이, 등산, 숨기기와 둥지. </li><li> 14 일 동안 계속해서 이런 식으로 그들을 집. 참고 : 일상적인 축산이 기간 동안 OK이지만 모든 마우스에 동등하게 분배해야합니다. </li></ol></li><li> 1시간 / 일 (같은 시간 매일), 오일은 / 주를 위해 새로운 장난감을 포함하는 더 큰 케이지에 그들을 함께 배치하여 추가 &#39;슈퍼 농축&#39;(SE)에 따라 EE 마우스. 참고 : 여기에, 46cm, 폭 69cm 길이와 40cm 깊이 플라스틱 욕조를 사용 하였다. <ol><li> 장난감의 다른 세트 각 세션을 제시하여 새로운 항목을 유지한다. 청결한 장난감 비눗물와 냄새를 제거하기 위해 80 % 에탄올로 마우스에 다시 제시한다. </li><li> 각 SE 세션에 이어, 자신의 EE 케이지에 마우스를 반환합니다. 핸들 SH 및 RW 마우스이 기간 동안 (SE 자체 제외) SE 마우스와 동일 (예 제거에서 그 케이지에 각 SH 및 RW 마우스를 반환). </li></ol></li></ol></li></ol><ol><li> 준비하기 <ol><li> 상업적으로 사용할 수있는 살균 삼투 펌프 및 뇌 주입 키트를 사용합니다. 주입 전날, 무균 기술을 사용하여, 각각의 펌프를 충전 (펌프와 함께 제공되는 지침에 설명 된대로) 멸균 약물 또는 차량 솔루션 관과 정맥을 연결하여 주요 임플란트. 둘을 연결하고 37 ℃에서 하룻밤 멸균 식염수에 품어. 교차 오염을 방지하기 위해 별도 약물 및 차량 채워진 보형물을 품어. </li></ol></li><li> 수술. 참고 : 실험자의 국가에 따라이 특별한 동물 실험 허용하거나 수당은 수술과 수술 후 실험 이러한 유형을 추구해야합니다. <ol><li> 모든 수술 장비를 소독 및 전반에 걸쳐 무균 기술을 사용합니다. (예 : 공기의 1 ~ 2 % 이소 플루오 란 사용) 마우스를 마취하고 stere에 배치otaxic headframe. 절차 전반에 걸쳐 마취의 깊이를 확인하고 필요에 따라 추가로 마취 관리 (유해 발 핀치에 사지 철회 등이없는 것은 적절한 마취를 나타낸다). 확인 눈은 윤활유 눈 연고에 의해 탈수으로부터 보호, 마우스의 체온 절차 전반에 걸쳐 정상 유지됩니다. </li><li> CM 두개골의 뒤쪽 가장자리에 후부 2 눈 사이와 마무리에서 시작하여 피부를 통해 중간 선 절개를합니다. 편안 펌프와 캐 뉼러 (연결 관이 완료되면 구부러진 수 없습니다) 이식되면 연결 관에 맞게 충분히 큰 피하 &#39;포켓&#39;을 만들기 위해 멀리 마우스의 뒷면 아래 기본 근막으로부터 피부를 해부 무딘. 두개골의 지느러미 측면을에서 근막을 취소 쳤어요. </li><li> , 약 1.5 mm 직경의 치과 버를 사용하여 적절한 정위가 U 좌표에서 두개골에 드릴 다운ntil 뼈의 얇은 유연한 계층은 남아있다. 껍질 멀리 미세 집게를 사용하여이 계층 (이 치과 버와 기본 경막과 뇌 손상을 피한다). 확인 두개골은 혈액과 뼈 조각의 청소하지 않으며,이 있음을 더 이상 출혈. </li><li> 정맥 홀더에 의해 유지 캐 뉼러로, 마우스의 뒷면을 덮는 피하 &#39;주머니&#39;에 펌프와 연결 관을 배치합니다. 이어서, 적당한 정위 좌표 및 뇌의 표면 상에 캐 뉼러의 선단 위치. 조심스럽게 뇌에 캐 뉼러를 낮출 수 있지만, 필요한 깊이의 짧은 약 1mm를 중지합니다. 주 : 나머지 깊이 치과 아크릴의 제 1 층의 도포 다음과 협상한다. </li><li> 두개골의 표면이 깨끗하고 건조 다시 확인한 후 치과 아크릴의 작은 볼륨을 준비하고 제 주위의 두개골을 통해 버 홀에 포함, 두개골의 전체 노출 영역에 그것을 부드럽게 이쑤시개를 사용전자 정맥. 아크릴 견고하기 전에, 캐 뉼러 대상으로 남아있는 깊이 팁을 낮 춥니 다. </li><li> 장소에 캐 뉼러를 해결하기 위해, 캐 뉼러의 흰색 플라스틱 지원을 통해뿐만 아니라, 치과 아크릴의 또 다른 작은 볼륨을 준비하고 첫 번째 제품이 계층. 필요에 따라 아크릴의 추가 레이어를 반복합니다. </li><li> 아크릴이 강화되면, 조심스럽게 캐 뉼러 홀더를 제거하고 부탄 불꽃으로 가열 메스 블레이드를 사용하여 흰색 플라스틱 이동식 정맥 탭을 잘라. 마지막으로, 전체 임플란트에 대해 닫혀 피부를 봉합. </li></ol></li><li> 동물의 수술 후 치료 <ol><li> 피부 마진 살균 연고를 적용하고 마우스에 항 염증를 관리 (예 : 멜 록시 캄, 3 ㎎ / kg SC). 프레임에서 마우스를 제거 가열 램프 아래에 배치하고, 의식을 회복 할 때까지 관찰합니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 마우스를 반환하지 않습니다. 참고 : 특급성별 페어링 및 환경 농축 등 erimental 조작이 시작 또는 초기에 수술 다음 날 재개 할 수 있습니다. </li><li> 자신의 체중, 매일 일반적인 동작과 모양을 모니터링합니다. 국소 살균 연고와 수술 절개 주위 감염의 징후 (예 : 부종, 발적, 고름)을 취급합니다. 필요에 따라 전신 진통제 및 / 또는 항생제 징후 질병, 통증, 스트레스 또는 불편 (&gt; 10 % 체중, 사회적 철회, 정리의 부족의 소멸, &quot;플러 핑&quot;, 운동 장애, 발작) 치료. </li><li> &gt; 15 % 체중 감소 또는 질병, 통증, 스트레스 또는 불편 증상이 회복 처리 1 주일 이내에 복구 할 수없는 경우 쥐를 안락사. </li></ol></li></ol> 3. 뇌 조직 준비, 면역 조직 화학적 처리 및 Stereology를 <ol><li> 관류 <ol><li> 즉시 환경 / 약물 조작에 따라, 연구를 위해 뇌를 준비합니다. <br/&gt; 주 : 여기에보고 된 실험에서 SNC + TH 뉴런의 수를 측정하고, 다른 처리 군에 각각 비교 하​​였다. </li><li> 먼저 (예 : 100 ㎎ / ㎏ IP 나트륨 펜토 바르비 톤) 쥐를 죽일 마취제의 과다 복용을 관리 할 수 있습니다. 일단 마취하지만 심장 박동이 정지하기 전에, 그 뒷면에 마우스를 놓고 넥타이 또는 두 앞발을 아래로 핀. </li><li> 메스를 사용하면 흉부 후 복강으로 흉곽 아래의 근육을 절개 덮는 피부를 절단. 흉곽의 칼 모양의 과정에 클램프를 놓고 조리개 노출 간로부터 멀리 흉곽를 들어 올립니다. </li><li> 다이어프램을 통해 측면으로 흉곽이 다시 폐와 심장을 노출 머리 접을 수있을 때까지 큰 가위를 사용하여 양쪽의 갈비뼈를 잘라. 미세 가위 종료 혈액 지점 및 관류 솔루션과 우심방의 작은 절개를 사용하여, 다음 왼쪽 ventri의 자료를 잘라사이클과 좌심실, 좌심방을 통해 정맥을 배치하고 대동맥에. </li><li> 헤파린 따뜻한 (37 ° C)를 펌프 제자리에 캐 뉼러를 클램프과 우심방을 종료 솔루션까지 혈관을 통해 0.1 M 인산 완충 생리 식염수 (PBS)는 혈액 완전히 무료입니다. 전체 마우스가 잘 해결 될 때까지 다음, 혈관을 통해 감기 (4 ° C) 정착액 솔루션 (PBS에서와 같은 4 % 파라 포름 알데히드를) 펌프. 뇌 싱크까지 2~3일 30 % 자당에 PBS의 뇌와 장소를 제거합니다. 참고 : 조직 준비의 다른 유형은 해당 실험실에서 전문 지식에 따라 적용 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 무료 부동 저온부의 준비 <ol><li> 관심있는 뇌 영역을 통해 시리얼 부분을 잘라 PBS에이를 수집합니다. 참고 : 우리는 저온 유지 장치를 사용하여 40 μm의 두께 부분을 잘라. 조직 절편의 다른 유형의 correspondi 전문성에 따라 적용 할 수있다NG 실험실. </li></ol></li><li> 면역 조직 화학 <ol><li> 관심의 단백질에 대한 표준 면역 조직 화학 염색을 수행합니다. 48 시간 동안 39 ° C에서, (400 (1)) 다음, 폴리 클로 날 오티 닐화 염소 항 폴리 클로 날 토끼 항 TH와 다음, 30 분 동안 immunoreact를 실온에서 PBS 중 5 % 정상 염소 혈청과 0.3 % 트리톤 X-100의 섹션을 인큐베이션 실온에서 2 시간 동안 : -rabbit (1000 1). </li><li> 18-20 분 동안 실온에서 다음과 니켈 - 코발트 - 강화 미노 벤지딘 (0.5 ㎎ / ㎖)에서 1 시간 동안 실내 온도에서 : 다음에, 아비딘 - 퍼 옥시다아제 (500 1)에서 부화 미노 벤지딘 인큐베이션 마지막 크로마 3-5 분 동안 침전을 촉매 과산화수소 (0.01 %)를 추가한다. 전, 후, 그리고 위의 각 단계 사이에 PBS 섹션을 10 분 3 회 각을 씻으십시오. </li><li> 다음, 공기를 건조, 젤라틴 현미경 슬라이드에 Nissl 얼룩 (중립 적색) 섹션을 탑재, 알코올, 분명 (X-3B), 및 커버 슬립 탈수. </li></ol></li><lI&gt; Stereology를 <ol><li> 공평 stereological 방법을 사용하고 TH-TH + SNC (VTA 및 및 LC) 뉴런의 수를 추정한다. stereologist받은 치료에 눈이 있는지 확인합니다. 소마 지름 &lt;5 ㎛ 인 기초 신경교 제외하고 가시 핵과 셀만 카운트. </li><li> TH + 세포와 Paxinos 왓슨 (7)의 뇌지도 책에 따라 해부학 적 / 경계의 공간 위치하여 SNC (과 VTA와 LC)를 확인합니다. (; X = 100 ㎛, Y = VTA와 LC 100 μm의 X = Y 140 μm의 = SNC 140 μm의) 정기적으로 미리 정해진 간격으로 계산 프레임 내에서 TH + 세포 (55 X 55 μm의 = 3025 μm의 2) 카운트 매 4 번째 섹션의 각 핵에 걸쳐. </li></ol></li></ol>

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환경 조작 이러한 조작 환경 (성별 페어링 및 환경 농축)의 디자인 뒤에 동기 환경 여부를 확인하는, 그리고 / 또는 동작 환경에서 메시지는 중뇌 DA 신경 세포의 수의 변화와 연관된다. 초점은 환경을 제공하고 중뇌 DA 신호를 참여 가능성이 행동을 자극에 따라서이었다. 이러한 이성에 포함 된 페어링하고, 놀이를 탐험 등반, 숨길 바퀴, 로프, 사다리, 터널, 및 개체를 실행하고 둥지에 대한 액세스를 포함하는 환경 농축. 이러한 환경은 모두 중뇌 DA 신경 방전 급성 증가하고 DA 릴리스와 관련 된 보상 동기 부여인지, 감정 및 모터 행동을 육성한다고 (예 : 8). 우리의 가설은 또한 중뇌 DA 신호 BR에서 오래 지속되는 변화와 관련되어 있었다중뇌 DA 신경 세포의 수의 변화는 약 에게서는. 여기에 다른 곳에서 6, 증거는이 참 경우가 있음을 제시한다. <p class="jove_content"...

중뇌의 배쪽 피개 영역 (VTA)과 substantia nigra에의 유리체 compacta (SNC)의 신경 세포에 의해 DArgic 신호는 보상 동기 부여인지, 감정 및 모터 행동에 중요 할 것으로 생각된다. 그러나, 너무 많거나 너무 적은 중뇌 DA 시그널링은 비활성화 많은 신경계 장애의 다양한 증상 (예를 들어 파킨슨 병, 주의력 결핍 및 과다 활동 장애, 정신 분열병, 및 약물 중독)을 야기한다. 증가 또는 DA는 이러한 증상을 완화 신호 감소 마약, 그러나 그들은 또한 조절 이상 신호로 인한 부작용 및 오프 대상 효과를 생산하고 있습니다. 약물 효과는 또한 뇌의 보상 반응에 시간이 지남에 따라 감소한다. 도전 따라서 표적으로 생리 방식 정상 중뇌 DA 시그널링을 복원하고, 선호 접근법 증가 또는 중뇌 DA 뉴런의 수를 감소시킴으로써이다. 증거는 SEV에 대한 축적 된(1 검토) 성숙한 성인 세포에서 대사와 인신 매매 DA 및 기타 카테콜아민에 관여하는 유전자와 단백질의 발현이 수정할 수 있음을 대한 일반적인 수십 년. TH immunonegative (TH-) 신경 세포의 수가 반대 패턴을 나타내고있다 중뇌, 티로신 수산화 효소 면역 양성의 개수 (TH +, DA 합성에서 속도 - 제한 효소) 뉴런은 (즉, 증가 신경독 투여 2,3- 따라 증가시킨다 감소 다음) 3을 감소시킨다. 이것은 다음 몇 가지 세포에 의한 &#39;DA 표현형&#39;의 이득 손실과 일치한다. TH-TH + 및 SNC 뉴런의 수는 이러한 셀 4,5의 전기적 활성도를 변경 다양한 치료 다음 동일하지만 반대 방향으로 변화하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 2 주 중뇌에 작은 컨덕턴스의 주입, 칼슘 - 활성화 된 칼륨 (SK) 채널 길항제 apamin는 (동일한 양으로)를 TH + 민과의 수가 증가 감소TH-SNC의 mber은 4,5 뉴런. 대조적으로, SK 채널 작용제 -1- EBIO의 주입 TH +의 수를 증가시키고 (동량)에 의해 TH-4,5- SNC 뉴런의 수를 감소시킨다. 비슷한 변화는 구 심성 입력 4를 대상으로하는 일부 포함 SNC 신경 세포의 활동을 대상으로 다양한 트리트먼트 다음 보였다. 구 심성 신경 활성 및 입력에 의해 SNC DArgic 뉴런의 수의 이러한 규정은 명백한 환경 또는 행동 SNC 뉴런의 수에 영향을 줄 수있는 가능성을 제기한다. 다른 환경에 노출 실제로 성인 마우스는 다소 중뇌 (VTA 및 SNC) TH + 뉴런, 이러한 환경에 의해 유도 된 변화들 중 적어도 일부 중뇌 6 시냅스 동시 입력의 봉쇄에 의해 폐지되어있다. (1) 우리의 환경 조작 및 약물 주입을 구현하는 방법에 대한 자세한 내용을 제공,이 통신의 목적은 할 수 있습니다 및 (2) E 우리의 경합을 더욱 지원 데이터를 제공 할nvironment은 구 심성 입력을 통해, 중뇌 DA 뉴런의 수를 조절한다.

<table><tbody><tr><td>Isofluorane</td><td>Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia</td><td>AHN3640</td><td></td></tr><tr><td>ALZET Osmotic pump 1002</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004317</td><td></td></tr><tr><td>ALZET Brain infusion kit 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004760</td><td></td></tr><tr><td>ALZET 캐뉼라 홀더 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0008860</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Monomer Self-curing (치과용 아크릴 용제)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, 네덜란드</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Self Curing (치과용 아크릴 분말)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, 네덜란드</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>METACAM (Meloxicam)</td><td>Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia</td><td>L10100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pentobarbitone</td><td>Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia</td><td>571177</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>chemicon-temecula, CA</td><td>S26-Litre</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck Millipore Headquarters&nbsp;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td><td>1.08603.1000</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase</td><td>Merck Millipore Headquarters&nbsp;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit</td><td>Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060</td><td>EO432</td><td></td></tr><tr><td>Avidin peroxidase</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>A3151-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Diamino-benzidine</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>D-5637</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 조사자</td><td>MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr></tbody></table>

성인 마우스의 중간 뇌 도파민 뉴런의 수의 환경 변조

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

뇌 또는 &#39;뇌 가소성&#39;에 오래 지속되는 변화는 질병이나 부상으로 다음과 같은 적응 행동 및 뇌 수리의 기초가. 또한, 우리의 환경과의 상호 작용은 뇌 가소성을 유도 할 수 있습니다. 점점 연구는 뇌와 행동 장애의 치료에 도움이 뇌 가소성을 자극하는 환경을 식별하기 위해 노력하고있다. 두 조작 환경을 설명하는 증가 또는 성인 마우스 중뇌 신경 세포 티로신 수산화 효소 면역 양성의 개수 (TH +, 도파민 (DA) 합성에서 속도 - 제한 효소)을 감소시킨다. 첫 번째는 페어링 남성과 함께 지속적으로 남성의 약 12​​ % 중뇌 TH + 뉴런을 증가 일주, 대한 여성 마우스를 포함하지만, 여성의 약 12​​ % 중뇌 TH + 뉴런을 감소시킨다. 두 번째는 등 실행 바퀴, 장난감, 로프, 중첩 물질을 포함하는 &#39;농축 환경&#39;(EE)에서 2 주 연속 주택 마우스를 포함하는 전남성의 약 14 % 중뇌 TH + 뉴런을 ncreases. 또한, 프로토콜은 동시에 환경에 의한 뇌 가소성을 기본 메커니즘을 식별하는 데 도움이 환경 조작 중에 직접 중뇌에 약물을 주입에 대해 설명한다. 예를 들어, 더 중뇌 TH + 뉴런의 EE-유도는 중뇌 신경 세포 상에 시냅스 입력의 동시 봉쇄에 의해 폐지된다. 함께, 이러한 데이터는 환경에 대한 정보가 또는 &#39;DA&#39;유전자의 발현 끄려면 중뇌 신경 세포에 시냅스 입력을 통해 전달되는 것을 나타냅니다. 따라서, 기전 표적화 적절한 환경 적 자극 또는 약물, 중뇌 DA 불균형과 관련된 뇌 및 행동 장애를 치료하는데 유용 할 수있다 (예를 들어 파킨슨 병, 주의력 결핍 및 과다 활동 장애, 정신 분열병, 및 약물 중독).

이러한 환경 조작을 실시 성인 마우스는 중뇌의 숫자 (SNC와 VTA),하지만 LC를 변경 한 TH + 뉴런, EE 플러스 피크로 톡신 또는 bicuculline 하나의 동시 중뇌 주입 (GABA 수용체 길항제) 및의 EE-유도를 폐지 더 SNC TH + 뉴런. 이 자료는 이전에 6 년에 출판되었다. 본 데이터는 이전 연구의 일환으로 수행 복제 실험에서 컴파일 된,하지만 다른 곳에서 출판되지 않았다. 특히, 성인 여성 쥐와 결합 된 성인 남성 마우스는 더 TH +이 여성 (그림 1에서와 짝을 여성보다 더 적은 TH + SNC와 VTA 신경 세포가 수컷과 짝 여성 반면 SNC와 VTA (중뇌) 남성과 짝 남성보다 신경 세포, 6). 이의 또 다른 예는 fo를 TH + SNC 남성 뉴런과 여성의 쥐의 SE 번호 ± 평균을 바로 보여줍니다 그림 1, 여기에 제공llowing 성별 페...

이 프로토콜은 성인 마우스의 적응 행동 및 뇌 복구의 기저에 있는 환경적으로 유발된 뇌 변화를 연구하기 위한 두 가지 다른 환경 조작과 동시 뇌 주입 프로토콜을 설명합니다.

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

다음 실험의 전반적인 목표는 마우스의 뇌 가소성과 행동 변화를 자극하는 조절된 환경 상황을 제공하는 것입니다. 이는 수컷-암컷 쌍과 수컷-수컷 및 암컷-암컷 대조군 쌍으로 마우스를 사육하여 장기간의 성별 짝짓기가 뇌에 미치는 영향을 연구함으로써 달성됩니다. 대안적으로, 환경 풍부화가 뇌에 미치는 영향을 연구하기 위해 탐색과 놀이를 위한 다양한 물건이 채워진 케이지와 표준 사육 케이지에 마우스를 각각 합사하여 사육할 수 있습니다. 관찰된 뇌 및 행동 변화의 기전을 규명하기 위해 이러한 환경적 자극에 약물 투여와 같은 다른 처치를 추가할 수 있습니다.결과에 따르면, 이러한 환경 풍요화 및 처치는 중뇌의 GABA 작동성 시냅스 전달에 의존하여 중뇌 도파민 작동성 뉴런 수의 변화를 유도하는 것으로 나타났습니다. 환경 풍요화는 마우스의 체성 감각 운동 및 인지 자극을 증가시키는 패러다임입니다. 이러한 접근 방식을 통해 많은 질환 모델에서 신경 가소성의 증가와 학습 및 기억력의 향상이 확인되었습니다.이 기술의 함의는 환경적 영향으로 인해 발생하는 성인 뇌 가소성의 메커니즘을 이해하는 것으로 확장됩니다. 이는 뇌와 마음의 여러 질환을 치료하는 데 유용합니다. 시냅스 입력으로 유도되는 중뇌 뉴런 활동을 교란했을 때 중뇌 도파민 뉴런의 수가 변화한다는 점을 처음 발견했을 때, 우리는 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다.삼투압 펌프와 뇌 주입 캐뉼라의 시각적 시연은 해당 절차를 학습하기가 상당히 어려울 수 있으므로 매우 중요할 수 있습니다. 성별 짝짓기를 위한 서술적 설명입니다. 성적으로 성숙하고 연령이 일치하는 암수 생쥐를 성별에 따라 그룹화하되, 동일한 배에서 태어난 개체 간의 짝짓기는 피하십시오. 각 생쥐를 수컷-수컷 쌍, 암컷-암컷 쌍 또는 수컷-암컷 쌍으로 무작위로 배치하여, 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 깨끗한 케이지에 격리하십시오. 이 조건은 성별 짝짓기 기간 내내 유지되어야 합니다.모든 외부 환경 자극을 일정하게 유지하거나 모든 마우스에 동일하게 배분하고, 동물들을 7일 동안 계속 사육합니다. 환경 풍요화를 위해, 성적으로 성숙하고 연령이 일치하는 수컷 또는 암컷 마우스를 표준 사육, 런닝 휠 제공, 또는 환경 풍요화의 세 그룹 중 하나에 무작위로 배정하여 최소 3일 동안 유지합니다. 이 상태를 계속 유지하십시오.14일 동안 먹이와 물을 자유롭게 섭취하도록 합니다. 환경 풍부화 과정 동안, 표준 사육 케이지에는 베딩만 포함되어야 합니다. 러닝 휠 그룹의 케이지에는 베딩과 러닝 휠 2개가 포함되어야 하며, 환경 풍부화 그룹의 케이지에는 베딩, 러닝 휠 2개 및 장난감이 포함되어야 합니다.환경 풍요화된 마우스들을 새로운 장난감이 들어 있는 더 큰 케이지에 함께 넣어 하루 1시간 동안 추가적인 초풍요화(super enrichment) 처리를 합니다. 일주일에 5일 동안 매일 같은 시간에 마우스들을 원래의 환경 풍요화 케이지로 돌려보냅니다. 매 세션이 끝난 후에는 세션마다 서로 다른 장난감 세트를 제공하여 새로움을 유지합니다.마우스에게 제공할 모든 장난감을 비눗물과 80% ethanol로 세척합니다. 냄새를 제거하기 위해, 이식 전날 표준 사육 및 러닝휠 그룹의 마우스들도 동일한 방식으로 매일 비슷한 시간 동안 이동시키되, 초강화 환경 재료는 추가하지 않습니다. 무균 조작법을 사용하여, 제조사의 지침에 따라 각 멸균 삼투압 펌프, 연결 튜브 및 캐뉼라를 멸균 약물 또는 용매 용액으로 채웁니다.그런 다음 각 부품을 연결하고, 수술 당일 37 °C의 멸균 식염수에서 하룻밤 동안 배양합니다. 토우 핀치(toe pinch)로 진정 상태를 확인한 후, 동물에게 안약을 도포하고 가열 패드 위에 등을 대고 눕힙니다. 다음으로, 무균 기술을 사용하여 두개골 뒷부분 가장자리에서 2 cm 후방부터 시작하여 양 눈 사이에서 끝나는 피부 중앙 절개를 실시합니다. 둔성 박리(blunt dissection)를 통해 쥐의 등 쪽 피부를 하부 근막에서 분리하여, 펌프와 연결 튜브가 충분히 들어갈 수 있는 크기의 피하 포켓을 만듭니다.그런 다음 두개골의 등쪽 표면에서 근막을 깨끗이 긁어내고, 약 1.5 millimeter 직경의 치과용 버(dental burr)를 사용하여 적절한 정위 좌표에 따라 얇고 유연한 뼈 층이 남을 때까지 두개골을 뚫고, 이 층을 미세 핀셋으로 벗겨냅니다. 두개골에서 혈액과 뼈 파편이 모두 제거되고 더 이상 출혈이 없으면, 캐뉼라 홀더를 사용하여 방금 만든 포켓에 펌프와 연결 튜브를 배치합니다. 이제 뇌 표면의 적절한 정위 좌표에 캐뉼라 팁을 위치시킨 다음, 필요한 깊이보다 1 millimeter 짧은 지점까지 튜브를 뇌 속으로 조심스럽게 내립니다.두개골 표면이 다시 한번 깨끗하고 건조한지 확인한 다음, 치과용 아크릴이 굳기 전에 이쑤시개를 사용하여 캐뉼라 주변의 버홀(burr hole)을 포함하여 두개골의 노출된 전체 영역에 갓 준비한 치과용 아크릴을 매끄럽게 도포합니다. 캐뉼라 팁을 표적 지점의 남은 깊이까지 내립니다. 캐뉼라가 제자리에 위치하면, 두개골뿐만 아니라 캐뉼라를 고정하는 흰색 플라스틱 지지대 위에도 갓 준비한 치과용 아크릴을 조심스럽게 두 번째 층으로 덧발라 캐뉼라를 고정합니다.아크릴이 경화되면 캐뉼라 홀더를 조심스럽게 제거하고, 가열된 메스 날을 사용하여 플라스틱 캐뉼라 탭을 녹여 끊어냅니다. 그 후 임플란트 전체 부위의 피부를 봉합하여 닫습니다. 피부 가장자리에 항생제 연고를 바르고 동물에게 항염증제를 투여합니다.마지막으로, 마우스를 프레임에서 꺼냅니다. 가열 램프 아래에 두고 동물이 완전히 회복될 때까지 관찰합니다. 성체 암컷 마우스와 7일 동안 함께 지낸 성체 수컷 마우스는 수컷끼리 함께 지낸 마우스보다 중뇌의 positive SNC 영역 뉴런이 약 12% 더 많습니다.이와 대조적으로, 수컷과 짝을 이룬 암컷은 암컷과 짝을 이룬 암컷보다 TH 양성 SNC 뉴런이 약 12% 더 적습니다. 또한, 14일 동안 환경 풍부화 짝짓기와 초풍부화(super enrichment)를 함께 거친 성체 수컷 생쥐에서도 TH 양성 SNC 및 복측 피개 영역 뉴런의 수가 증가했습니다. 차량(vehicle)을 주입하며 환경 풍부화와 초풍부화를 병행한 동물들은 TH 양성 SNC 뉴런이 약 14% 더 많게 나타났습니다.그 후, vehicle을 주입한 표준 사육 동물과 환경 풍요화 및 초풍요화 사육을 하며 gabaa 수용체 길항제를 주입한 동물에서는 이러한 증가가 나타나지 않습니다. 환경 조작을 시도할 때는 소음을 최소화하고 케이지 교체를 피하는 등 동물에 가해지는 모든 방해 요인을 최소한으로 줄이는 것이 중요합니다. 풍요로운 환경을 조성할 때, 동물의 스트레스를 최소화하기 위해 다양한 둥지 재료를 포함하고 둥지 위치를 일정하게 유지하는 것이 매우 중요합니다.이 영상을 시청한 후에는 뇌와 행동의 변화를 유도하기 위해 성체 마우스의 환경을 조절하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 약물을 다룰 때는 매우 위험할 수 있으므로, 삼투압 펌프를 준비할 때는 항상 보호복을 착용해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

기본 dissociated midbrain의 도파민 세포 문화는 도파민 뉴런의 presynaptic 특성의 연구 수 있습니다. 그들은 실시간 도파민 릴리스 속도론 및 단백질 / mRNA 도파민 exocytosis의 규제 수준을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 당신이 쥐 neonates에서 이러한 문화를 생성하는 방법을 보여줍니다.

쥐 Neonates에서 기본 Dissociated Midbrain의 도파민 세포 문화

생쥐의 중간 forebrain 번들의 일방적 6-OHDA의 병변을 수행하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법은 striatal 도파민과 90.63의&gt; 95 %의 손실을 보여주는 살아남은 동물의 89 %를 낮은 사망률 (13.3 %) ± -4.02 % 병변의 측면을 향해 ipsiversive 회전 편견을 가지고 있습니다.

파킨슨병의 일방적-6-OHDA lesioned 마우스 모델의 개발

도파민은 분명히 세포 기관 및 도파민 뉴런의 dendrites을 포함 midbrain의 핵에서 규제하고 있습니다. 여기 substantia nigra (SN)과 설치류의 복부 tegmental 지역 (VTA)의 midbrain의 핵에 도파민 규정에 따라서 절개 및 샘플 처리 결과를 극대화하는 접근 방식과 결론 및 통찰력을 설명합니다.

Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

일반적으로 파킨슨 병 및 운동 장애에 민감하고 안정적​​인 행동 분석은 새로운 잠재적 인 치료를 테스트하기 위해 필수적입니다. 여기, 우리는 흑질 선조체 시스템에 손상의 정도를 변화와 전임상 연구에 유용에 민감한 쥐를위한 감각 테스트의 관리 배터리를 설명합니다.

파킨슨 병의 마우스 모델에서 감각 기능의 평가

NF-κB에 의존하는 성인의 해마 신경의 조작 및 분석을위한 방법이 설명되어 있습니다. 자세한 프로토콜은 마우스의인지 결과의 조사를 위해 치아 이랑 (dentate gyrus)에 의존하는 행동 테스트 (공간 패턴 분리 - 바네스의 미로라고합니다)에 제공된다. 이 기술은 또한 다른 실험 설정에서 조사를 활성화하는 데 도움이됩니다.

NF-κB에 의존하는 성인 신경 발생의 변조 및 분석을위한 방법

Lipoxygenase (LOX) isozymes 증가 또는 증가 시킬 수 있는 제품을 생성할 수 있습니다 또는 신경 염증 및 신경 변성. 유전자 환경 상호 작용 연구 LOX isozyme 특이적 효과 식별할 수 있습니다. 두 개의 LOX isozyme-결핍 형 형질 라인에서 니그로스트리아탈 손상의 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 모델을 사용하면 도파미너기크 및 염증에 대한 LOX 이소지메의 기여도를 비교할 수 있습니다.

파킨슨 병에서 감수성 메커니즘을 마스크를 해제하는 유전자 환경 상호 작용 모델

도파민 뉴런은 뇌에서 중요한 조절 역할을 합니다. 그들의 손실은 파킨슨병과 관련이 있습니다. 이 비디오에서는 배아 마우스 중뇌에서 중심 도파민 뉴런의 1차 배양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이러한 배양은 다양한 스트레스에 대한 이러한 뉴런의 극도의 취약성을 연구하는 데 유용합니다.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

파킨슨병 동안 중뇌 도파민성 뉴런의 퇴화 원인은 완전히 이해되지 않았습니다. 세포 배양 시스템은 이러한 뉴런의 신경 생리학적 특성을 연구하는 데 필수적인 도구를 제공합니다. 여기에서는 신경퇴행의 체외 모델링에 활용할 수 있는 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

Synaptosomal 도파민 통풍 관 및 고성능 액체 크로마토그래피 분석 대표 실험 도구 마우스에서 도파민 항상성 도파민 운송업 자의 기능과 striatal 조직에서 도파민의 수준을 평가 하 여 조사를 각각. 여기 선물이 도파민 조직 콘텐츠를 측정 하 고 도파민 운송업 자의 기능을 평가 하는 프로토콜.

고성능 액체 크로마토그래피 분석 및 Synaptosomal 도파민 통풍 관의 사용에 의해 쥐에서 Dopaminergic 항상성의 평가

이 작업 표준 현미경 장비 (즉, 가벼운 현미경 자동화 개체 테이블 (x, y, z를 사용 하 여 마우스 substantia nigra에서 dopaminergic 신경 세포 숫자의 편견된 stereological 추정에 대 한 단계별 프로토콜 제공 비행기), 그리고 디지털 이미지 분석을 위한 공개 소프트웨어.

광학 Fractionator 표준 현미경 장비를 사용 하 여 마우스 Substantia Nigra에서 Dopaminergic 신경 수 stereological 추정

우리는 청소년 C57BL/6 마우스를 위한 가속 사회적 패배 스트레스 모델을 개발했는데, 이는 남성과 여성 모두에게 작용하고 불연속적인 청소년 기간 동안 노출을 허용합니다. 이 모델에 대한 노출은 사회적 회피를 유발하지만, 패배한 수컷과 암컷 쥐의 하위 집합에서만 가능합니다.

청소년 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스에 대한 사회적 패배 스트레스 모델

배우세요 성인 마우스 중간 뇌 도파민 뉴런의 환경 변조 방법을 통해 뇌 가소성과 행동 변화를 연구하는 기법입니다. 이 프로토콜은 성별 짝짓기와 환경 풍요화를 활용하여 신경과학 및 행동 생물학 연구에 활용됩니다.

성인 마우스의 중간 뇌 도파민 뉴런의 수의 환경 변조

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