Name: Pretargeted PET 영상에 대한 Bioorthogonal 역 전자 수요 딜스 - 알더 고리 모으고 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 배우세요 생체정교 반응을 이용한 대장암 표적화 PET 영상 기법으로, TCO 항체와 테트라진 방사성 리간드를 사용하여 종양 대비 배경 비율을 높이고 방사선 노출량을 줄이는 방법입니다.

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저자는 도움이 되는 대화를 나눠준 Ralph Weissleder 교수, Pat Zanzonico 박사, NagaVaraKishore Pillarsetty 박사에게 감사를 표하고 NIH에 자금을 지원한 것에 대해 감사를 표합니다(BMZ: 1K99CA178205-01A1).

윤리 선언문 : 설명 생체 내 동물 실험의 모든 승인 된 프로토콜과 기념 슬로안 케터링 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 윤리적 지침에 따라 따라 수행 하였다. 의 Tz-BN-NOTA 1. 합성 <ol><li> 작은 반응 용기에 600 μL의 NaHCO3 완충액 (0.1 M, pH를 8.1) 7 MG-NH 2 -Bn NOTA (1.25 X 10-2 밀리몰)을 용해. 용액의 pH를 확인합니다. 필요한 경우, CO 3 0.1 M 나트륨이 적은 분취 량을 사용하여 8.1로 용액의 pH를 조정한다. </li><li> 1.7 ml의 microcentrifuge 관에 0.5 MG의 Tz-NHS (1.25 × 10 -3 밀리몰)에 NH 2 -Bn-NOTA 솔루션을 추가합니다. 참고 : (Tz)를-NHS는 건식 칭량 또는 건조 DMF 또는 DMSO (&lt;50 μL)의 원액에서 추가 할 수 있습니다. </li><li> 생성 된 반응 용액을 RT에서 30 분 동안 반응하도록 허용가벼운 교반. </li><li> 30 분 후, 반응이 -Bn NH-NOTA을 제거하는 역상 C 18 HPLC 크로마토 그래피를 사용하여 생성물을 정제. 의 Tz-NHS-BN과의 Tz-NOTA 가장 525 nm의 파장에서 모니터하면서 2 -Bn NH-NOTA는 254 nm의 파장에서 모니터 할 수있다. 참고 : 체류 시간은 분명히 각 실험실 (펌프, 열, 튜브 등)의 HPLC 장비 설치에 크게 의존한다. 그러나, 예를 제시하는 경우 0의 기울기 : (100)를 MeCN이 / H 2 O는 100 (모두 0.1 % TFA와 함께) : 0의 MeCN / H 2 O를 통해 25 분 및 분석 4.6 × 250mm의 C (18) 열 사용 ,의 Tz-BN-NOTA, Tz 일-NHS 및 NH (2)의 체류 시간은 -Bn-NOTA 각각 약 15 분, 16.5 분, 10 분, 것이다. 생성물 일층 또는 반 제조용 또는 C 18 분 취용 HPLC 컬럼을 사용하여 여러 개의 실행 중의 다른 성분의 반응으로부터 정제 할 수있다. 1 H-NMR, 항문ytical HPLC 및 ESI-MS는 완료의 Tz-BN-NOTA 전구체의 순도를 확인하는 데 사용할 수있는 모든 방법이있다. (11) </li><li> 액체 질소를 이용하여 수집 용 HPLC 용출액을 동결. </li><li> 불투명 한 알루미늄 호일에 얼어 붙은 수집 튜브를 감싸. </li><li> 동결 건조 선박 O에 얼어 붙은 포집 관을 배치 / N은 ​​HPLC 이동상을 제거합니다. </li><li> -80 ° C에서 어둠 속에서 정제 된 제품 (고체 밝은 분홍색)을 저장합니다. 참고 :이 절차의 허용 정지 점이다. 완료의 Tz-BN-NOTA 전구체는 이러한 조건 하에서 1 년 이상 안정하다. </li></ol> huA33-TCO 면역 접합체 2. 준비 <ol><li> 1.7 ml의 microcentrifuge 관에서, 1 ㎎ / ㎖ 건조 DMF에 TCO-NHS의 (2.7 mM)을 용액을 제조. </li><li> 1.7 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에서, 2 ㎎ / ㎖의 인산 완충 생리 식염수를 1ml의 huA33 (13.3 μM) 용액의 pH 7.4 (0.01 M PO 4 3- 준비 </sub&gt; 0.154 M의 NaCl). </li><li> 작은 분취 량 0.1 M 나 2 CO 3 (&lt;5 μL)을 사용하여, 8.8-9.0로 항체 용액의 pH를 조정한다. pH를 모니터링하는 미세 전극으로 pH 종이 또는 pH 측정기를 사용하고, pH가 9.0 이상 오르지 않도록주의하십시오. </li><li> 항체 용액은 정확한 pH에서되면, 활성화 된 에스터 8 몰 당량에 대응하는 TCO-NHS 용액의 볼륨. 예를 들어, 2 ㎎ / ㎖ huA33 항체 용액 (1.33 × 10 -8 몰 huA33)의 1 ml의 1 ㎎ / ㎖ TCO-NHS 용액 (1.07 × 10 -7 몰 TCO-NHS)의 7.9 μl를 추가합니다. 용액의 부피 5 % DMF를 초과하지 마십시오. </li><li> 부드럽게 microcentrifuge 관을 여러 번 반전하여 솔루션을 섞는다. </li><li> 불투명 한 알루미늄 호일의 microcentrifuge 관을 감싸. </li><li> 이 솔루션은 온화한 교반과 함께 실온에서 1 시간 동안 배양 할 수 있습니다. </li><li> RT에서 1 시간 후, 사전 포장 된 일회용 SIZ를 사용하여 생성 된 면역 접합체를 정제전자 제외 탈염 열입니다. 보관시 컬럼에 존재하는 방부제를 제거하기 위해 공급자에 의해 설명 된 바와 같이 첫째, 크기 배제 열을 씻어. 그 후, 크기 배제 컬럼에 반응 혼합물을 추가 1.5 ㎖의 0.9 % 멸균 식염수와 열 린스,이어서 용 리제로서 0.9 % 멸균 식염수 2 ㎖를 사용하여 제품을 수집한다. 참고 :이 단계는 2 ml의 솔루션으로 완성 된 huA33-TCO를 얻을 것입니다. </li><li> 분광 광도계 UV-비스에서 얻어진 huA33-TCO의 농도를 측정한다. </li><li> 높은 농도가 요구되는 경우, 50,000 분자량 컷 - 오프로 원심 필터 유닛을 이용 huA33-TCO 용액을 농축시킨다. 주 : huA33 및 기타 잘 알려진 항체 (예를 들어, 베바 시주 맙, 트라 스투 주맙, 세툭시 맙 및 J591)의 다양한 집중되는 매우 관대 한 반면, 집계 및 침전이 다른 경우 농도에 따라 발생할 수 있음을 유의해야합니다. 연구진은이 proced 시도새로운 항체 올바는 문학 또는 항체를 집중할지 여부와 관련하여 문제가되는 항체의 자신의 지식을 신뢰해야합니다. </li><li> 어둠 속에서 4 ° C에서 완성 된 huA33-TCO의 면역을 저장합니다. 참고 :이 절차의 허용 정지 점이다. 완성 된 단클론 항체 접합체-TCO이 보관 조건에서 3 개월 이상 안정해야한다. </li></ol> 의 Tz-BN-NOTA 3. 64 구리의 방사선 참고 : 프로토콜의이 단계는 취급 및 방사능의 조작을 포함한다. 방사능과 다른 작업을 수행 - - 다음 단계를 수행하기 전에 연구자들은 자신의 집 기관의 방사선 안전 부서와상의해야합니다. 이온화 방사선에 대한 노출을 최소화하기 위해 가능한 모든 조치를 취합니다. <ol><li> 1.7 ml의 microcentrifuge 관에서 0.5 ㎎ / ㎖ (723 μM)의 Tz-BN-NOTA의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 1.7 ML의는 MicroC에서entrifuge 튜브, 0.2 M NH 4 OAC의 pH 5.5 완충액 400 μL에의 Tz-BN-NOTA 용액 (5 μg의) 10 μl를 추가합니다. </li><li> 적절한 방사 화학 노트 유지의 관심에서 측정하기 전에 아래의 프로토콜 (3.4-3.8)에서 다음의 단계 후 투여 교정기를 사용하여 샘​​플에서 방사능의 양을 기록한다. 이 방사 화학적 수율의 정확한 결정에 도움이 될 것입니다. </li><li> 의 Tz-BN-NOTA 솔루션 (64) 구리의 2,000 μCi를 (74 MBq의)를 추가합니다. 주 : 일반적으로, [64의 Cu]의 CuCl 2는 0.1 N HCl을 소량 (&lt;30 μL)에 공급되고, 따라서 단지 소량은 (&lt;10 μL)이 스톡 용액은 방사성 표지 반응에 필요하다. [64의 Cu]의 CuCl 2 콘텐츠의 많은 양이 필요할 경우, 방사성 표지 반응은 전체 반응 부피를 증가 관대하다. 그러나, 방사성 표지 반응 용액의 pH를 보장하기 위해주의 깊게 모니터링되어야이는 pH가 4.0 이하로 떨어지지 않습니다. </li><li> 이 솔루션은 온화한 교반과 함께 실온에서 10 분 동안 품어하도록 허용합니다. </li><li> 인큐베이션 10 분 후, 역상 C 18 HPLC 크로마토 그래피를 사용하여 생성물을 정제. 체류 시간은 분명히 각 실험실 (펌프, 열, 튜브 등)의 HPLC 장비 설치에 크게 의존한다. 그러나, 예를 제공하는 경우의 구배 5:95의 MeCN / H 2 O 95 (모두 0.1 % TFA 사용) : 5의 MeCN / H 2 O 15 분 동안 사용하는, 64 CU-Tz-의 체류 시간 무료, 복합체를 형성하지 못한 64 Cu를 약 2-4 분에서 용매 전면으로 용출 반면 BN-NOTA은 약 9.8 분이어야합니다. </li><li> 회전 증발기를 사용하여, HPLC 용 출제를 제거. </li><li> 0.9 % 멸균 식염수에 64 CU-의 Tz-BN-NOTA 생성물을 재용. 주 : (64) 구리의 12.7 시간의 물리적 반감기를 고려할 때,이 절차의 허용 정지 점 없습니다. 64의 합성 CU-의 Tz-BN을-NOT 수행방사성 리간드의 주입 직전에, 스텝 4.5 즉시 3.7 단계에 따르십시오. </li></ol> 생체 Pretargeted PET 영상 4. 참고 : 프로토콜 제 3 절에서와 같이, 프로토콜의이 단계는 취급 및 방사능의 조작을 포함한다. 다음 단계를 수행하기 전에 연구자들은 자신의 집 기관의 방사선 안전 부서와상의해야합니다. 이온화 방사선에 대한 노출을 최소화하기 위해 가능한 모든 조치를 취합니다. <ol><li> 그리고 여자를 누드 마우스 피하 이식 1 × 6 SW1222 대장 암 세포에서하는 것은 이러한 (9~12일 접종 후) 100-150mm 3 이종 이식으로 성장 할 수 있습니다. (11) </li><li> 0.9 % 멸균 식염수에 0.5 ㎎ / ㎖의 농도로 제 2 프로토콜로부터 huA33-TCO 용액의 분취 액을 희석한다. </li><li> 이종 - 함유 마우스의 꼬리 정맥 내로 huA33-TCO 용액 200 μL (100 μg의)을 주입. </li><li> 마우스의 종양에서 huA33-TCO의 축적을위한 24 시간을 허용합니다. </li><li> 0.9 % 멸균 식염수에서 1.5 mCi의 / ml의 농도로 64 CU-의 Tz-BN-NOTA 방사성 리간드를 희석. </li><li> 의 꼬리 정맥 내로 (6.7 MBq의 / nmol의 특정 활성을 가정하면, 64 CU-의 Tz-BN-NOTA 1.6 nmol의; 11.1 MBq 내지 300 μCi를) 64 CU-의 Tz-BN-NOTA 방사성 리간드 용액 200 μl를 주입 이종 이식 베어링 쥐. </li><li> 촬상 원하는 시점에서 (예를 들어, 2, 6, 12, 또는 24 시간 후 분사), 2 % 이소 플루 란 마취 마우스 : 산소 가스 혼합물. </li><li> 작은 동물 PET 스캐너의 침대에 마우스를 놓습니다. 산소 가스 혼합물 : 1 % 이소 플루 란을 이용하여 스캔하는 동안 마취를 유지한다. 스캐너 침대에 동물을 배치하기 전에, 토​​우 - 핀치 방법을 사용하여 마취를 확인하고 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈 연고 수의학 적용. </li><li> 정적 통해 마우스 PET 데이터를 획득350-700 keV의 에너지의 창 6 나노초의 일치 타이밍 윈도우를 사용하여 2000 만 일치 이벤트 최소 스캔. 이미지의 인수를 완료 한 후, 무인 마우스를 벗어나지 않아이 의식을 회복 할 때까지 다른 마우스와 케이지로 변경하지 마십시오. </li></ol>

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이 PET pretargeted 촬상 전략의 주요 장점은 직접 표지 된 항체에 의해 생성 된 배경 방사선 량의 단지 일부만 타겟 간 배경 화상의 콘트라스트를 종양의 윤곽을 할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 여기에 설명 된 대장 암 이미징 시스템에서, 급성 생체 분포 실험의 데이터는 표지 된 64 CU-NOTA-huA33 89 ZR-DFO-huA33 함께 64 Cu- 기 pretargeting 전략 선량 계산을 수행하는 데 사용 하였다. 임상 적으로 더 관련 ZR (89) 표지 된 항체와 비교할 때 이러한 계산 명확 특히 pretargeting 시스템의 선량 이점을 예시한다. 0.4162 mSv를 / MBq의 : 89 ZR-DFO-huA33의 30 배 이상 높은 반면 pretargeting 전략의 유효 선량은 0.0124 mSv를 / MBq의입니다. (64)에 비교할 때 pretargeting의 선량 이익을 덜...

지난 30 년 동안, 양전자 방출 단층 촬영 (PET)는 암의 진단 및 관리에 필수적인 임상 도구가되었다. 항체는 긴 암 바이오 마커에 ​​대한 그들의 절묘한 친화력과 특이성으로 인해 종양 양전자 방출 방사성 동위 원소의 전달을위한 유망한 벡터를 고려하고있다. 항체의 1, 2 단, 상대적으로 느린 생체 내 약물 동태는 여러 날에 방사성 동위 원소의 사용을 의무화 물리적 반감기. 부분 바디 CT 스캔 달리 - - 조합은 환자의 비 - 표적 기관, radioimmunoconjugates 정맥 따라서 주입되기 때문에 특히 임상 적 의의이다 중요한 합병증 높은 방사선 량을 수득 할 결과를 흡입 투여로 신체의 모든 부분에서, 심문 조직에 관계없이. 이 문제를 우회하기 위해 상당한 노력을 develo의 전념하고있다동시에 내재 약동학 적 한계를 둘러싸하면서함으로써 항체의 유리한 특성을 활용, 방사성 동위 원소 및 표적 부분을 분리 PET 영상 전략의 pment. 이러한 전략은 - 가장 자주 pretargeting 또는 다단계 타겟팅라고 - 전형적으로 네 단계를 채택한다 : (1) 항원 및 방사성 리간드를 모두 결합 할 수있는 항체의 투여; (2) 표적 조직 및 혈액에서 그 간극에서 항체의 축적; (3) 작은 분자 방사성 리간드의 투여; 및 (4)를 초과하는 방사성 리간드의 급속한 냄. 일부 경우에 3-8 이어 항체에 방사성 리간드의 생체 결찰은 추가적인 소거 에이전트는 항체의 배설을 촉진시키기 위해 단계 (2)와 (3) 사이에 주입된다 그 종양을 결합 아직 혈액에 남아 있습니다. (5) 대체로, TW를 말하기pretargeting 전략의 O 유형은 문학에서 가장 널리 있습니다. 모두 전임상 모델에서 성공적으로 검증되었지만, 그들은 또한 임상 적용을 방해 한 키 제한을 갖는다. 첫 번째 전략은 스트렙 타비 딘 - 복합 항체와 비오틴 - 수정 방사능 표지 사이의 높은 친화력에 의존; 그러나, 스트렙 타비 딘 - 수정 항체의 면역 원성은 번역과 관련하여 우려되는 문제로 입증되었습니다. 5,6,9,10 두 번째 전략은, 대조적으로, 암을 모두 결합하는 유전자 조작 된 특이 적 항체를 사용 후자의 경로가 확실히 창조적 인 반면 바이오 마커 항원과 작은 분자 방사성 동위 원소 표지 합텐. 3,11-14은 광범위한 적용은 시스템의 모듈 방식의 복잡성, 비용 및 부족에 의해 제한됩니다. 최근에는 개발 (역 전자 수요 딜스 - 알더 I에 기초를 pretargeted PET 이미징 방법을 게시EDDA) 트랜스 -cyclooctene (TCO) 및 테트라 (Tz 일 사이의 고리 화 반응;.에 의해 예시 그림 1) (11) 반응 자체가 수십 년 동안 알려져있다 동안은 IEDDA 화학은 클릭 화학 바이오 콘쥬 게이션 기술로 최근 몇 년 동안 르네상스를 경험하고있다 랄프 Weissleder, 조셉 폭스, 펩티드, 항체 및 나노 입자의 형광 이미지 등을 포함한 12-15 IEDDA의 고리가 설정의 넓은 범위에서 적용되었다. 다른 중에서 피터 콘티의 기의 매혹적인 작품뿐만 아니라 핵 이미징 .. 27 bioorthogonal 클릭 화학의 종류의 숫자 동안 - 비판적 - radiohalogens 및 radiometals 모두 16-26 결찰은 항복 높은 깨끗하고 빠른 (K 1&gt; 30,000 M -1 초 -1), 선택하고, - 구리 촉매 아 지드 - 알킨 cycloadditions, 변형 승진 아 지드 - 알킨 cycloadditions, 그리고 슈타 우 딩거 LIG 손해 포함관리 포인트 -. 그것은 전체 유기체에서 응용 프로그램을 pretargeting에 매우 적합 IEDDA 화학을하게 빠른 반응 속도와 bioorthogonality의 고유 한 조합뿐만 아니라 bioorthogonal있는이 라인을 따라 28, 29, 그것의 최근 보고서 것이 중요합니다 우리의 실험실 pretargeting에 IEDDA 화학을 첫 적용되지 않았습니다. IEDDA와 pretargeted 영상의 첫 번째 보고서는 Rossin의 작업, 등에서 일어나 (111)에 표지 테트라를 사용하는 SPECT 방법론을 기능을 갖춘 30. 우리는 상술 한 바와 같이, pretargeting 방법은 네 가지 매우 간단한 단계 (그림 2). 손 프로토콜, 64 CU-NOTA 표지 된 방사성 리간드 및 테트라 huA33 항체의 TCO 변성 공액을 채용 대장 암 PET 이미징 pretargeted 전략을 설명한다. 그러나,이 방법의 궁극적 모듈화는 GR 중 하나입니다트랜스 -cyclooctene 잔기로서 eatest 자산은 비 내재화 항체에 추가 될 수 있고, 테트라 방사성 기자의 다양한 부착 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Tetrazine NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764701</td><td>매장 -80 &deg; C</td></tr><tr><td>트랜스 사이클로 옥텐 NHS 에스테르</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>764523</td><td>-80 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>p-NH2-Bn-NOTA</td><td>Macrocyclics</td><td>B-601</td><td>-80 &deg; 씨</td></tr></tbody></table>

pretargeted pet 영상에 대한 bioorthogonal 역 전자 수요 딜스 - 알더 고리 모으고

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

항체는 뛰어난 친화력과 특이성으로 인해 PET 이미징을 위해 암세포에 방사성 동위원소를 전달하기 위한 매우 유망한 벡터가 되었습니다. 그러나 물리적 반감기가 긴 방사성 핵종으로 항체를 표지해야 하는 필요성은 종종 비표적 조직에 대한 높은 배경 방사선 선량을 초래합니다. 이 문제를 피하기 위해 우리는 역 전자 수요 Diels-Alder cycloaddition 반응을 기반으로 하는 사전 표적 PET 이미징 전략을 사용했습니다. 이 방법론은 항체와 방사능을 분리하여 항체의 긍정적인 특성을 활용하는 동시에 약동학적 단점을 피합니다. 이 시스템은 4단계로 구성됩니다: (1) mAb-trans-cyclooctene (TCO) 접합체 주입; (2) 항체가 종양에 축적되어 혈액에서 제거되는 국소화 기간; (3) 방사성 표지된 테트라진의 주입; 및 (4) 구성 요소의 생체 내 클릭 결찰 후 과도한 방사선 리간드의 제거. 당면한 작업에 제시된 예시에서, 64Cu-NOTA 표지 테트라진 방사성 리간드와 트랜스-사이클로옥텐 접합 인간화 항체(huA33)를 사용하여 종양-배경 대비가 높은 SW1222 대장암 종양을 설명했습니다. 또한, 사전 표적화 방법론은 64Cu 또는 89Zr로 직접 표지된 방사성 면역 접합체에 의해 생성된 비표적 조직에 대한 방사선량의 일부만으로 고품질 이미지를 생성합니다. 궁극적으로, 트랜스 사이클로옥텐 부분은 모든 비내재화 항체에 첨가될 수 있고 테트라진은 다양한 방사성 동위원소에 부착될 수 있기 때문에 이 프로토콜의 모듈성은 가장 큰 자산 중 하나입니다.

실험의 처음 세 단계 -의 Tz-BN-NOTA, huA33에 TCO의 접합의 합성과의 Tz-BN-NOTA의 방사성 표지는 (도 3 및도 4) 구성 - 매우 안정적. 상기 절차의 경우의 Tz-BN-NOTA 구조체는 고 수율 및 고순도로 합성 하였다. ~ huA33 항체는 4.2 ± 0.6 TCO / 단클론 항체로 수정하고, Tz 일-BN-NOTA은&gt; 85 % 붕괴 보정 수율, 그리고 특정 활동&gt; 99 % 방사 화학적 순도 정제 된 방사성 리간드를 얻을 수 (64) 구리와 방사성 동위 원소 표지이었다 6.7 MBq의 / nmol의 (그림 5). huA33-TCO 접합체의 반응성 및 테트라 방사선 리간드 방사성 순간 박막 크로마토 그래피 (ITLC)를 사용하여 시험 할 수있다. huA33 - TCO의 약간의 과잉 (6.7 MBq의 / nmol의 특정 활동을 가정, 0.55 nmol의 100 μCi를)이 방사성 동위 원소 표지 된 테트라을 혼합...

생물직교 역전자 수요 Diels-Alder cycloaddition은 암에 대한 효과적이고 모듈화된 사전 표적 PET 이미징 전략을 수립하기 위해 활용되었습니다. 이 프로토콜에서 이 방법론의 단계는 대장암 표적 항체 huA33 및 64Cu 표지 방사성 리간드를 사용하는 모델 시스템의 맥락에서 설명됩니다.

Pretargeted PET 영상에 대한 Bioorthogonal 역 전자 수요 딜스 - 알더 고리 모으고

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

다음 실험의 전반적인 목표는 Tetrazine과 trans-cyclooctene 사이의 생체 직교 반응을 이용하여 PET 영상화를 위해 암 조직을 사전 표적화하는 것입니다. 이는 종양을 가진 마우스에 trans-cyclooctene이 표지된 항체를 주입하고, 항체가 종양에 서서히 축적되고 혈액에서 제거되는 일정 기간을 거친 후, 동일한 동물에게 tetrazine 방사성 리간드를 주입함으로써 달성됩니다.방사성 리간드는 종양 부위에서 TCO가 표지된 항체와 클릭 반응을 일으키며, 저분자 화합물이기 때문에 혈액에서 빠르게 제거됩니다. 그 결과, 소동물 PET 영상에서는 높은 대조도와 높은 종양 대 배경 활성비로 종양이 명확하게 구분되어 나타납니다. 직접 표지된 항체를 이용한 PET 영상과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 환자에게 투여되는 방사선량의 일부만으로도 고대조도 영상을 제공한다는 점입니다.전타겟팅(pre-targeting) 기술은 종양에 매우 높은 양의 방사선을 전달하는 동시에 건강한 장기와 조직에 전달되는 선량은 매우 낮게 유지할 수 있으므로, 이 기술의 함의는 치료 분야까지 확장됩니다. 저희 실험실의 테크니션인 Catherine Kaza와 함께 이 기술을 시연하도록 하겠습니다. 합성 반응은 7 mg의 NH₂-BN-Notta를 pH 8.1의 0.1 M 중탄산나트륨 600 µL에 용해시키는 것으로 시작합니다.pH를 확인하고, 필요한 경우 0.1 molar 탄산나트륨을 소량씩 첨가하여 pH를 8.1로 조정합니다. 다음으로, 마이크로 원심분리 튜브에 담긴 0.5 milligrams의 TZ NHS에 이 용액을 추가합니다. 이 반응물을 실온에서 가볍게 흔들어주며 30분 동안 배양합니다.TZ NHS 스톡은 30분 후에 DMF 또는 DMSO에 녹일 수 있습니다. 반응하지 않은 NH 두 BN notta를 제거하기 위해 역상 C 18 HPLC로 생성물을 정제하며, 이는 254 nanometers에서 검출됩니다. TZ NHS 및 TZ BN Notta는 525 nanometers에서 모니터링하는 것이 가장 좋습니다.시료의 머무름 시간은 장비에 따라 달라질 수 있으나, 25분 동안 아세토니트릴 대 물의 기울기를 0에서 100, 다시 100에서 0으로 설정하고 4.6 by 250 millimeters C 18 분석 컬럼을 사용하면, 세 화합물의 머무름 시간은 각각 16.5, 15, 10분이 됩니다. 수집된 HPLC 용액을 액체 질소로 급속 냉동한 후, 튜브를 불투명한 알루미늄 호일로 감쌉니다. 이제 냉동된 튜브를 동결 건조 용기에 넣고 동결 건조기에 올려 하룻밤 동안 건조합니다.완성된 TZ bn no top 전구체의 순도를 확인하기 위해 HPLC 이동상을 제거하고, 프로톤 NMR, 분석용 HPLC 및/또는 ESI 질량 분석법을 사용하십시오. 두 번째 마이크로 원심분리 튜브에 DMF를 사용하여 2.7 millimolar 농도의 T-C-O-N-H-S 용액을 준비함으로써 이 반응을 시작하십시오. 1 mL의 PBS pH 7.4에 HUA 33을 녹여 2 mg/mL 용액을 준비하십시오.그런 다음 0.1 molar 탄산나트륨을 소량씩 첨가하여 용액의 pH를 8.8에서 9.0 사이로 조절하되, 이 범위를 넘지 않도록 합니다. 다음으로 활성화된 에스테르의 8 molar 당량에 해당하는 부피의 T-C-O-N-H-S를 첨가합니다. 용액을 몇 번 부드럽게 뒤집어 섞은 후 호일로 감쌉니다.그런 다음 튜브를 실온에서 약 1시간 동안 가볍게 흔들어주며 배양합니다. 1시간 후, 미리 충전된 일회용 크기 배제 탈염 컬럼을 사용하여 반응물로부터 면역접합체를 정제합니다. 반응 혼합물 1 mL를 컬럼에 넣고, 이어서 0.9% 멸균 식염수 1.5 mL를 추가합니다.그 다음, 0.9% saline 2 mL를 사용하여 휴머나이즈된 HUA 33 TCO 생성물을 용출합니다. UV vis 분광광도계로 생성물의 농도를 측정합니다. 농도가 원하는 수준보다 낮으면, 50,000 분자량 원심분리 필터로 생성물을 농축합니다.마이크로 원심분리 튜브에 TZ BN notta 0.5 mg/mL 용액을 준비하는 것으로 시작합니다. 두 번째 마이크로 원심분리 튜브에 준비된 TZ BN Notta 용액 10 µL를 pH 5.5의 0.2 M 아세트산 암모늄 완충액 400 µL에 추가합니다. 이후 이어지는 각 단계의 전후로 샘플의 방사능 양을 반드시 측정하고 기록하십시오.이는 방사화학적 수율의 정확한 계산과 기록 보관을 위해 필수적입니다. 이제 TZ BN Notta 용액에 2000 micro curies의 copper 64를 첨가하십시오. 이 혼합물을 실온에서 가볍게 흔들어주며 10분 동안 배양하십시오.생성물을 정제하려면 역상 C 18 HPLC를 사용하십시오. 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴과 물의 5:95에서 95:5 기울기 용리(gradient)를 15분 동안 사용하여 생성물을 희석합니다. 방사성 표지된 tz, BN nota는 9.8분에 용리되는 반면, 유리 구리 64는 2~4분 사이에 용매 전선(solvent front)과 함께 용리됩니다. 회전 증발기를 사용하여 HPLC 용매를 제거한 후, 방사성 표지된 생성물을 0.9% 멸균 생리식염수에 녹여 가능한 한 빨리 사용하십시오. 이 절차는 준비된 HEA 33 TCO 용액의 일정량을 0.9% 멸균 생리식염수로 희석하여 0.5 mg/mL 농도로 만드는 것부터 시작합니다.그 다음, 용액 200 µL를 제노그라프트(xenograft) 모델 마우스의 꼬리 정맥에 주입합니다. 인간화된 a 33 TCO가 혈액을 순환하며 종양에 24시간 동안 축적되도록 둡니다. 24시간 후, 0.9% 멸균 식염수 내에 1.5 mCi/mL 농도로 조제된 copper 64 표지 TZ BN Notta를 투여합니다.그다음, 원하는 시간에 준비된 방사성 리간드 용액 200 µL를 마우스의 꼬리 정맥에 주사합니다. 마우스를 마취시킨 후 소동물 PET 스캐너의 베드 위에 놓습니다. 노즈콘(nose cone)을 통해 마취 상태를 유지하고, 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 마취 상태를 확인해야 합니다.또한 건조를 방지하기 위해 안연고를 얇게 도포합니다. 이제 350 내지 700 keV 범위에서 6천만 개의 동시 계수 이벤트가 발생하는 정적 스캔을 통해 반려동물 데이터를 획득하고, 동시 타이밍을 6 ns로 설정합니다. 영상 촬영 후, 마우스가 의식을 회복할 때까지 기다렸다가 다른 마우스들과 함께 있을 수 있는 케이지로 돌려보냅니다. 33 항원을 발현하는 SW 1222 대장암을 이식한 thymic nude mice를 사용합니다.설명된 프로토콜을 사용하여 제노그라프트를 조사하였습니다. 급성 생체 분포 및 PET 영상 실험 모두에서 사전 표적화 전략이 우수한 영상 대비와 높은 종양 대 배경 방사능 비로 대장암 제노그라프트를 묘사할 수 있음을 보여줍니다. 수 시간 동안 방사성 리간드가 대변을 통해 배출되면서 종양 대 배경 방사능 비가 매우 높아집니다.이 프리타겟팅(pre-targeting) 접근 방식의 일부 변수들은 다른 모든 이미징 전략과 마찬가지로 최적화가 필요했습니다. 항체-TCO 접합체를 100 µg 대신 300 µg 투여하거나, 투여 간격을 24시간에서 12시간으로 단축했을 때 마우스의 심장에서 가시적인 방사능 수치가 증가했습니다. 두 경우 모두, 초기 시점의 종양 섭취에서 명확히 나타나듯이 종양 내에서 클릭 반응(click reaction)은 여전히 일어났습니다.하지만 클릭 반응이 혈액 내에서도 분명히 일어나고 있으며, 이는 바람직하지 않은 결과입니다. 이 절차를 시도할 때는 모든 프리타겟팅 변수들 사이의 정밀한 균형을 맞추어야 합니다. TCO 면역접합체의 질량과 주사 간의 시간 간격을 최적화하는 것이 매우 중요합니다.방사성 물질을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 실험 중에는 적절한 개인 보호 장구(PPE)를 착용하고 방사선이 항상 차단되도록 하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

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Bioengineering

생명공학

이 비디오는 종양 치료를 위해 면역접합체와 방사선 리간드를 투여하는 사전 표적 방사선 면역 요법 또는 PRIT의 기술을 설명합니다. 이 방사성 면역 요법은 건강한 조직에 대한 방사선량을 줄이고 항체 기반 벡터와 호환되지 않는 반감기가 매우 낮은 방사성 핵종을 사용합니다.

사전 표적 방사선 면역 요법: 종양에 치료용 방사성 핵종을 표적 전달하는 방법

우리는 순차적으로 온 - 칩 bioorthogonal 사이클로 화학 및 항체 - 항원 캡처를 사용하여 작은 분자의 빠른 가역적 고정화 및 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 연구를위한 기능화 나노 입자 어셈블리에 대한 방법을 제시한다.

역으로 작은 분자 또는 바이오 센서 애플리케이션을위한 다중 구성 요소 구조를 무력화하는 미세 유체 온칩 캡처 - 고리 화 반응

수일 방사성 반감기와 유리한 붕괴 특성으로 인해 양전자 방출 방사성 금속 89Zr은 PET 이미징을 위한 항체 기반 방사성 의약품에 사용하기에 매우 적합합니다. 이 프로토콜에서는 89Zr 표지 항체의 생체접합, 방사성 합성 및 전임상 적용에 대해 설명합니다.

바이오 콘쥬 게이션과의 Radiosynthesis<sup&gt; 89</sup&gt; ZR-DFO 표지 항체

I 125 - 표지 지드의 합성 및 무도 클릭 반응을 이용 dibenzocyclooctyne (DBCO) - 기 - 컨쥬 게이트 13 나노 크기의 금 나노 입자의 방사성 표지에 대한 세부 절차를 설명한다.

를 사용하여 금 나노 입자의 효율적인 방사성 표지를위한 최적화 된 프로토콜<sup&gt; (125)</sup&gt; I-표시 아 지드 보철 그룹

여기에서는 사전 표적화 및 생체 직교 화학을 위한 트라이덴테이트 99mTc(I) 킬레이트-테트라진 유도체의 방사성 표지 및 생체 내 테스트를 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

준비 및 평가<sup&gt; 99m</sup&gt; Bioorthogonal 화학을 사용하여 사전이 타겟팅에 대한 세자리 킬레이트를 Tc를 표지

우리는 [ 18 F] 3F4AP의 반자동 방사 화학 합성과 품질 관리 절차를 입증합니다.

자동 방사 화학 합성 [<sup&gt; 18</sup&gt; F] 3F4AP : 결절성 탈수 초성 질환 이미지 진단용 PET 트레이서

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

양전자 방출 단층 촬영 (PET) 이미징 사이트 여러 초기 임상 연구 실험에 관련 된 강력 하 고 다재 다능 한 radiotracer 제조 능력을 필요 합니다. Radiotracer [18F]를 사용 하 여 Clofarabine 예를 들어, 우리 자동화 radiotracer 유연한, 카세트 기반 radiosynthesizer를 사용 하 여 합성 하 고 합성 임상 사용에 대 한 유효성을 검사 하는 방법을 보여 줍니다.

양전자 방출 단층 촬영 (PET) Radiotracer 합성 프로토콜의 임상 생산을 위한 자동화

이 프로토콜 합성 및 트랜스-cyclooctene (TCO)의 특성에 설명 합니다-항 체와 177루 표시 tetrazine (Tz) radioligand pretargeted radioimmunotherapy (PRIT)에 대 한 수정. 또한, 그것은 자세히 biodistribution vivo에서 및 colorectal 암의 murine 모델에 경도 치료 연구에 대 한 이러한 두 가지 구조를 사용 하 여를 설명합니다.

Pretargeted Radioimmunotherapy 역 전자 수요 Diels 오리 나무 반응에 따라

우리는 이광자 여기 형광 현미경(2PEF)과 통합된 산화중수소(중수D2O) 탐침 자극 라만 산란(DO-SRS) 현미경을 사용하여 아미노산에 의해 조절되는 세포에서 대사 활동을 직접 시각화하는 프로토콜을 제시합니다.

방향족 아미노산에 의해 조절되는 세포 대사의 생체 직교 화학 이미징

이 프로토콜은 "루프 방법"[11C]메틸화를 통해 4개의 탄소-11 방사성 추적자를 준비하는 자세한 절차를 제시합니다. [11C]ER-176을 3개의 추가 방사성 추적자([11C]MRB, [11C]mHED 및 [11C]PiB)에 대한 데이터와 함께 합성하는 절차를 설명합니다. 루프 방법은 전통적인 반응 용기 [11C] 메틸화에 대한 증가된 방사성 화학적 수율로 효율적인 합성을 제공합니다.

Enhancing Efficiency and Radiolabeling Yields of Carbon-11 Radioligands for clinical research with the loop method(루프 방법을 사용한 임상 연구를 위한 탄소-11 방사성 리간드의 효율성 및 방사성 표지 수율 향상)

배우세요 생체정교 반응을 이용한 대장암 표적화 PET 영상 기법으로, TCO 항체와 테트라진 방사성 리간드를 사용하여 종양 대비 배경 비율을 높이고 방사선 노출량을 줄이는 방법입니다.

Pretargeted PET 영상에 대한 Bioorthogonal 역 전자 수요 딜스 - 알더 고리 모으고

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