건설 셀 기반의 신경 전달 물질의 광학 검출을위한 신경 전달 물질 형광 엔지니어링 기자 (CNiFERs) 생체

이 비디오의 전반적인 목표는 생체 내에서 특정 신경전달물질의 방출을 광학적으로 모니터링하는 데 사용할 수 있는 CNiFER(Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Reporters)의 구성 및 테스트 방법론을 설명하는 것입니다. 이 방법은 뇌에서 신경 조절제의 시기와 방출에 관한 신경 과학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 GPCS를 통해 신호를 보내는 모든 유형의 신경전달물질 또는 신경조절제에 적용할 수 있다는 것입니다.

이 방법의 지역별 데모가 도움이 됩니다. 이는 생체 내 주입이며, CNiFER의 후속 이미징은 기술적으로 까다롭습니다. 이 절차를 시작하려면 T-25 플라스크에 전면 기반 칼슘 검출기와 키메라 g 단백질을 포함하는 HEK293 세포를 참조하십시오.

그런 다음 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 약 50%가 합류할 때까지 5%의 CO2로 세포를 성장시킵니다. 그런 다음 T-25 플라스크에서 배지를 흡입합니다. lenta 바이러스 배지 혼합물 2ml를 넣고 T-25 플라스크를 섭씨 37도에서 5%CO2로 배양합니다.

다음 날, 트립신 1ml를 첨가하여 감염된 HEK293 세포를 채취합니다. 다음으로, 세포 펠릿을 5ml의 HEK293 성장 배지에 재현탁시킵니다. 냉동 및 보관을 위해 T-75 플라스크에 1ml의 세포를 시딩하고, FACS 분석을 위해 T-25 플라스크에 1.5ml의 세포를 시딩합니다.

10점 작용제 곡선의 경우 감염된 세포를 테스트하기 위해 피브로넥틴이 코팅된 96 웰 플레이트의 처음 두 줄을 웰당 100마이크로리터의 세포 현탁액으로 시드합니다. 그런 다음 T-25 플라스크, T-75 플라스크 및 96 웰 플레이트에서 자라는 HEK293 세포를 섭씨 37도에서 약 90% 융합할 때까지 1-2일 동안 5% CO2로 배양합니다. FACS 분석 전에 예측된 EC 50을 괄호로 묶는 10가지 서로 다른 작용제 농도의 약물 플레이트를 준비하여 GPCR의 기능적 발현을 측정합니다.

연속 희석 방법을 사용하여 다양한 농도의 작용제를 준비하고 약물 농도를 추적하기 위해 템플릿을 만듭니다. 그런 다음 플레이트 리더 온도를 섭씨 37도로 설정합니다. 그런 다음 96웰 형광 플레이트 리더를 프로그래밍하여 프렛을 측정하고 용액 전달을 수행합니다.

유전적으로 인코딩된 프렛 기반 칼슘 센서인 TNXXL로 프렛을 측정하려면 여기 파장을 436 플러스 또는 마이너스 4.5나노미터로 설정하십시오. 그런 다음 ECFP 및 황수정에 대한 방출 필터와 차단 필터를 설정합니다. 다음으로, 플레이트 리더가 4초마다, 총 180초 동안 배출량을 측정하도록 프로그래밍합니다.

100 microleader 플레이트 용량, 150 microl 피펫 높이 및 3fold compound plate에서 50 micro liter 약물 전달 옵션을 선택하십시오. 약물 전달 시점을 30초로 설정합니다. 그런 다음 A 행과 B 행에서 매체를 흡인하고 100 웰 스니퍼 플레이트에 96 마이크로리터의 ACSF를 추가하면 약 90% confluent입니다.

그런 다음 3중 약물 플레이트와 96웰 스니퍼 플레이트를 플레이트 리더에 로드합니다. 프로그램을 시작하기 전에 섭씨 30도에서 플레이트가 37분간 평형을 이루도록 하십시오. 플레이트 리더가 실행된 후 형광 리더 값을 텍스트 파일로 내보냅니다.

그런 다음 이 파일을 이전에 만든 스프레드시트 템플릿으로 가져와 형광 강도를 자극 전 기준선으로 정규화하고, 각 작용제 농도에 대한 최대 프렛 비율을 계산하고, 용량 반응 곡선을 생성합니다. 수직 전극 풀러에 유리 모세관을 올려 CNiFER 주입 피펫을 준비합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 전극 끝을 약 40마이크로미터 직경으로 부수십시오.

ACSF에 적신 스펀지를 마취된 마우스의 미리 형성된 2 x 3mm 두께의 두개골 창에 올려 놓고 세포를 주입할 준비를 하는 동안 촉촉함을 유지합니다. 다음으로, T-75 플라스크에서 성장한 CNiFER 클론을 약 80% 포화도까지 수확합니다. 배지를 흡인하고 멸균 PBS로 세포를 세척합니다.

PBS를 제거하고 10ml의 ACFS를 사용하여 플라스크 바닥에서 세포를 제거합니다. 그런 다음 세포를 삼중화하여 세포 덩어리를 해리합니다. 세포 배양 원심분리기에서 2분 동안 원심분리기를 사용합니다.

상등액을 제거하고 펠릿을 100마이크로리터의 ACSF에 재현탁합니다. 그 후, 1400 회 G에서 30 초 동안 원심 분리기를 제거하고 상층액을 제거하여 ACSF로 덮인 펠릿을 남긴다. 그런 다음 주입 피펫에 미네랄 오일을 다시 채웁니다.

피펫을 나노 주입기에 로드합니다. 5마이크로리터의 CNiFER 세포 현탁액을 마우스 제제 근처의 플라스틱 파라핀 필름 스트립에 놓습니다. 당겨진 피펫에 CNiFER 세포를 끌어들입니다.

이제 피펫을 대상 x 및 y 좌표로 이동합니다. 피펫을 내리고 이전에 준비한 얇아진 두개골을 뚫습니다. 두개골 표면에서 약 200-400마이크로미터 아래, 피질의 2층과 3층으로 계속 이동합니다.

나노 주입기로 가장 깊은 부위에 4.6나노리터의 CNiFER 세포를 주입합니다. 오일과 셀 인터페이스의 움직임을 주목하십시오. 그런 다음 세포가 분주할 때까지 5분 동안 기다립니다.

피펫을 약 100마이크로미터 빼내고 4.6나노리터의 CNiFER 셀을 추가로 주입한 후 다시 5분 동안 기다립니다. 그런 다음 CNiFER의 역류를 방지하기 위해 피펫을 천천히 부드럽게 빼냅니다. 이 절차에서는 머리를 고정한 마우스가 있는 이미징 플랫폼을 2광자 이미징 현미경의 10x 침수 대물렌즈 아래에 놓습니다.

505나노미터의 이색성 거울이 있는 프렛 이미징용 필터 큐브와 ECFP 측정을 위한 460나노미터에서 500나노미터, 황수정 측정을 위한 520나노미터에서 560나노미터에 이르는 대역 통과 필터를 삽입합니다. 그런 다음 얇아진 두개골 창이 포함된 우물에 ACSF를 추가하고 10x 침수 대물렌즈를 ACSF로 내립니다. 수은 l과 함께 접안렌즈를 사용하십시오.amp, GFP 필터 큐브를 사용하여 CNiFER을 찾습니다.

이제 40배 침수 목표로 전환하세요. 다음으로, 두 개의 광자 이미징에 적합한 광 경로를 선택합니다. 근적외선 펨토초 펄스 레이저를 켭니다.

820나노미터의 파장과 5-15%의 전력 설정을 선택합니다.pmt 1 및 pmt 2 전압을 pmt에 따라 일반적으로 500-1000볼트의 준최대값으로 설정합니다. 그런 다음 각 채널에 대해 게인을 1로 설정하고 목표에 대한 z 위치를 0으로 설정합니다. 대물렌즈를 피질 표면에서 약 100-200마이크로미터 낮추고 xy 스캔을 시작합니다.

각 채널의 레이저 출력, 게인 및 pmt 전압을 조정하여 CNiFER의 형광의 신호 대 잡음비를 최적화합니다. 다음으로, 소프트웨어를 사용하여 이미징을 CNiFER 세포가 포함된 영역과 배경 영역으로 제한합니다. 적절한 신호 대 잡음 비율에 대해 평균 2인 cowman 라인을 선택하고 픽셀당 4마이크로초에서 3-1헤르츠의 스캔 속도를 사용합니다.

그런 다음 CNiFER 셀 주위에 ROI를 그립니다. 평면 당 약 3-4 개의 셀을 둘러쌉니다. ROI 평균 강도에 대한 실시간 분석을 설정합니다.

그런 다음 시간 경과에 따른 CNiFER 개화를 모니터링하기 위해 수집을 시작하고 fret을 모니터링하면서 전기 자극 또는 행동 실험을 시작합니다. 이 예시에서, D2R CNiFER fret의 반응은 용액 전달 시스템이 있는 플레이트 리더에서 측정되었습니다. 이 그래프는 D2 CNiFER에 도파민을 적용하는 동안의 프렛 반응을 보여줍니다.

ECFP 방출은 감소하는 반면 황수정 배출은 도파민과 함께 증가합니다. 다음은 해당 프렛 비율의 그래프입니다. 다음은 도파민 및 노르에피네페린에 대한 D2 CNiFER의 반응에 대한 용량 반응 곡선입니다.

또한 D2R이 없는 반응형 제어 CNiFER이 제시됩니다. 이 막대 그래프는 50 나노 어금니와 1 마이크로 어금니에서 다른 신경 전달 물질 및 조절자에 대한 프렛 비율 반응을 보여줍니다. 여기서, 흑질(substantia nigra)에 있는 DA 뉴런의 전기 자극은 D2 CNiFER에 대한 프렛 비율의 큰 변화를 이끌어냅니다.

전기 자극의 강도가 증가함에 따라 응답의 진폭이 어떻게 증가하는지 주목하십시오. 자극과 코카인 주사를 결합하면 CNiFER 반응이 증가합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생체 내 이미징을 위해 CNiFER을 생성, 테스트 및 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

CNiFER의 개발 전반에 걸쳐, 이러한 세포는 궁극적으로 살아있는 쥐에 이식되기 때문에 멸균 기술을 유지하는 것이 필수적입니다. CNiFER의 실현은 신경 과학 분야의 연구가 G 단백질 결합 수용체를 통해 신호를 보내는 신경 전달 물질 또는 신경 조절제의 방출을 광학적으로 측정하는 중요한 도구를 제공합니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 행운을 빕니다.