Name: 건설 셀 기반의 신경 전달 물질의 광학 검출을위한 신경 전달 물질 형광 엔지니어링 기자 (CNiFERs) 생체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 배우세요 CNiFERs를 이용한 생체 내 신경전달물질 광학 검출 기법을 HEK293 세포로 구축하는 방법입니다. 이 기술은 뇌 신경조절물질 동역학 연구에 활용됩니다.

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우리는 전자 제품에 대한 지원은 G의 qi5 및 G QS5 cDNA를, A. 슈바이처를 제공 B. 콘 클린 (캘리포니아 대학 샌프란시스코)를 감사, N. 테일러 증거 읽기 클론, 이안 Glaaser 로버트 리프킨의 심사에 대한 지원 및 TN-XXL에 대한 올리비에 Griesbeck. (; DA037170 DA029706), 바이오 메디컬 이미징 및 생물의 국립 연구소 (NIBIB) (EB003832), 호프만 - 라 로슈 (88610A)과 &quot;신경 과학이 작품은 약물 남용에 미국 국립 연구소 (NIDA)를 통해 연구비에 의해 지원되었다 NIDA (DA007315)를 통해 남용 &quot;훈련 보조금의 마약 관련.

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

CNiFERs의 생성은 광학적으로 생체 내에서 뇌의 신경 전달 물질의 방출을 측정하기위한 혁신적이고 독특한 전략을 제공합니다. CNiFERs 이상적으로 신경 전달 물질에 대한 예 extrasynaptic 해제, 볼륨 전도를 측정하기에 적합합니다. 중요한 것은, 각 CNiFER은 뇌의 신경 전달 물질의 농도의 변화 생리 광 측정을 제공하는 천연 GPCR의 특성을 가지고있다. 지금까지 CNiFERs은 아세틸 콜린을 검출 생성 된 (M1-CNiFER) (6), 도파민 (D2-CNiFER) (7)과 노르 에피네프린 (α1a-CNiFER) 7. 주에서, CNiFER는 GPCR을 통해 신호하는 신경 전달 물질 생성 할 수 있습니다. G의 Q G 단백질을 통해 GPCR 신호가 더 이상 수정이 HEK293 세포에 필요하지 않은 경우에 대해. G 통해 신호의 GPCR은 I ...

완전히 신경 뇌에서 통신하는 방법을 이해하기 위해, 생체 내에서 신경 전달 물질의 방출을 측정하는 방법을 갖는 것이 필요하다. 생체 내에서 신경 전달 물질을 측정하기위한 몇 가지 잘 확립 된 기술이있다. 하나의 일반적으로 사용되는 기술은 캐뉼라 뇌에 삽입 뇌척수액 소량의 수집 및 고성능 액체 크로마토 그래피 및 전기 검사 1을 사용하여 분석되는 미세 투석이다. 미세 투석 프로브 몇 직경 정도의 공간 분해능을 가지며, 예를 들어 ~ 200 μm의 마이크로 프로브 직경 0.5 mm. 이 기법의 시간 해상도는, 그러나, 일반적으로 ~ 5 분 1 이상을 지속 샘플링 간격으로 느립니다. 또한, 분석은 실시간으로 제작되지 않습니다. 다른 기술은 뇌에 삽입되는 탄소 섬유 프로브를 사용하여 고속 스캐닝 순환 전압 전류 법 (FSCV)이다. FSCV 우수한 온도가구강 해상도 (초 단위), 고감도 (나노 몰), 30 μm의 5의 프로브 직경 공간 해상도. 그러나 FSCV는 탄소 전위차 프로브 (2)에 전압 특성 산화 및 환원 프로파일을 생성 송신기들로 제한된다. 신경 전달 물질을 측정하는 세 번째 기술은 유 전적으로 인코딩 된 신경 전달 물질 (NT) 바이오 센서 (3)를 통해 직접입니다. 이 방법으로 융합 단백질은 형광 공명 에너지 전달 (FRET) - 기반 형광체 (4)의 쌍 또는 순열 GFP (5)에 결합 된 송신기에 대한 리간드 결합 도메인을 포함하는 생성된다. 앞의 두 방법과 달리,이 바이오 센서는 전적으로 인코딩 된 형질 전환 동물의 생산을 통해 또는 급성 세포 감염 바이러스 제제의 사용과 같은 신경 세포와 같은 숙주 세포의 표면에 발현. 현재까지 유전자 부호화 바이오 센서 만 detectin 개발되어왔다g 글루타메이트와 GABA 3-5. 이러한 기술에 대한 제한은 nM의 범위에서 낮은 감도 및 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)를 통해 신호를 예를 들어 송신기, 고전 신경 전달 물질, 신경 펩티드 및 신경 조절의 다수 검출 확대 없게되었다. 실제로, 인간 게놈에서 거의 800 GPCRs에있다. 이러한 부족을 해결하기 위해, 우리는 GPCR을 통해 신호를 어떤 신경 전달 물질의 광학적 측정 자료에 혁신적인 도구를 개발했습니다. CNiFERs (셀 기반의 신경 전달 물질의 형광 설계 기자)가 자극하면 [Ca를 2+ 즉이 유전자 부호화 FRET 계 칼슘 센서에 의해 검출되어, 세포 내에서의 증가를 유발 특정 GPCR을 발현하도록 유전자 클론 HEK293 세포이다 TN-XXL. 따라서 CNiFERs은 신경 전달 물질 수용체, 형광의 변화에​​ 직접 결합 실시간 광 (R)을 제공하는 변환지역의 신경 전달 물질 활동의 EAD 아웃. 특정 신경 전달 물질에 대한 고유 수용체를 이용하여, CNiFERs 화학 특이성, 친 화성 및 내생 발현 수용체의 시간적 동성을 보유한다. 지금까지, 우리는 CNiFERs 세 가지 유형, 도파민을 검출하는 M1 수용체를 이용하여 아세틸 콜린의 검출을 작성한 D2 수용체를 사용하고 α1a 수용체 6,7을 사용하여 노르 에피네프린을 검출하기위한 하나. CNiFER 기술은 GPCR의 유형은 의무가있어 쉽게 확장과 확장 성이다. 이 조브 기사에서, 우리는 설명하고 모든 응용 프로그램에 대한 생체 CNiFERs의 설계, 실현 방법, 테스트를 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>pCDH-CMV-MCS-EF1-퓨로&nbsp;</td><td>System Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>복제: 렌티바이러스</td></tr><tr><td>생성 12 x 75 *BD Falcon High Clarity 폴리프로필렌 라운드 바닥 테스트 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td>FACS</td></tr><tr><td>BD 40 um Falcon 세포 여과기</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>FACS</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96 웰 플레이트, 평평한 바닥, 투명&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>3596</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96웰 세포 배양 플레이트&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>CLS3997</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Optilux 블랙 클리어 바텀&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>3603</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Flexstation 피펫 팁</td><td>분자 장치</td><td>9000-0911</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>아세틸콜린 염화물&nbsp; &nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2661</td><td>플렉스스테이션</td></tr><tr><td>노르에피네프린&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7256</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>도파민 염산염&nbsp; &nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>PHR1090</td><td>플렉스스테이션</td></tr><tr><td>GABA&nbsp; &nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2129</td><td>플렉스스테이션</td></tr><tr><td>히스타민&nbsp; &nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>H7125</td><td>플렉스스테이션</td></tr><tr><td>글루타메이트&nbsp; &nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>49621</td><td>플렉스스테이션</td></tr><tr><td>에피네프린&nbsp; &nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>E4642</td><td>플렉스스테이션</td></tr><tr><td>소마토스타틴&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>S1763</td><td>플렉스스테이션</td></tr><tr><td>5HT&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9523</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>VIP&nbsp;</td><td>알파 다이어그노스틱스&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>SP-69627</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Orexin A</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>12-p-01</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Substance P&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6883</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>아데노신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>멜라토닌&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5250C</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>형광판 리더 및 소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td>Flexstation 3</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&nbsp; Glutamax를 함유한 DMEM(고포도당); &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>조직 배양</td></tr><tr><td>&nbsp; 태아 소 혈청</td><td>Life</td><td>Technologies 10082-139</td><td>조직 배양</td></tr><tr><td>&nbsp; 펜/스트렙&nbsp; 항생제</td><td>Life</td><td>Technologies 15140-122</td><td>조직 배양</td></tr><tr><td>&nbsp; 푸로마이신&nbsp; &nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td>조직 배양</td></tr><tr><td>&nbsp; 피브로넥틴&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>조직 배양</td></tr><tr><td>CoolCell LX 무알코올 제어 속도 세포 동결 상자</td><td>Bioexpress</td><td>D-3508)</td><td>조직 배양</td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 접착제&nbsp;</td><td>록타이트</td><td>록타이트 no. 495</td><td>수술 및 입체 사출</td></tr><tr><td>플라스틱 파라핀 필름&nbsp;</td><td>VWR</td><td>파라필름&reg;</td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>나노 인젝터</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>유리 전극</td><td>Drummond</td><td>3-000-203G</td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>핸드 헬드 드릴</td><td>OSADA</td><td>Exl-M40</td><td>수술 및 입위 사출</td></tr><tr><td>드릴 용 버</td><td>Fine Scientific</td><td>19007-05; 19007-07)</td> <td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>살균 목욕</td><td>FST</td><td>18000-45, 핫 비드 살균기</td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>이소 플루란 챔버 / 마스크</td><td>하이랜드 의료 장비</td><td>564-0427, 이소 플루란 기화기, O2 유량계, 갱 밸브가있는 HME 109 탁상용 마취 기계; 564-0852, 유도 챔버 16X7X7.5cm</td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr>팔 <td>Zeiss</td><td></td><td>수술 및 입위 주사</td>가있는<td>3D 내시경</td></tr><tr><td>광섬유 광</td><td></td><td></td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>Betadine&nbsp;</td><td></td><td></td><td>수술 및 입위주사</td></tr><tr><td>70%(V/V) 이소프로필 알코올</td><td></td><td></td><td>수술 및 입위주사</td></tr><tr><td>포비돈-요오드 준비 패드</td><td>dynarex</td><td>1108</td><td>수술 및 입방주사</td></tr><tr><td>NaCl 0.9%(주사, USP, 918610)</td><td></td><td></td><td>수술 및 입정주사</td></tr><tr><td>CYCLOSPORINE(INJECTION, USP)</td><td></td><td></td><td>수술 및 입체 주사</td></tr><tr><td>Buprenex (주사) 부프레노르핀 (0.03 &mu; g per g 설치류)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>수술 및 입체 주사</td></tr><tr><td>안과 연고&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>수술 및 입체 주사</td></tr><tr><td>Surgifoam</td><td>Ethicon</td><td></td><td>수술 및 입체 주사</td></tr><tr><td>그립 치과 시멘트</td><td>Dentsply</td><td>#675571, 675572</td><td>수술 및 입체 주사</td></tr><tr><td>인스턴트 SuperGlue&nbsp;</td><td>NDindustries</td><td></td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>LOCTITE 4041</td><td></td><td></td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>METABOND</td><td>C & B</td><td></td><td>수술 및 입체 주사</td></tr><tr><td>번호 0 커버 유리</td><td>Fisher</td><td></td><td>수술 및 입체 주사</td></tr><tr><td>입위 프레임&nbsp;</td><td>Kopf</td><td></td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>직장 프로브 및 발열 패드</td><td>FHC</td><td>40-90-8D, DC 온도 컨트롤러, 40-90-2-06, 6.5X9.5cm 가열 패드 40-90-5D-02, 직장 서미스터 프로브</td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr>이미징 <td>Thorlabs</td><td></td><td>수술 및 입위 주사</td>미네랄 오일 Fisher S55667 수술<td>용 광학 브레드 보드</td></tr> 및 <tr><td></td><td></td><td></td><td> 입체 주사</td></tr><tr><td>Kwik-Cast (실리콘 엘라스토머)</td><td>세계 정밀 기기</td><td></td><td>수술 및 입체 주사</td></tr><tr><td>봉합사&nbsp; &nbsp;</td><td>에티콘</td><td>18' ', 1667, 4-0</td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>가위</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91500-09, 15018-10</td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-30; # 55, 11295-51; Grafe, 11050-10</td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>학생 Halsted-Mosquito 지혈</td> Fine <td>Scientific Tools</td><td>91308-12</td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>소액 혈관 소작 장치 키트</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18000-00</td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>핫 비드 살균기</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18000-45</td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>실리콘 매트가 있는 악기 케이스</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20311-21</td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>실리콘 매트가 있는 플라스틱 살균 용기</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20810-01</td><td>수술 및 입위 주사</td></tr><tr><td>in vivo 이미징을 위한 2P 고정 스테이지 형광 스코프</td><td>Olympus</td><td>FV1200 MPE</td><td>생체 내 이미징</td></tr><tr><td>다광자 레이저</td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td>생체 내 이미징</td></tr><tr><td>그린 레이저</td><td>Olympus</td><td>473nm 레이저</td><td>생체 내 이미징</td></tr><tr><td>xy 번역 기반</td><td>Scientifica</td><td>MMBP</td><td>생체 내 이미징</td></tr><tr><td>YFP 및 CFP용 FRET 필터 큐브</td><td>Olympus</td><td></td><td>생체 내 이미징</td></tr><tr><td>10x 및 40x 침수 대물렌즈</td><td>Olympus</td><td></td><td>생체 내 이미징</td></tr><tr><td>에어 테이블</td><td>Newport</td><td></td><td>in vivo 이미징</td></tr><tr><td>맞춤형 광밀폐 케이지</td><td>Thorlab</td><td></td><td>in vivo 이미징</td></tr></tbody></table>

건설 셀 기반의 신경 전달 물질의 광학 검출을위한 신경 전달 물질 형광 엔지니어링 기자 (cnifers)<em&gt; 생체</em

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

세포 기반 신경 전달 형광 설계 기자 (CNiFERs)는 신경 과학자 광학적 생체의 뇌에서 신경 전달 물질의 방출을 검출하기위한 새로운 수단을 제공한다. 특정 CNiFER 안정적 특정 G 단백질 결합 수용체, G의 Q에 커플 / 11 G 단백질 및 FRET 기반 칼슘) 검출기 (, TN-XXL를 표현하는 인간 배아 신장 세포에서 생성됩니다. 수용체의 활성화는 FRET 신호의 증가를 이끈다. CNiFER 클론은 도파민에 대한 D2R, 예를 들어, 특정 신경 전달 물질의 고유 수용체를 이용하기 때문에 CNiFERs는 nM의 감도와 초 시간 응답이 있습니다. CNiFERs 직접 뇌에 이식 생체 내에서 볼륨 전송을 측정하기에 이상적 미만 백 ㎛의 공간 해상도와 신경 전달 물질 방출을 감지 할 수 있도록하고 있습니다. CNiFERs 또한 VI 잠재적 교차 - 반응성에 대한 다른 약물을 스크리닝하는데 사용될 수있다VO. 우리는 최근의 GPCR에게 G I / O G 단백질에 그 부부를 포함 CNiFERs의 제품군을 확장했다. CNiFERs은 아세틸 콜린 (ACH), 도파민 (DA)과 노르 에피네프린 (NE)를 검출 할 수 있습니다. 어떤 GPCR이 CNiFER 소설을 생성하는데 사용될 수 있음을 감안할 때 대략 인간 게놈 800 GPCRs에 있다는 것을 우리는 설계, 실현 및 CNiFER 임의의 타입을 테스트하기 위해 여기 일반적인 방법을 설명한다.

특정 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)와 유전자 코드 [칼슘 2 +] 센서, TN-XXL하십시오 CNiFER 안정적 적어도 두 개의 단백질을 발현하도록 유전자 조작 된 인간 배아 신장 (HEK293) 세포에서 파생됩니다. TN-XXL은 칼슘 이온 -6,15-의 질문에 답변 시안과 노란색 형광 단백질 각각 eCFP과 황수정, 사이의 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 겪는다. 내생 G q를 G 단백질에 그 부부의 GPCR의 활성화는 [칼슘 2 +]를 PLC / IP 3 경로를 통해 TNXXL 칼슘 검출기에서 FRET의 증가로 이어지는 (그림 1) 세포질의 증가를 발생시킨다. <img alt="그...

우리는 체적 신경 전달 물질 방출의 광학 검출을위한 셀 기반의 신경 전달 물질의 형광 설계 기자 (CNiFERs)를 만들 수있는 프로토콜을 제시한다.

건설 셀 기반의 신경 전달 물질의 광학 검출을위한 신경 전달 물질 형광 엔지니어링 기자 (CNiFERs)<em&gt; 생체</em

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

이 영상의 전반적인 목표는 생체 내(in vivo)에서 특정 신경전달물질의 방출을 광학적으로 모니터링하는 데 사용할 수 있는 세포 기반 신경전달물질 형광 리포터(Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Reporters), 즉 CNiFERs의 구축 및 테스트 방법론을 설명하는 것입니다. 이 방법은 뇌 내 신경조절물질의 방출 시점 및 방출량과 관련된 신경과학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 GPCS를 통해 신호를 전달하는 모든 유형의 신경전달물질 또는 신경조절물질에 맞게 조정하여 적용할 수 있다는 점입니다.이 방법의 지역적 시연은 유용합니다. CNiFERs의 체내 주입 및 후속 이미징은 기술적으로 까다롭습니다. 이 절차를 시작하려면 T-25 플라스크에 담긴 전면 기반 칼슘 검출기와 키메라 g 단백질을 포함하는 HEK293 세포를 확인하십시오.그 다음, 37°C, 5% CO2 조건의 습윤 배양기에서 세포가 약 50% 합쳐질(confluent) 때까지 배양합니다. 이후 T-25 플라스크에서 배지를 흡입하여 제거합니다. 렌티바이러스 배지 혼합물 2 mL를 첨가하고, T-25 플라스크를 37°C, 5% CO2 조건에서 배양합니다.다음 날, 1 mL의 trypsin을 첨가하여 감염된 HEK293 세포를 수확합니다. 그다음, 세포 펠릿을 5 mL의 HEK293 성장 배지에 다시 현탁합니다. 냉동 보관용으로 T-75 플라스크에 세포 1 mL를 접종하고, FACS 분석용으로 T-25 플라스크에 세포 1.5 mL를 접종합니다.감염된 세포를 테스트하기 위한 10점 작용제 곡선을 작성하려면, 피브로넥틴이 코팅된 96-웰 플레이트의 처음 두 행에 웰당 100 µL의 세포 현탁액을 분주하십시오. 그런 다음, T-25 플라스크, T-75 플라스크 및 96-웰 플레이트에서 배양 중인 HEK293 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 약 90% 합쳐질 때까지 1~2일 동안 배양하십시오. FACS 분석 전, 예측된 EC 50을 포함하는 10가지 서로 다른 작용제 농도의 약물 플레이트를 준비하여 GPCR의 기능적 발현을 결정하십시오.연쇄 희석법을 사용하여 다양한 농도의 작용제를 준비하고, 약물 농도를 기록할 템플릿을 생성하십시오. 다음으로, 플레이트 리더의 온도를 37 °C로 설정하십시오. 그 후, FRET 측정 및 용액 전이를 수행하도록 96-웰 형광 플레이트 리더를 프로그래밍하십시오.유전적으로 부호화된 FRET 기반 칼슘 센서인 TNXXL을 사용하여 FRET을 측정하려면, 여기 파장을 436 ± 4.5 nm로 설정하십시오. 그런 다음 ECFP와 citrine에 맞는 방출 필터 및 컷오프 필터를 설정하십시오. 다음으로, 플레이트 리더가 180초 동안 총 4초 간격으로 방출광을 측정하도록 프로그래밍하십시오.100 µL 플레이트 부피, 150 µL 피펫 높이, 그리고 3배 희석 화합물 플레이트로부터 50 µL의 약물 전달 옵션을 선택하십시오. 약물 전달 시점을 30초로 설정하십시오. 그 후, A행과 B행에서 배지를 흡입하고, 약 90% 밀도로 합쳐진(confluent) 96-well 스니퍼 플레이트에 100 µL의 ACSF를 추가하십시오.그런 다음, 약물이 3배 희석된 플레이트와 96-웰 스니퍼 플레이트를 플레이트 리더기에 로드합니다. 프로그램을 시작하기 전, 플레이트가 37 °C에서 평형 상태에 도달하도록 30분 동안 둡니다. 플레이트 리더기 작동이 끝나면, 형광 리더기 측정값을 텍스트 파일로 내보냅니다.그런 다음, 이 파일을 이전에 만들어 둔 스프레드시트 템플릿으로 가져옵니다. 해당 템플릿은 형광 강도를 자극 전 기저선으로 표준화하고, 각 작용제 농도에 대한 최대 FRET 비율을 계산하며, 용량 반응 곡선을 생성합니다. 유리 모세관을 수직 전극 추출기에 장착하여 CNiFER 주입 피펫을 준비합니다. 핀셋을 사용하여 전극의 팁을 약 40 µm의 직경으로 부러뜨립니다.마취된 마우스의 이전에 형성된 2x3 mm 크기의 얇은 두개골 창 위에 ACSF를 적신 스펀지를 올려두어, 세포 주입 준비 동안 습윤 상태를 유지합니다. 다음으로, T-75 플라스크에서 약 80%의 합류도(confluency)까지 배양된 CNiFER 클론을 수확합니다. 배지를 흡입하여 제거하고, 멸균 PBS로 세포를 세척합니다.PBS를 제거하고, 10 milliliters의 ACFS를 사용하여 플라스크 바닥에서 세포를 떼어냅니다. 그 다음, 세포 덩어리를 분리하기 위해 세포를 트리튜레이션(triturate)합니다. 세포 배양용 원심분리기에서 2분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거하고, 펠렛을 100 µL의 ACSF에 재현탁합니다. 이어서 1400 ×g에서 30초 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하여 ACSF로 덮인 펠렛만 남깁니다. 그 후, 주입 피펫을 미네랄 오일로 다시 채웁니다.피펫을 나노 인젝터에 장착합니다. 마우스 준비물 근처의 플라스틱 파라핀 필름 조각 위에 CNiFER 세포 현탁액 5 µL를 분주합니다. 끌어당겨진 피펫으로 CNiFER 세포를 흡입합니다.이제 피펫을 대상 x 및 y 좌표로 이동합니다. 피펫을 내려 이전에 준비한 얇게 깎인 두개골을 관통합니다. 두개골 표면 아래 약 200~400 µm 지점인 피질의 2층 및 3층까지 계속 진입합니다.나노 인젝터를 사용하여 가장 깊은 부위에 4.6 nanoliters의 CNiFER 세포를 주입합니다. 오일과 세포 계면에서의 움직임을 관찰하십시오. 그 후, 세포가 분산될 때까지 5분 동안 기다립니다.피펫을 약 100 micrometers 정도 뒤로 뺀 후 CNiFER 세포 4.6 nanoliters를 추가로 주입하고 다시 5분 동안 대기합니다. 그 후, CNiFER의 역류를 방지하기 위해 피펫을 천천히 조심스럽게 제거합니다. 이 과정에서 머리가 고정된 마우스가 있는 이미징 플랫폼을 이광자 이미징 현미경의 10x 수침 렌즈 아래에 배치합니다.505 nanometers의 다이크로익 미러와 ECFP 측정을 위한 460 nanometers에서 500 nanometers 범위의 밴드 패스 필터, 그리고 citrine 측정을 위한 520 nanometers에서 560 nanometers 범위의 밴드 패스 필터가 포함된 fret 이미징용 필터 큐브를 삽입하십시오. 그다음, 얇게 갈아낸 두개골 창이 있는 웰에 ACSF를 추가하고 10x 수침 대물렌즈를 ACSF 내부로 내립니다. 접안렌즈를 수은 램프 및 GFP 필터 큐브와 함께 사용하여 CNiFERs의 위치를 찾으십시오.이제 40x 수침 대물렌즈로 교체하십시오. 다음으로, 이광자 이미징에 적합한 광로를 선택하십시오. 근적외선 펨토초 펄스 레이저를 켭니다.파장을 820 nanometers로 선택하고, 전력 설정을 5-15%로 설정하십시오. PMT 1과 PMT 2의 전압을 PMT에 따라 일반적으로 500-1000 volts의 하위 최대값으로 설정하십시오. 그런 다음, 각 채널의 gain을 1로 설정하고 대물렌즈의 z 위치를 영점 조절하십시오. 대물렌즈를 피질 표면에서 약 100-200 micrometers 낮춘 다음, xy 스캔을 시작하십시오.CNiFER 형광의 신호 대 잡음비를 최적화하기 위해 각 채널의 레이저 출력, 게인 및 pmt 전압을 조정하십시오. 다음으로, 소프트웨어를 사용하여 CNiFER 세포가 포함된 영역과 배경 영역으로 이미징 범위를 제한하십시오. 적절한 신호 대 잡음비를 얻기 위해 2회 평균화하는 cowman 라인을 선택하고, 픽셀당 4 µs의 속도로 3~1 Hz의 스캔 속도를 사용하십시오.그 후, CNiFER 세포 주변에 ROI를 설정합니다. 평면당 약 3~4개의 세포가 포함되도록 합니다. ROI 평균 강도의 실시간 분석을 설정합니다.그 다음, 시간에 따른 CNiFER 형광을 모니터링하기 위해 획득을 시작하고, fret을 모니터링하면서 전기 자극 또는 행동 실험을 시작합니다. 이 예시에서는 용액 전달 시스템이 장착된 플레이트 리더를 사용하여 D2R CNiFER fret의 반응을 측정하였습니다. 이 그래프는 D2 CNiFER에 도파민을 처리하는 동안의 fret 반응을 보여줍니다.도파민에 의해 ECFP 방출은 감소하고 citrine 방출은 증가한다는 점에 유의하십시오. 그리고 여기 해당 FRET 비율의 그래프가 있습니다. 여기에 도파민과 노르에피네프린에 대한 D2 CNiFERs의 반응을 나타내는 용량-반응 곡선이 표시되어 있습니다.또한, D2R이 결여된 반응성 제어 CNiFERs가 제시되어 있습니다. 이 막대 그래프는 50 nM 및 1 µM 농도의 다른 신경전달물질 및 조절제에 대한 FRET 비율 반응을 보여줍니다. 여기서 흑질 내 DA 뉴런의 전기적 자극은 D2 CNiFERs의 FRET 비율에 큰 변화를 유도합니다.전기 자극 강도가 증가함에 따라 반응의 진폭이 어떻게 증가하는지 확인하십시오. 자극과 코카인 주입을 결합하면 CNiFER 반응이 증강됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 생체 내(in vivo) 이미징을 위한 CNiFER의 제작, 테스트 및 사용 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.CNiFERs를 제작하는 전 과정에서 무균 기술을 유지하는 것이 필수적인데, 이는 이 세포들이 최종적으로 살아있는 생쥐에 이식될 것이기 때문입니다. CNiFERs의 구현은 신경과학 분야의 연구자들이 G 단백질 결합 수용체를 통해 신호를 전달하는 모든 신경전달물질 또는 신경조절물질의 방출을 광학적으로 측정할 수 있게 하는 중요한 도구를 제공합니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

줄기 세포 요법에 대한 관심이 점점으로, 분자 이미징 기술은 이식 후 모니터링 줄기 세포 행동에 이상적입니다. 루시페라제 리포터 유전자는 세포 생존, 위치 및 생체내의 확산의 비침습, 반복적인 평가를 활성화합니다. 이 동영상은 살아있는 마우스의 hESC 확산을 추적하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

체외에서 인간 배아 줄기 세포의 생체내의 Bioluminescence 리포터 진 영상에

우리는 더 나은 접근 장물과 스펙트럼을 사용하여 수용체의 형광 단백질 태그를 포함한 접근 방법의 조합을 사용하여 니코틴 중독의 메커니즘을 이해하기 위해 CNS의 뉴런의 특정 subtypes의 subcellular 지역 내에서 nicotinic 아세틸콜린 수용체 변화를 quantifying의 소설 기법을 개발했습니다 공촛점 이미징.

만성 니코틴 관리와 마우스 노크 인의 Fluorescently 태그를 Nicotinic 수용체의 분광 공촛점 이미징

출처: Lacin, E., et al. 생체 내 신경 전달 물질의 광학 검출을 위한 세포 기반 신경 전달 물질 형광 공학 리포터(CNiFER)의 구성. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 마우스 피질에 사전 주입된 특수 리포터 세포인 세포 기반 신경 전달 물질 형광 공학 리포터(CNiFER)를 사용하여 생체 내 신경 전달 물질 방출을 이미징하는 기술을 보여줍니다. 2광자 현미경 아래에 위치한 마우스는 형광 방출을 통해 신경 전달 물질 유도 칼슘 신호를 시각화할 수 있습니다. 이 방법은 CNiFER의 G-단백질 결합 수용체에 대한 신경 전달 물질 결합을 활용하여 칼슘 방출 및 형광을 유발하여 신경 전달 물질 활성을 실시간으로 감지합니다.

세포 기반 신경 전달 물질 형광 조작 리포터를 사용한 이미징 신경 전달 물질 방출

작은 투명 몸, 잘 문서화 neuroanatomy 및 의무 유전자 기술과 시약의...

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

여기서 우리는 발광 생물 기자를 사용하는 방법을 -imaging 소설 칼슘 2+ 제시한다. 이 방법은 칼슘 결합과 광 자극에 대한 필요성을 제거, 발광 구조물의 융합 GFP-쿼린을 이용한다. 중요한 것은이 방법은 깊은 뇌 구조와 높은 시간 해상도로 긴 연속 촬영, 접근을 허용한다.

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

이 새로 개발된 된 형광 기반 기술을 통해 자유롭게 이동 하는 쥐 실시간 및 높은 시간 해상도 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 circadian 시계 유전자의 녹음 방송을의 장기 모니터링 됩니다.

Vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 Suprachiasmatic 핵에서 Circadian 시계 유전자 발현의 모니터링

여기 이미지 칼슘 murine neuromuscular 접속점에 개별 셀 종류의 인구에 있는 신호 프로토콜 선물이.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

우리는 형광 칼슘 화상 진찰을 계면 혼성화에서 결합하는 2개의 부분 프로토콜을 제시합니다, 실험자가 단하나 세포 수준에 유전자 발현 단면도와 칼슘 활동의 패턴을 상호 연관시키는 것을 허용하.

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

트랜스제닉 형광 마우스를 사용하여, 살아있는 동물에서 무손상 좌골 신경의 운동 및 감각 축삭 내 엔도솜 및 미토콘드리아의 신호전달의 생체내 축삭 수송을 평가하기 위해 상세한 프로토콜이 기술된다.

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현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

배우세요 CNiFERs를 이용한 생체 내 신경전달물질 광학 검출 기법을 HEK293 세포로 구축하는 방법입니다. 이 기술은 뇌 신경조절물질 동역학 연구에 활용됩니다.

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