총회와 '전단 반지'의 응용 프로그램 : 궤도, 단방향 및 정기 유체 흐름 및 전단 응력에 대한 소설 내피 모델

이 모델의 전반적인 목표는 내피 세포에 대한 체외(In Vitro), 주기적인 유체 흐름 및 전단 응력 연구를 위한 간단하고 경제적인 방법을 만드는 것입니다. 이 방법은 내피 세포 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 주기적 전단은 내피 세포의 모양, 구조 및 기능에 어떤 영향을 미칩니다.

이 기술의 주요 장점은 세포 반응 평가를 위해 상대적으로 넓은 표면적을 제공하는 단순하게 조립된 조직 배양 장치를 사용한다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 의대생인 Mr.Luke White가 될 것입니다. 프리젠 테이션 소프트웨어 발가락을 사용하여 150mm 외부 가장자리 프로파일과 100mm 내부 직경이 150mm 원의 중심에 배치 된 전단 링 구성 템플릿을 만들어이 절차를 시작하십시오.

A4 흰색 용지에 템플릿을 인쇄합니다. 환기가 잘 되는 흄 후드 아래에서 작업하고 장갑을 낀 상태에서 작업: 10mm 메틸렌 클로라이드 피펫을 150mm 유리 페트리 접시에 넣습니다. 염화메틸렌이 대부분의 플라스틱을 용해시키므로 접시가 유리인 것이 중요합니다.

150mm 플라스틱 페트리 접시를 외부 전단 템플릿에 맞춥니다. 회전 도구를 사용하여 3mm 접시 중앙에 3mm 구멍 3개를 뚫습니다. 100mm 접시. 드릴링에서 생성된 플라스틱 부스러기를 제거합니다.

장갑을 낀 손으로 100mm 페트리 접시를 잡고 접시의 상단 가장자리를 뒤집어 약 3초 동안 염화메틸렌 풀에 담그십시오. 여분의 염화메틸렌이 100mm 접시에서 떨어지도록 한 다음 젖은 접시 가장자리를 150mm 접시의 중앙으로 빠르게 옮깁니다. 표시된 템플릿에 100mm 접시를 조심스럽게 정렬합니다.

100mm 접시에 잘 붙도록 150mm 접시를 시계 방향과 시계 반대 방향으로 몇 번 부드럽게 돌립니다. 염화메틸렌이 건조되면 새로 결합된 페트리 접시를 뒤집고 접촉 지점을 주의 깊게 검사합니다. 단단히 밀봉되지 않은 경우 전사 피펫으로 3mm 구멍을 통해 0.5ml의 염화메틸렌을 주입합니다.

접시를 집어 들고 염화메틸렌이 가장자리에 닿을 수 있도록 부드럽게 회전시킵니다. 두 페트리 접시 사이에 단단히 밀봉되었는지 확인한 후 100mm 비드의 실리콘 고무 밀봉제를 적용하여 3mm 접시의 구멍을 밀봉합니다. 평평한 절단 헤드가 장착된 회전 도구를 사용하여 15mm 코노콜 폴리스티렌 조직 배양 튜브의 상단 3cm 부분을 절단하고 튜브 중 최소 1cm를 캡 아래에 남겨둡니다.

절단 헤드의 평평한 면을 사용하여 절단 튜브의 가장자리를 매끄럽고 평평하게 연마합니다. 연삭으로 생성된 플라스틱 부스러기를 제거하십시오. 마커를 사용하여 접시 가장자리에서 약 0.5cm 떨어진 150mm 접시 뚜껑에 잘린 150ml 콘콜 튜브를 추적합니다.

그려진 원 안에 구멍을 뚫고 원 가장자리에서 약 1-2mm 떨어진 곳에 여백을 남깁니다. 뚫린 구멍 위에 잘린 코노콜 튜브 상단을 놓습니다. 전사 피테트를 사용하여 약 1/4 밀리미터 또는 250 마이크로 리터의 염화 메틸렌을 코노콜 튜브의 절단된 가장자리에 바르고 코노콜 튜브를 150mm 뚜껑에 바인딩합니다.

마지막으로 상단 페트리 접시의 내부 가장자리에 1mm 두께의 실리콘 고무 밀봉제를 바르고 150mm 접시에 150mm 뚜껑을 밀봉합니다. 조립된 시어 링의 개략도가 표시됩니다. 파란색은 도금된 내피 세포의 면적을 나타냅니다.

바깥쪽 및 안쪽의 빨간색 화살표는 궤도 셰이커에 배치될 때 전단 링과 전단 링 내부의 매체의 궤도 운동을 나타냅니다. 15ml 코노콜 튜브 포트를 통해 새로 형성된 전단 고리에 약 10mm의 PBS를 피펫팅하여 멸균을 준비합니다. 주위를 빙빙 돌려 전단 링 내부의 이물질을 제거합니다.

파스퇴르 피펫과 진공 흡입기로 PBS를 제거합니다. 모든 이물질이 제거될 때까지 PBS 세척을 반복합니다. 전단 링을 살균하기 위해 70% 에탄올 린스와 UV 조사의 조합이 사용됩니다.

통풍 캡의 나사를 풀고 액세스 포트를 통해 약 10ml의 70% 에탄올을 피펫으로 주입한 다음 캡을 다시 조입니다. 시어 링을 여러 번 회전하고 뒤집어 시어 링 내부가 철저히 세척되었는지 확인합니다. 조직 배양 후드 아래에서 과도한 70% 에탄올을 흡인합니다.

스프레이 병을 사용하여 액세스 포트와 캡에 70% 에탄올을 철저히 분사합니다. 그런 다음 완전히 마를 때까지 조직 배양 후드의 UV 광선 아래에 전단 링과 캡을 놓습니다. 전단 링이 건조되면 캡을 다시 조입니다.

멸균된 전단링은 세포 배양 도금에 사용될 때까지 실온에서 보관하십시오. 전단 응력 연구를 준비하기 위해 먼저 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 멸균된 전단 고리의 플레이트 내피 세포를 사용합니다. 유동 연구를 시작하기 전에 배양이 합류점에 도달하도록 합니다.

세포가 포화도에 도달하면 실험용 전단 고리를 인큐베이터의 하단 선반에 있는 궤도 셰이커에 올려 선반 응력과 진동을 최소화합니다. 정적 제어 그룹 전단 링을 동일한 인큐베이터 내부에 배치합니다. 원하는 전단 응력 적용 기간 동안 셰이커의 전단 링을 그대로 두십시오.

세포층이 원하는 시간 동안 전단에 노출된 후 인큐베이터에서 전단 고리를 제거합니다. 전단 링 뚜껑을 당겨 빼내고 원하는 종말점 분석을 위해 세포 및/또는 배지를 회수합니다. 전단 고리를 연 후 조사자는 여러 가지 방법을 사용하여 분석을 위해 세포와 배지를 수확할 수 있습니다.

보여진 것은 전단 고리에서 인간 CMEC D3 뇌 내피 세포 단층이 나타나는 대표적인 결과이며, 48 시간의주기적인 유체 전단 또는 정적 노출 후, 배양의 정렬이 화살표로 표시된 흐름 방향과 항상 평행하지 않다는 것이 관찰되었습니다. 주기적 전단에 대한 일부 반응은 Rat Retinal Microvascular Endothelial cell mono layers에서 나타납니다. 전단 고리에서 72시간의 주기적인 유체 전단은 베타-액틴 로딩 제어에 비해 혈소판-내피 세포 접착 분자의 상당한 감소를 초래했습니다.

일단 마스터하면 여러 개의 전단 링을 적절하게 수행하면 약 3시간 안에 만들 수 있습니다: 이 절차를 시도하는 동안 내부 접시를 외부 접시와 조심스럽게 정렬하고 그 사이에 단단한 밀봉이 형성되는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 내피 세포에 대한 체외 주기적 유체 흐름 및 전단 응력 연구를 수행하기 위한 간단한 방법으로 전단 링을 구성하고 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 염화메틸렌으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 필요한 단계를 수행하는 동안 항상 흄 후드 아래에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.