총회와 '전단 반지'의 응용 프로그램 : 궤도, 단방향 및 정기 유체 흐름 및 전단 응력에 대한 소설 내피 모델

이 모델의 전반적인 목표는 혈관 내피 세포에 대한 In Vitro 주기적 유체 흐름 및 전단 응력 연구를 위한 간단하고 경제적인 방법을 구축하는 것입니다. 이 방법은 주기적 전단 응력이 내피 세포의 형태, 구조 및 기능에 어떠한 영향을 미치는지와 같은 내피 세포 생리학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 간단하게 조립된 조직 배양 장치를 사용하여 세포 반응 평가를 위한 비교적 넓은 표면적을 제공한다는 점입니다. 본 절차의 시연은 제 연구실의 의대생인 Mr.Luke White가 진행하겠습니다. 프레젠테이션 소프트웨어를 사용하여 외곽 가장자리 프로필이 150 millimeter이고 150 millimeter 원의 중심에 내부 직경 100 millimeter인 원이 배치된 전단 링 제작 템플릿을 만드는 것으로 이 절차를 시작하십시오.

템플릿을 A4 흰색 용지에 출력하십시오. 환기가 잘 되는 흄 후드 내에서 장갑을 착용한 상태로 150 millimeter 유리 페트리 접시에 methylene chloride 10 millimeter를 피펫으로 분주합니다. methylene chloride는 대부분의 플라스틱을 용해시키므로 반드시 유리 접시를 사용해야 합니다.

150 millimeter 플라스틱 페트리 접시를 외부 전단 템플릿 위에 정렬합니다. 로터리 툴을 사용하여 100 millimeter 접시의 중앙에 3 millimeter 구멍 3개를 뚫습니다. 드릴링 과정에서 발생한 플라스틱 파편을 모두 제거합니다.

장갑을 낀 손으로 100 millimeter 페트리 접시를 잡고, 접시의 상단 가장자리를 메틸렌 클로라이드 액체에 약 3초 동안 거꾸로 담급니다. 100 millimeter 접시에 묻은 과잉 메틸렌 클로라이드를 떨어뜨린 후, 젖은 접시 가장자리를 150 millimeter 접시의 중앙으로 빠르게 옮깁니다. 표시된 템플릿에 맞춰 100 millimeter 접시를 조심스럽게 정렬합니다.

150 밀리미터 접시에 잘 접착되도록 100 밀리미터 접시를 시계 방향과 반시계 방향으로 몇 번 부드럽게 회전시킵니다. 메틸렌 클로라이드가 건조되면, 새로 접합된 페트리 접시를 뒤집어 접촉 지점을 주의 깊게 검사합니다. 밀봉이 완전히 이루어지지 않은 경우, 트랜스퍼 피펫을 사용하여 3 밀리미터 구멍을 통해 0.5 밀리리터의 메틸렌 클로라이드를 주입합니다.

디쉬를 들어 올려 살짝 회전시켜 메틸렌 클로라이드가 가장자리까지 닿게 합니다. 두 개의 페트리 디쉬 사이에 밀폐가 확실히 되었는지 확인한 후, 100 millimeter 디쉬의 구멍에 3 millimeter 두께의 실리콘 고무 밀봉제를 도포하여 밀봉합니다. 평면 커팅 헤드가 장착된 로터리 툴을 사용하여 15 millimeter 코노콜 폴리스티렌 조직 배양 튜브의 상단 3 centimeter 부분을 잘라내되, 캡 아래로 최소 1 centimeter의 튜브가 남도록 합니다.

커팅 헤드의 평평한 면을 사용하여 절단된 튜브의 가장자리가 매끄럽고 평평해질 때까지 연마하십시오. 연마 과정에서 발생한 플라스틱 파편을 제거하십시오. 마커를 사용하여 절단된 15 milliliter 원추형 튜브의 외형을 150 millimeter 디쉬 뚜껑의 가장자리에서 약 0.5 centimeters 떨어진 곳에 따라 그리십시오.

그려진 원 내부에 구멍을 뚫되, 원의 가장자리에서 약 1~2mm의 여백을 둡니다. 절단된 코노콜(conocole) 튜브 상단을 뚫린 구멍 위에 놓습니다. 트랜스퍼 피펫을 사용하여 절단된 코노콜 튜브 가장자리에 methylene chloride 약 0.25mL 또는 250µL를 도포하여 코노콜 튜브를 150mm 뚜껑에 접착시킵니다.

마지막으로, 상단 페트리 접시의 안쪽 가장자리를 따라 1 mm 두께의 실리콘 고무 밀봉제를 도포하여 150 mm 뚜껑을 150 mm 접시에 밀봉합니다. 조립된 실링 링의 모식도가 표시되어 있습니다. 파란색은 내피 세포가 도말된 영역을 나타냅니다.

외부 및 내부의 빨간색 화살표는 오비탈 셰이커 위에 놓였을 때 전단 링과 전단 링 내부 배지의 궤도 운동을 나타냅니다. 15 milliliter 원심 분리 튜브 포트를 통해 새로 제작된 전단 링에 PBS 약 10 millimeters를 피펫팅하여 멸균을 준비합니다. 전단 링 내부의 잔해물을 제거하기 위해 가볍게 흔들어 섞어줍니다.

파스퇴르 피펫과 진공 흡입기를 사용하여 PBS를 제거합니다. 모든 잔해물이 제거될 때까지 PBS 세척을 반복합니다. 전단 링을 멸균하기 위해 70% ethanol 린스와 UV 조사를 병행하여 사용합니다.

통기성 캡을 돌려 열고, 주입구를 통해 70% ethanol 약 10 milliliters를 피펫으로 넣은 후 캡을 다시 조입니다. 시어 링(sear ring)을 여러 번 회전시키고 뒤집어 시어 링 내부가 충분히 세척되도록 합니다. 조직 배양 후드 아래에서 과량의 70% ethanol을 흡입하여 제거합니다.

분무기를 사용하여 액세스 포트와 캡에 70% ethanol을 충분히 뿌립니다. 다음으로, 조직 배양 후드 내에서 쉐어 링과 캡이 완전히 마를 때까지 UV 조사 장치 아래에 둡니다. 쉐어 링이 마르면 캡을 다시 돌려 잠급니다.

멸균된 전단 링(shear rings)은 세포 배양 플레이팅에 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오. 전단 응력 연구를 준비하려면, 먼저 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 멸균된 전단 링에 혈관 내피 세포를 플레이팅하십시오. 유동 연구를 시작하기 전에 배양 세포가 합류(confluency) 상태에 도달하도록 하십시오.

세포가 컨플루언시(confluency)에 도달하면, 선반 응력과 진동을 최소화하기 위해 인큐베이터 하단 선반에 배치된 오비탈 셰이커(orbital shaker) 위에 실험용 전단 링(shear rings)을 놓습니다. 정적 대조군 전단 링은 동일한 인큐베이터 내부에 배치합니다. 전단 응력을 가하고자 하는 원하는 시간 동안 전단 링을 셰이커 위에 둡니다.

세포층을 원하는 시간 동안 전단력에 노출시킨 후, 인큐베이터에서 전단 링을 꺼냅니다. 전단 링 덮개를 제거하고 원하는 종점 분석을 위해 세포 및 배지를 회수합니다. 전단 링을 개봉한 후 연구자는 여러 가지 방법을 사용하여 분석용 세포와 배지를 수확할 수 있음을 유의하십시오.

48시간 동안의 주기적인 유체 전단 응력 또는 정적 노출 후, 전단 링(shear ring) 내 인간 CMEC D3 뇌 혈관 내피 세포 단층의 외형에 대한 대표적인 결과가 제시되어 있습니다. 배양 세포의 정렬이 화살표로 표시된 흐름 방향과 항상 평행한 것은 아님이 관찰되었습니다. 쥐 망막 미세혈관 내피 세포 단층에서의 주기적 전단 응력에 대한 일부 반응이 나타나 있습니다. 전단 링에서 72시간 동안 주기적인 유체 전단 응력을 가한 결과, Beta-actin 로딩 컨트롤 대비 Platelet-endothelial cell adhesion molecule이 유의하게 감소하였습니다.

숙련된 후에는 적절히 수행할 경우 약 3시간 만에 여러 개의 전단 링(Shear Ring)을 제작할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 내부 디쉬와 외부 디쉬를 세심하게 정렬하여 두 디쉬 사이에 밀폐된 씰이 형성되도록 하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 내피세포에 대한 인비트로(In Vitro) 주기적 유체 흐름 및 전단 응력 연구를 수행하기 위한 간단한 방법으로서 전단 링을 제작하고 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 염화메틸렌을 사용하는 작업은 위험할 수 있으므로, 해당 단계가 필요한 작업을 수행할 때는 항상 흄 후드 내에서 작업하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.