Name: 총회와 전단 반지의 응용 프로그램 : 궤도, 단방향 및 정기 유체 흐름 및 전단 응력에 대한 소설 내피 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 배우세요 내피세포에 주기적 전단응력을 가하는 간단하고 경제적인 전단 반지 모델을 구축하는 방법을. 이 기법은 큰 표면적에서 세포 반응을 평가하여 혈관 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 크리스토퍼 씨 응우 엔, 아론 헌터와 슈 리브 포트의 Jumpstart, SMART 및 Biostart 교육 프로그램의 지원뿐만 아니라, 생물 물리학, 슈 리브 포트, LA의 100 주년 대학 루이지애나의 부서를 인정하고 싶습니다.

150mm 직경 전단 반지의 1. 건설 (그림 1) 주 : 전단 링은 외측 페트리 접시 크기를 변화 상이한 총 표면적 세포 수율 장치에서 생성 및 전단력의 범위를 개발하여 다양한 크기를 생성하도록 구성 될 수있다. 이 보고서는 98cm 2 (그림 2)의 전체 면적에 대한 내부 100mm 접시와 결합 된 150mm 요리에 대해 설명합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig1.jpg" /> 도 1 전단 링 조립체. 도면의 상부에는 부분적으로 조립 된 전단 고리를 나타낸다. 단단한 시일이 완전 내외 식기 사이에 형성되지 않은 경우 전송 피펫과 3mm의 구멍을 염화 메틸렌 0.5 ml에 주입한다. 전단 고리 내측 주위 EDG 실리콘 고무 접착제의 두께 1㎜ 비드를 적용하여 정지 밀봉전단 링 상단의 전자. 도면의 하단 부분은 조립 전단 고리를 나타낸다. 청색 도금 내피 세포의 영역을 나타낸다. 외부 및 내부 빨간색 화살표가 궤도 쉐이커에 배치 된 전단 링 내부의 전단 링과 미디어의 궤도 운동을 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig2.jpg" /> (안 비율로 도시)는 150mm 전단 링 그림 2. 표면 측정. 최고 패널이 궤도 회전에 응답하여 외부 링으로 유체의 원심 이동을 보여줍니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol><li> 를 생성하여 전단 링 건설 템플릿 만들기150 밀리 원의 중심에 배치 된 100mm 내경 프레젠테이션 소프트웨어 150mm 외연 단면도. A4 흰색 용지에 템플릿을 인쇄합니다. </li><li> 피펫 150 밀리 유리 페트리 접시에 염화 메틸렌 (디클로로 메탄)의 10 ㎖. 염화 메틸렌 대부분 플라스틱 가용화 및 플라스틱 부품 가입 여기서 사용 된 바와 같이 접시 유리하지 폴리스티렌 (또는 다른 비닐 수지) 인 것이 중요하다. 주의 : 적절한 후드 환기 모든 건설 용 장갑을 사용하십시오. 메틸렌 클로라이드를 접촉 자극이며 간독성이다. </li><li> 외부 전단 링 템플릿 상에 150mm 플라스틱 페트리 접시를 맞 춥니 다. </li><li> 회전 공구를 사용하여 100mm 접시의 중심에서 3mm의 구멍을 뚫는다. 시추에서 생산되는 모든 플라스틱 부스러기를 제거합니다. </li><li> 장갑을 낀 손으로 잡고 있지만, 반전 약 3 초 동안 메틸렌 클로라이드 풀에 이전 단계에서 100mm 페트리 접시의 위쪽 가장자리를 찍어. </li><li> 트랜스선봉은 신중하게 표시된 템플릿 상에 100mm 접시를 정렬하는 150mm 접시의 중심 상에 100mm 접시 가장자리 다운 &quot;젖은&quot;. 메틸렌 클로라이드는 100mm와 150mm 요리 접합 플라스틱 융합된다. 조심스럽게 100mm 접시를 시계 방향으로 회전하고 몇 번 반 시계 방향으로 150 밀리미터 접시에 우수한 접착 성을 보장하기 위해. 참고 : 외부 접시의 중심에 내부 접시의 적절한 정렬을 보장하기 위해 상당한주의를 기울입니다. 편심 정렬은 전단 링에서 서로 다른 위치에서 전단 응력의 변화가 발생할 수 있습니다. 염화 메틸렌 실수로 100mm 접시의 위치 동안 150mm 페트리 접시의 바깥 쪽 트랙 부분에 물방울을 허용하지주의하십시오. 이는 유동 교란을 일으킬 수있는 표면에 요철을 만들어 세포가 성장되는 바닥면에 플라스틱을 용융한다. </li><li> 염화 메틸렌 건조되면, 이상 새로 결합 된 배양 접시를 뒤집어 신중을 보장하기 위하여 접촉 포인트를 검사꽉 도장은이 배양 접시 사이에 형성되고있다. </li><li> 단단한 시일이 완전히 형성되지 않으면, 전송 피펫과 3mm의 구멍을 염화 메틸렌 0.5 ml에 주입. 접시를 들고 부드럽게는 염화 메틸렌 가장자리에 도달 할 수 있도록 회전합니다. 주 : 너무 빨리 회전하면, 염화 메틸렌 세포가 성장할 표면 변형과 전단 파괴 링은 150mm 접시의 외측 부분으로 유출 할 수있다. 누출 전단 링은 폐기해야합니다. </li><li> 실리콘 고무 시일의 3mm의 비드를 적용하여 100mm 접시 구멍을 봉쇄. </li><li> 평평한 절삭 헤드가 장착 된 회전 공구를 사용하여, 캡 아래 튜브의 적어도 1cm 떠나는 15 ml의 폴리스티렌 원뿔형 조직 배양 튜브의 상부 3cm 부를 잘라. 밋밋은 절삭 헤드의 평탄면을 사용까지 절단 튜브의 에지 연마. 연마에 의해 생성 된 모든 플라스틱 부스러기를 제거합니다. </li><li> 상에 차단 15 ml의에게 원뿔 튜브를 추적약 0.5 cm 떨어진 접시 가장자리로부터 마커와 150mm 접시 뚜껑. 약 원의 가장자리 1~2mm을 여백을 남겨 그려진 원 안에 구멍을 드릴. </li><li> 드릴 구멍을 통해 차단 원뿔 튜브 탑을 배치합니다. 전달 피펫을 사용하여, 150mm의 뚜껑 원뿔형 튜브에 결합하는 원뿔형 튜브의 절단 모서리에 염화 메틸렌 250 μL를 적용한다. </li><li> 상단 페트리 접시의 내주 주위에 실리콘 고무 밀봉 제의 1 mm 두께의 비드를 적용하여 150mm 접시 상 150mm 뚜껑을 밀봉. </li></ol> 전단 반지의 2. 살균 <ol><li> 피펫 인산 약 10 ㎖를 15 ㎖의 원뿔형 튜브 포트를 통해 새로 형성된 전단 링에 완충 식염수. 전단 링 내부의 이물질을 제거하기 위해 주위에 소용돌이 친다. 파스퇴르 피펫 / 진공 흡입기와 인산염 완충 생리 식염수를 제거합니다. </li><li> 이물질이 제거 될 때까지 이전 단계를 반복합니다. </li><li> steri하려면리제 전단 링, UV 조사와 70 % 에탄올 세정을 조합하여 사용한다. <ol><li> 액세스 포트를 통해 배출 캡, 피펫 70 % 에탄올의 약 10 ml의 나사를 풀고, 그리고 다시 뚜껑을 조입니다. 회전 전단 링의 내부를 철저히 세척 보장, 전단 링을 여러 번 뒤집어. </li><li> 흄 후드에서 초과 70 % 에탄올을 대기음. 스프레이 병으로, 철저하게 70 % 에탄올로 모자와 액세스 포트를 스프레이. </li><li> 완전히 건조 될 때까지 조직 문화 후드 내에서 자외선 아래에서 전단 링과 캡을 놓습니다. </li></ol></li><li> 세포 배양 도금에 사용되는 때까지 건조한 후, 실온에서 다시 모자 및 저장 멸균 전단 링을 조입니다. </li></ol> 3. 전단 응력 연구 <ol><li> 형질 내피 세포주 4 분할 비 : 통상적으로 (1)를 이용한 표준 세포 배양 프로토콜 다음 멸균 전단 링 내피 세포 접시. 참고 : 쥐 망막 microvascular 내피 세포 상업적으로 수득 하였다. 인간의 두뇌 내피 세포 (hCMEC / D3) 세포는 박사 피에르 - 올리버 Couraud (INSERM, 프랑스)에서 관대 한 선물로 제공하고 완전한 내피 기초 매체 (EBM)에서 배양 하였다. </li><li> 문화가 이전의 흐름 연구의 시작에 합류에 도달 할 수 있습니다. 조직 배양 배지 30 ㎖ (10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 암포 테리 가진 둘 베코 변형 이글 배지)를 사용한다. 3 일마다 세포 배양 배지를 바꾸고 7.5 % CO 2 및 92.5 %의 실내 공기와 37 ℃에서 세포를 유지한다. </li><li> 인큐베이터에서 궤도 통을 놓습니다. 참고 : 궤도 셰이커는 일반적으로 무거운 (&gt; 10kg). 선반 응력과 진동을 최소화하기 위해 인큐베이터의 바닥 선반에 궤도 통을 놓습니다. </li><li> 궤도 통에 실험 전단 반지를 놓습니다. 같은 인큐베이터 안에 정적 대조군 전단 반지를 놓습니다. </li><li> 쉬 내에서 최대 전단 응력을 추정방정식과 귀 반지 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq1.jpg" /> 어디에 <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq2.jpg" /> 진탕 기의 회전 반경 (cm 단위)이며 <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq3.jpg" /> 매체의 점도 (포이즈 단위)이며 <img alt="식 (4)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq4.jpg" /> (g / ㎖)에서, 매체의 밀도, <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq5.jpg" /> (24) (회전 / 초)에서의 회전 주파수이다. </li><li> 전단 응력 응용 프로그램 (예를 들어, 72 시간)의 원하는 기간 동안 통에 전단 링을 떠나, 원하는 회전 수 (예를 들어, 90 RPM)에 궤도 통에 회전 설정을 시작합니다. 참고 : 인큐베이터 온도가 37 ° C는 실험 기간 내내 유지하기 위해 초기에 모니터링해야하므로 궤도 셰이커가, 열을 생성 할 수 있습니다. 또한,이야듣고 반지는 회전 인큐베이터 내에 배치 후 환경 챔버 (예를 들어, 모듈 형 인큐베이터 실) 및로 전송할 수 있습니다. </li><li> 셀 층을 원하는 시간에 대한 전단 인큐베이터에서 전단 링을 제거에 노출 된 후. 전단 링 뚜껑을 당겨 원하는 엔드 포인트 분석 (예를 들어, 웨스턴 블로 팅, 형광 활성 세포 정렬 등) (25) 검사에 대한 세포 및 / 또는 미디어를 검색 할 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

J. 위니 윤은 아네트 Funicello 재단에서 연구비가 있습니다. J. 스티븐 알렉산더는 신경과, LSUHSC-S의 부서에서 연구 지원을하고 있습니다.

전단 내피 세포를 노출 전단 고리 시스템의 구성은 전단 응력의 연구를 수행하는 간단한 방법이다. 그럼에도 불구하고, 우수한 전단 반지와 더 나은 결과를 얻기위한 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 완전 밀봉 된 샘플간에 일치 전단 응력을 생성 할 수있는 미디어 누출을 방지하기 위해 내부 및 외륜 사이에 만들어 져야한다. 완벽한 밀봉이 수행되지 않은 경우, 메틸렌 클로라이드의 최소량은 내부 링의 구멍을 통하여 전달 피펫으로 내부와 외부 사이의 접시 가장자리에 첨가되어야한다. 부드럽게 메틸렌 클로라이드 완전한 시일을 형성 할 수 있도록한다 조정기. 또한, 실수로 절단에서 생산되는 플라스틱 부스러기, 전단 링 트랙에 존재할 수 있으므로 부정적인 세포 성장에 영향을 일관성 전단 응력 애플리케이션을 줄 수있는 이물질을 제거해야합니다 건설 후 전단 링을 세척. 의 S문서에 설명 듣고 링은 샘플 당 출력의 높은 볼륨으로 이어지는, 크기가 상대적으로 크다. 그러나 작은 버전은 작은 배양 접시...

시스 - 조절 요소 (6)의 기동, 히스톤 아세틸 트랜스퍼 라제 활성 (7) 및 전단 응력에 응답 요소 (SSRE) 5-8 - 유체 전단 응력은 내피 유전자 프로그램 1을 조절하는 것으로 나타났다. 조직 인자 (9) 및 조직 플라스 미노 겐 활성제 (TPA) (10) 식을 변조함으로써 응력의 영향을 응고 향해 내피 기여 전단. 전단 응력은 PDGF-B의 합성 및 응답 (8)을 조절함으로써 혈관 신생 (11)와 선박 개조의 제어에 영향을 미친다. 내피는 엔도 텔린-1, 유로 텐신 II 및 relaxin도 전단 (12)에 의해 혈관 활성 매개체의 adrenomedullin 규제 유도. 내피 산화 질소 합성 효소의 생산 및 산화 질소 생산의 전사는 모두 전단 의존 10이다. 전단은 내피 세포의 ICAM-1의 발현 (13)를 제어한다. 따라서 powerfu 수 있습니다 흐름에 의한 전단 응력에서야 베드로 내피 응답의 큰 다양성에 영향을 미친다. 중요한 혈관 맥동 이제도 14 혈관성 치매 모두 정상 혈관 노화 형태의 병태 생리에서 중요한 역할을하는 나타나고 심지어 다발성 경화증 (15)와 같은 다른 신경 퇴행성 질환에 기여할 수있다. 동맥 및 정맥 내피 세포를 본질적으로 생체 내에서 다양한 혈류 흐름 패턴에 노출되며, 많은 다른 내피 세포 표현형 16을 발휘할 수있다. 크기 및 흐름의 주기성에 따라 내피 세포에 미치는 영향은 유전자 또는 단백질 발현 (17, 18)의 변화를 반영 할 수있다 염증성 세포의 활성화 및 아폽토시스를 포함 할 수있다. 내피 세포 반응에 대한 연구는 충분히 이러한 전단 패턴을 생성 체외 모델에서 생산 때문에 어려움에 의해 복잡하게 남아 현상을 전단합니다. 많은 다른 experimental 프로토콜 세포 단층 내피 유체 전단 응력을 적용하기 위해 개발되었다. (21) - 가장 일반적으로 사용되는 시스템들 중 하나는 상기 챔버 (19) 내에서 균일 한 층류를 생성하는 평행 평판 유동 챔버이다. 연동 펌프는 대개 일반적으로 생체 내의 많은 위치 22에서 발견되는 유동 특성 요점을 되풀이 할 수 주기적 유동을 생성하도록 접속된다. 또 다른 일반적인 셋업 유체의 전단 스트레스 콘 (23)의 회전 속도에 의해 결정되는 &#39;콘 플레이트&#39;모델을 사용한다. 그들과 비슷한 두 시스템 및 기타 배열은, 설정 많은 실험실에 상대적으로 비싸고 액세스 할 수 있습니다 구성 요소를 요구하는 지루한 될 수 있습니다. 이러한 전류 모델의 다른 중요한 제한은 동시에 상대적으로 낮은 표면적, 각각 행할 수 복제 연구의 상대적으로 낮은 수있다. 이것은 시간 및 공동 증가<html> 이러한 접근 방식의 mplexity. 따라서, 단방향 및주기적인 전단을 유도하는 이상적인 모델은 상대적으로 큰 표면적 연구 복제의 높은 숫자를 쉽게 설정할 수 있습니다 하나, 각각 수 있습니다. 또한, 상기 모델은 많은 사용자를 위해 엄청난 비용이 될 수있는 상당히 복잡한 설치가 필요합니다. 기본적인 실험 재료를 사용하여 유체 전단 교란을 제조 할 수있는 모델은 여러 가지 이점을 가질 수 있습니다. 단방향 주기적 전단 응력을인가하는 간단하고 매우 경제적 인 방법은 진탕 기 (24)에 원형 접시의 배치를 포함한다. 이 프로토콜은 매우 간단하며, 필요에 따라 복제 연구의 높은 수치는 비교적 큰 표면적을 각각 달성하기 위해 확장 될 수있다. 그러나, 접시의 중심에 위치한 셀은 동일한 혼합 접시에 세포 표현형 반응을 수득 주연을 따라 셀과 다른 흐름 패턴에 노출된다. _content &quot;&gt;이 현재 보고서에서 우리는 &#39;전단 링&#39;, 단방향 및주기적인 전단 응력을 만들기위한 우리의 모델의 구성 및 사용에 대해 설명합니다. 디자인을 전단 반지를 효과적으로 제한 &#39;혼합&#39;휴대 전단에 의한 표현형을 흐름을 제한하여 내륜의 배치를 통해 주위에 순환 배양 접시 내의 통로. 전단 링의 구성 및 동작이 간단하고 경제적이며 쉽게 널리 사용할 조직 배양 공급하여 오비탈 쉐이커 광범위한 수용하도록 확장 할 수있다. 이러한 모델 병태 생리적 수준에서 단방향주기적인 유동 패턴을 제공하기 위해 내피 세포 실험에 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>100 x 20mm 플라스틱 조직 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>접시는 폴리스티렌이어야 합니다</td></tr><tr><td>150 x 25mm 플라스틱 조직 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>접시는 폴리스티렌</td></tr><tr><td>150mm 유리 페트리 접시</td>여야 합니다 <td>Fisher</td><td>3160150BO</td><td></td></tr><tr><td>15ml 폴리스티렌 조직 배양 플라스틱 튜브</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>염화메틸렌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D65100</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 고무 실란트</td><td>DAP</td><td>7079808641</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Decon</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>3ml 전사 피펫</td><td>Becton-Dickinson</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>프린터 종이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>장갑</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>회전 도구 및 세트</td><td>Dremel</td><td>4000-6/50</td><td></td></tr><tr><td>회전 도구 절단 헤드</td><td>Dremel</td><td>EZ476</td><td></td></tr><tr><td>회전 도구 드릴 헤드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>증류수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>궤도 셰이커</td><td>VWR</td><td>57018-754</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>쥐 망막 미세 혈관 내피 세포</td><td>세포생물학제</td><td>RA-6065</td><td></td></tr></tbody></table>

총회와 &#39;전단 반지&#39;의 응용 프로그램 : 궤도, 단방향 및 정기 유체 흐름 및 전단 응력에 대한 소설 내피 모델

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

적응뿐만 아니라 내피 표현형과 유전자 발현의 병리학 적 변화를 유도하여 정상 수준 및 혈관 생리학 및 병태 생리에 혈관 유체 전단 중요한 역할을 패턴에서 편차. 특히주기적인 단방향 흐름 유도 된 전단 응력의 영향은 여러 부적응 혈관 세포 형태, 특히 혈관 내피 세포에 대한 다양한 효과를 트리거 할 수있다. 지금까지 다양한 해부학 적 기원에서 내피 세포 배양되었지만, 깊이있는 유체 전단에 자신의 응답이 전단 모델의 상대적 복잡성에 의해 방해 한 분석 (예를 들어, 평행 판 유량 용기, 콘 플레이트 흐름 모델). 이러한 모든 훌륭한 접근 방식을 나타내는 반면, 이러한 모델은 봇에 도전을 작성, 기술적으로 복잡하고 상대적으로 길고 복잡한 설정 시간, 낮은 표면 영역, 자주 밀봉 가스켓을 필요로하는 펌프 및 가압에 대한 요구 사항을 포함하여 결점불임 여러 실험을 실행하기 위해 무능력의 시간 유지. 흐름과 전단의 높은 처리량 모델은 혈관 내피 전단 반응에 큰 진전 사용할 수 있었던 경우에는, 분자 수준에서 특히주기적인 전단 연구는보다 신속하게 고급 수 있습니다. 쉽게에 단방향,주기적인 전단 응력 연구에서 실험 복제의 높은 숫자를 허용하는 비교적 큰 표면적 소설, 간단한 - 투 조립, 저렴한 조직 문화 모델 : 여기, 우리는 건설 및 사용 전단 링을 설명 내피 세포.

여기에서 우리는 전단 링에서 배양 hCMEC / D3 뇌 내피 세포와 쥐의 망막 미세 혈관 내피 세포 단일 층 모두에서 대표적인 결과를 제시한다. hCMEC / D3 뇌 내피 세포 단층이 완전한 EBM에 합류하도록 성장시킨 후, 전단 링 72 시간 동안 진탕 기 상에 두었다. 단계 3.5에서의 방정식을 사용하여, 최대 전단 응력을 계산 <img alt="식 (6)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq6.jpg" /> 이었다 매개 변수를 사용하여 약 2.8 다인 / cm 2 ( <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq2.jpg" /> = 0.95 cm, <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq3.jpg"...

유체 전단의 다양한 수준과 패턴은 내피 유전자 발현, 표현형 및 질병에 대한 감수성을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 우리는 '전단 고리'의 조립과 사용에 대해 논의합니다: 단방향, 주기적인 전단 응력 패턴을 생성하는 모델입니다. 전단 링은 조립이 간단하고 경제적이며 높은 세포 수율을 생성할 수 있습니다.

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

이 모델의 전반적인 목표는 혈관 내피 세포에 대한 In Vitro 주기적 유체 흐름 및 전단 응력 연구를 위한 간단하고 경제적인 방법을 구축하는 것입니다. 이 방법은 주기적 전단 응력이 내피 세포의 형태, 구조 및 기능에 어떠한 영향을 미치는지와 같은 내피 세포 생리학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 간단하게 조립된 조직 배양 장치를 사용하여 세포 반응 평가를 위한 비교적 넓은 표면적을 제공한다는 점입니다. 본 절차의 시연은 제 연구실의 의대생인 Mr.Luke White가 진행하겠습니다. 프레젠테이션 소프트웨어를 사용하여 외곽 가장자리 프로필이 150 millimeter이고 150 millimeter 원의 중심에 내부 직경 100 millimeter인 원이 배치된 전단 링 제작 템플릿을 만드는 것으로 이 절차를 시작하십시오.템플릿을 A4 흰색 용지에 출력하십시오. 환기가 잘 되는 흄 후드 내에서 장갑을 착용한 상태로 150 millimeter 유리 페트리 접시에 methylene chloride 10 millimeter를 피펫으로 분주합니다. methylene chloride는 대부분의 플라스틱을 용해시키므로 반드시 유리 접시를 사용해야 합니다.150 millimeter 플라스틱 페트리 접시를 외부 전단 템플릿 위에 정렬합니다. 로터리 툴을 사용하여 100 millimeter 접시의 중앙에 3 millimeter 구멍 3개를 뚫습니다. 드릴링 과정에서 발생한 플라스틱 파편을 모두 제거합니다.장갑을 낀 손으로 100 millimeter 페트리 접시를 잡고, 접시의 상단 가장자리를 메틸렌 클로라이드 액체에 약 3초 동안 거꾸로 담급니다. 100 millimeter 접시에 묻은 과잉 메틸렌 클로라이드를 떨어뜨린 후, 젖은 접시 가장자리를 150 millimeter 접시의 중앙으로 빠르게 옮깁니다. 표시된 템플릿에 맞춰 100 millimeter 접시를 조심스럽게 정렬합니다.150 밀리미터 접시에 잘 접착되도록 100 밀리미터 접시를 시계 방향과 반시계 방향으로 몇 번 부드럽게 회전시킵니다. 메틸렌 클로라이드가 건조되면, 새로 접합된 페트리 접시를 뒤집어 접촉 지점을 주의 깊게 검사합니다. 밀봉이 완전히 이루어지지 않은 경우, 트랜스퍼 피펫을 사용하여 3 밀리미터 구멍을 통해 0.5 밀리리터의 메틸렌 클로라이드를 주입합니다.디쉬를 들어 올려 살짝 회전시켜 메틸렌 클로라이드가 가장자리까지 닿게 합니다. 두 개의 페트리 디쉬 사이에 밀폐가 확실히 되었는지 확인한 후, 100 millimeter 디쉬의 구멍에 3 millimeter 두께의 실리콘 고무 밀봉제를 도포하여 밀봉합니다. 평면 커팅 헤드가 장착된 로터리 툴을 사용하여 15 millimeter 코노콜 폴리스티렌 조직 배양 튜브의 상단 3 centimeter 부분을 잘라내되, 캡 아래로 최소 1 centimeter의 튜브가 남도록 합니다.커팅 헤드의 평평한 면을 사용하여 절단된 튜브의 가장자리가 매끄럽고 평평해질 때까지 연마하십시오. 연마 과정에서 발생한 플라스틱 파편을 제거하십시오. 마커를 사용하여 절단된 15 milliliter 원추형 튜브의 외형을 150 millimeter 디쉬 뚜껑의 가장자리에서 약 0.5 centimeters 떨어진 곳에 따라 그리십시오.그려진 원 내부에 구멍을 뚫되, 원의 가장자리에서 약 1~2mm의 여백을 둡니다. 절단된 코노콜(conocole) 튜브 상단을 뚫린 구멍 위에 놓습니다. 트랜스퍼 피펫을 사용하여 절단된 코노콜 튜브 가장자리에 methylene chloride 약 0.25mL 또는 250µL를 도포하여 코노콜 튜브를 150mm 뚜껑에 접착시킵니다.마지막으로, 상단 페트리 접시의 안쪽 가장자리를 따라 1 mm 두께의 실리콘 고무 밀봉제를 도포하여 150 mm 뚜껑을 150 mm 접시에 밀봉합니다. 조립된 실링 링의 모식도가 표시되어 있습니다. 파란색은 내피 세포가 도말된 영역을 나타냅니다.외부 및 내부의 빨간색 화살표는 오비탈 셰이커 위에 놓였을 때 전단 링과 전단 링 내부 배지의 궤도 운동을 나타냅니다. 15 milliliter 원심 분리 튜브 포트를 통해 새로 제작된 전단 링에 PBS 약 10 millimeters를 피펫팅하여 멸균을 준비합니다. 전단 링 내부의 잔해물을 제거하기 위해 가볍게 흔들어 섞어줍니다.파스퇴르 피펫과 진공 흡입기를 사용하여 PBS를 제거합니다. 모든 잔해물이 제거될 때까지 PBS 세척을 반복합니다. 전단 링을 멸균하기 위해 70% ethanol 린스와 UV 조사를 병행하여 사용합니다.통기성 캡을 돌려 열고, 주입구를 통해 70% ethanol 약 10 milliliters를 피펫으로 넣은 후 캡을 다시 조입니다. 시어 링(sear ring)을 여러 번 회전시키고 뒤집어 시어 링 내부가 충분히 세척되도록 합니다. 조직 배양 후드 아래에서 과량의 70% ethanol을 흡입하여 제거합니다.분무기를 사용하여 액세스 포트와 캡에 70% ethanol을 충분히 뿌립니다. 다음으로, 조직 배양 후드 내에서 쉐어 링과 캡이 완전히 마를 때까지 UV 조사 장치 아래에 둡니다. 쉐어 링이 마르면 캡을 다시 돌려 잠급니다.멸균된 전단 링(shear rings)은 세포 배양 플레이팅에 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오. 전단 응력 연구를 준비하려면, 먼저 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 멸균된 전단 링에 혈관 내피 세포를 플레이팅하십시오. 유동 연구를 시작하기 전에 배양 세포가 합류(confluency) 상태에 도달하도록 하십시오.세포가 컨플루언시(confluency)에 도달하면, 선반 응력과 진동을 최소화하기 위해 인큐베이터 하단 선반에 배치된 오비탈 셰이커(orbital shaker) 위에 실험용 전단 링(shear rings)을 놓습니다. 정적 대조군 전단 링은 동일한 인큐베이터 내부에 배치합니다. 전단 응력을 가하고자 하는 원하는 시간 동안 전단 링을 셰이커 위에 둡니다.세포층을 원하는 시간 동안 전단력에 노출시킨 후, 인큐베이터에서 전단 링을 꺼냅니다. 전단 링 덮개를 제거하고 원하는 종점 분석을 위해 세포 및 배지를 회수합니다. 전단 링을 개봉한 후 연구자는 여러 가지 방법을 사용하여 분석용 세포와 배지를 수확할 수 있음을 유의하십시오.48시간 동안의 주기적인 유체 전단 응력 또는 정적 노출 후, 전단 링(shear ring) 내 인간 CMEC D3 뇌 혈관 내피 세포 단층의 외형에 대한 대표적인 결과가 제시되어 있습니다. 배양 세포의 정렬이 화살표로 표시된 흐름 방향과 항상 평행한 것은 아님이 관찰되었습니다. 쥐 망막 미세혈관 내피 세포 단층에서의 주기적 전단 응력에 대한 일부 반응이 나타나 있습니다. 전단 링에서 72시간 동안 주기적인 유체 전단 응력을 가한 결과, Beta-actin 로딩 컨트롤 대비 Platelet-endothelial cell adhesion molecule이 유의하게 감소하였습니다.숙련된 후에는 적절히 수행할 경우 약 3시간 만에 여러 개의 전단 링(Shear Ring)을 제작할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 내부 디쉬와 외부 디쉬를 세심하게 정렬하여 두 디쉬 사이에 밀폐된 씰이 형성되도록 하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 내피세포에 대한 인비트로(In Vitro) 주기적 유체 흐름 및 전단 응력 연구를 수행하기 위한 간단한 방법으로서 전단 링을 제작하고 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 염화메틸렌을 사용하는 작업은 위험할 수 있으므로, 해당 단계가 필요한 작업을 수행할 때는 항상 흄 후드 내에서 작업하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 살균 지속적인 흐름 회로에서 층류 유동 전단 응력에 따라 자기편 세포 수있는 방법을 설명하고 있습니다. 세포 '유착, 형태는 투명 챔버를 통해 신진 대사 분석 및 미래의 실험이나 문화에 대한 전단 노출 후 수확한 세포 회로에서 얻은 샘플을 공부하실 수 있습니다.

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

이 문서는 휴대 자기 조립에 의해 세포 - 파생 조직 반지를 만드는 다양한 방법을 설명합니다. 평활근 세포는 링 모양의 아가로 오스 웰스의 집계 7 일 이내에 강력한 입체 (3D) 조직을 형성하기 위해 계약을 씨뿌린. 밀리 대규모 조직 반지는 기계 테스트에 도움이되는이며 조직 조립 블록을 건물로 제공하고 있습니다.

자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

마이크로 - 온 - 칩 플랫폼은 포토 리소그래피 리플 로우 레지스트 기술, 소프트 리소그래피, 그리고 미세 유체의 조합에 의해 개발되었다. endothelialized 마이크로 플랫폼은 생체 내 미세 혈관에서의 3 차원 (3D) 구조를 모방 제어 지속적인 혈류의 흐름에서 실행하고, 고품질의 실시간 영상을 허용하고 미세 혈관 연구에 적용 할 수 있습니다.

멀티 깊이 원형 단면 Endothelialized 마이크로 채널 - 온 - 칩의 개발을위한 절차

이 논문은 내피 세포의 생리 학적 특성을 요점을 되풀이 미세 혈관을 설계하는 사출 성형 방법을 제공한다. 미세 유체 기반의 공정은 흐름, 세포 성분, 형상, 생화학 그라디언트로 테일러 조건과 특허 3 차원 혈관 네트워크를 생성합니다. 제조 공정 및 잠재적 응용 예들이 설명된다.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

여기, 유체 전단 응력에서 내 피 세포의 문화 및 유전자 표정 분석에 대 한 워크플로 제공 됩니다. 포함 된 동시에 주택 및 제어 환경에 양이 많은 PCR에 대 한 참조 외 인 RNA 사용 하 여 여러 흐름 챔버 모니터링에 대 한 물리적 배열이입니다.

가 여러 명의 병렬 접시 흐름 챔버를 사용 하 여 스트레스에 노출 된 내 피 세포의 유전자 표정 분석

이 프로토콜의 목적은 전단 응력에 의한 메카노민성 이온 채널의 실시간 활성화를 조사하는 데 사용하기 위해 변형된 병렬 플레이트 플로우 챔버를 설명하는 것이다.

잘 정의된 전단 응력 하에서 단세포 이온 전류의 전기 생리학적 기록

본 프로토콜은 궤도 셰이커 모델을 사용하여 전단 응력 응용을 위한 6웰 플레이트의 특정 영역으로 내피 세포 성장을 제한하는 코팅 방법을 설명한다.

메카노생물학적 연구를 위한 궤도 셰이커에 6웰 플레이트에서 내피 세포의 분할 성장

여기서, 우리는 미세 유체 칩과 자동으로 제어되는 고효율 순환 미세 유체 시스템을 제공하여 신생 혈관화의 초기 미세 환경을 재구성하여 내피 세포 (EC)가 높은 발광 전단 응력, 생리학적 수준의 경내 연골 흐름 및 다양한 혈관 내막 성장 인자 (VEGF)에 의해 자극 될 수 있도록 합니다.

뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델

심근 경색이 발생하기 전에 개입을 안내하기 위해 관상 동맥 경화성 병변이 관상 동맥 혈관에서 진행될 지 결정할 필요가 있습니다. 이 문서에서는 이러한 진행을 예측하는 데 도움이 되는 상용 유한 요소 솔버에서 유체 구조 상호 작용 기술을 사용하여 광학 일관성 단층 촬영에서 동맥의 생체 역학 모델링을 설명합니다.

관상 동맥 경화증 진행의 광학 일관성 단층 촬영 기반 생체 역학 유체 구조 상호 작용 분석

여기서는 내피세포를 동기화된 진동성 고혈당과 맥동성 전단 스트레스에 노출시키는 마이크로유체 시스템을 제작하고 작동시키는 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 당뇨병 내피 기능 장애 연구를 위한 생리학적으로 적합한 시험관 내 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 산화 스트레스와 내피 세포 반응의 정량적 측정을 가능하게 합니다.

생리적 맥박성 전단 응력과 진동성 고혈당 하에서 내피 기능 장애를 모델링하는 마이크로플루이딕 시스템

배우세요 내피세포에 주기적 전단응력을 가하는 간단하고 경제적인 전단 반지 모델을 구축하는 방법을. 이 기법은 큰 표면적에서 세포 반응을 평가하여 혈관 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

총회와 '전단 반지'의 응용 프로그램 : 궤도, 단방향 및 정기 유체 흐름 및 전단 응력에 대한 소설 내피 모델

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