기존의 UV 레이저 공 초점 현미경을 사용하여 트리거 세포 스트레스와 죽음

이 세포 절제 접근법의 전반적인 목표는 세포 배양 또는 살아있는 동물에서 개별 세포에 선택적으로 스트레스를 주거나 죽이는 것입니다. 이 방법을 통해 연구자들은 단일 죽어가는 세포의 운명과 미세아교세포 및 성상교세포와 같은 세포가 주변 절제 부위에 어떻게 반응하는지 연구할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 개별 세포를 정밀하게 표적화할 수 있다는 것이며, 이는 405 나노미터 레이저가 장착된 일반 컨포칼 현미경으로 달성할 수 있다는 것입니다.

우리는 제브라피시를 운동 뉴런 질환 또는 전두측두엽 치매와 같은 신경퇴행성 질환을 연구하기 위한 모델 시스템으로 사용합니다. 운동 뉴런의 죽음과 그에 따른 결과를 시각화하는 것은 질병과 관련된 역동적인 과정을 더 잘 이해할 수 있는 훌륭한 기회를 제공합니다. 용량 의존적 방식으로 세포 스트레스를 가하는 당사의 접근 방식은 세포 상호 작용의 상세한 특성화를 가능하게 합니다.

예를 들어, nueronal death 후 microglia clearance. 이 방법은 살아있는 유기체의 질병 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하지만 배양 중인 고립된 세포에도 유사하게 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 짝짓기를 위한 수컷과 암컷의 형질전환 계통을 설정한 후, 플라스틱 차 여과기를 사용하여 탱크 물을 걸러서 성공적으로 산란한 후 배아를 수집합니다.

그런 다음 달걀 물을 사용하여 달걀을 헹구고 페트리 접시에 달걀 물에 옮깁니다. 수정을 결정하기 위해 광학 현미경으로 배아를 검사합니다. 그런 다음 수정란을 섭씨 28도에서 부화시킵니다.

배아가 수정 또는 DPF 후 2일에서 5일이 지나면 형광 복합 현미경에 놓고 배아에서 적절한 형광단 발현을 검사합니다. 그런 다음 밝게 표시된 생선을 나중에 삽입할 수 있도록 계란 물과 함께 신선한 접시에 분리합니다. 아가로스에 제브라피쉬를 넣으려면 달걀 물이 담긴 페트리 접시에 MS 222 리터당 4g을 적방울로 넣어 마취 용액을 준비합니다.

저융점 아가로스와 달걀 물을 준비하여 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다. 부분 표본을 섭씨 38-40도의 열 블록에 넣고 평형을 이루도록 합니다. 이미징 시간이 4시간 이상인 경우, 유리 바닥 접시의 내부 원을 따라 약 300마이크로리터의 아가로스를 피펫으로 만들어 중앙에 작은 구멍이 있는 도넛 모양의 원을 준비합니다.

현미경 검사를 위해 제브라피쉬를 아가로스에 장착하려면 텍스트 프로토콜에 따라 물고기를 마취한 후 조정 가능한 피펫을 사용하여 유충을 끌어올려 팁 바닥으로 가라앉힙니다. 최소한의 액체에 유충을 예열된 아가로스에 떨어뜨립니다. 그런 다음 아가로스로 생선을 꺼내 미리 준비한 유리 바닥의 35mm 접시에 빠르게 분배합니다.

해부 현미경으로 표준 붓을 사용하여 아가로스 안에 있는 동물 또는 여러 동물을 옆구리에 배치하여 몸통과 꼬리가 평평하게 되도록 합니다. 아가로스가 단단히 굳을 때까지 박힌 물고기를 10-15분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 약 2ml의 달걀 물에 트리카인을 넣고 35mm 페트리 접시를 조심스럽게 채웁니다.

유충이 박힌 페트리 접시를 컨포칼 현미경 스테이지에 놓고 명시야 조명과 40배 배율을 사용하여 동물의 척수의 등쪽에 초점을 맞춥니다. 적절한 형광 설정으로 전환하고 관심 구조를 시각화하여 모든 이미징 매개변수가 후속 절제에 필요한지 확인합니다. UV 레이저 절제를 위한 구조의 두께를 결정하려면 Z 드라이브를 사용하여 수동으로 위아래로 초점을 맞춰 관심 구조의 상단과 하단을 확인합니다.

절제할 Z 평면을 수동으로 기록합니다. 예를 들어 셀의 중심이 있습니다. 레이저 절제를 수행하려면 소프트웨어 메뉴 상단의 드롭다운 메뉴를 클릭하여 FRAP 마법사를 시작하십시오.

새 창에서 형식, 스캔 속도 및 평균을 선택하여 절제 접근법에 대한 이미지 매개변수를 결정합니다. 절제를 위한 Z 평면이 아직 선택되지 않은 경우 Live 버튼을 누르고 형광 구조 또는 절제할 원하는 Z 평면에 초점이 맞춰질 때까지 표본을 통해 초점을 맞춥니다. 일반 이미지 매개변수가 설정되면 Bleach 단계에 액세스하여 특정 절제 구성 요소를 제어합니다.

그런 다음 표백 절차를 위해 405 나노미터 레이저를 활성화하여 사용합니다. 그런 다음 Zoom In 옵션을 사용하여 스캔 필드를 줄여 선택한 ROI에서 표백 강도를 최대화함으로써 체류 시간을 최대화합니다. Image Acquisition 창에서 그리기 도구 중 하나를 사용하여 절제에 대한 하나 이상의 ROI를 선택합니다.

예를 들어, 약 4-8마이크로미터의 원형 그리기 도구를 사용하여 축삭돌기 언덕을 목표로 합니다. ROI를 설정한 후 Time Course 버튼을 선택하고 ROI를 스캔하고 절제할 사이클 수를 확인합니다. Pre-Bleach(사전 표백제) 및 Post-Bleach(표백제 후) 프레임을 원하는 대로 선택하여 표백 과정 직전과 직후의 전체 이미지를 전체적으로 볼 수 있습니다.

이러한 설정을 통해 연구원은 여러 계층의 세분화를 수행할 수 있습니다. 레이저 출력, 스캔 속도, 라인 평균화, 관심 영역의 크기 및 반복 조정을 통해 이 기술은 개별 세포에 스트레스나 사멸을 유발할 수 있는 높은 자유도를 제공합니다. 필요한 모든 절제 매개변수를 설정한 후 Run Experiment를 누르고 절제의 효율성을 모니터링합니다.

자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 이 실험에서는 형질전환 제브라피쉬의 척수에서 운동 뉴런을 발현하는 GFP에 UV 레이저 절제를 수행했습니다. 3 MINX one, IO one 또는 MET와 같은 운동 뉴런 프로모터에 의해 구동되는 GFP 발현은 세포체, 주요 축삭돌기 및 근육으로 확장되는 주변 가지를 고해상도로 시각화할 수 있습니다.

척수에 있는 뉴런의 성공적인 절제는 절제 직후 형광이 사라지고 다시 시작되지 않을 때 달성되었습니다. 이 접근법의 특이성은 여기에서 볼 수 있듯이 확인되었으며, 여기서 단일 표적 뉴런은 자외선에 노출된 후 방출을 녹색에서 빨간색으로 전환하는 광변환 가능한 광플루로 Kaede를 사용하여 변환되었습니다. 강도가 다른 세포를 표적으로 하기 위해 레이저 출력, 스캔 속도, 라인 평균화, 절제할 ROI의 크기 및 반복을 조정하여 여러 층의 미세 조정을 사용할 수 있습니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 더 낮은 UV 레이저 강도로 소마에서 절제된 긴 축삭 돌기를 가진 운동 뉴런은 시간이 지남에 따라 소마에서 축삭을 따라 계속되는 특징적인 기저귀를 나타냈습니다. 이 절차를 시도하는 동안 각 컨포칼 설정은 고유하며 각 기기의 레이저 출력은 고유하며 다를 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 시술 후, 절제된 뉴런에서 세포사멸(apoptotic cell death)의 특징적인 특징을 볼 수 있습니다.

XN 5와 같은 세포사멸 마커 또는 체질 변성 또는 외부 기포와 같은 형태학적 변화를 재현 가능하게 검출할 수 있습니다. 척수에서 단일 또는 다중 뉴런의 절제가 수영 성능에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 추가 검사를 수행할 수 있습니다. 서로 다른 형질전환 제브라피시 계통을 교차시킴으로써, 연구자들은 레이저에 의한 세포 파괴에 대한 다른 세포의 반응을 조사할 수 있습니다.

이러한 방법은 in vivo에서 MND와 같은 질병의 정확한 분자 메커니즘을 이해하기 위한 고유한 실험 플랫폼을 제공합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 컨포칼 현미경 검사를 위해 제브라피시를 준비하는 방법과 단일 세포 UV 레이저 절제를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.