BMPR-IB +의 신속한 격리 두개골 결함 치유 모델에서 사용을위한 기질 세포를 지방이는 유래

본 프로토콜의 전반적인 목표는 지방 유래 기질 세포의 특정 세포군을 분리하고, 생체 내 분석(in vivo assay)을 통해 이들의 골 형성 활성을 테스트하는 것입니다. 이 방법은 손상된 골 결손 부위에 완전히 기능하는 뼈 조직을 생성하기 위해 지방 유래 줄기세포를 어떻게 활용할 수 있는지와 같이, 두개안면 재생 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신선한 인체 조직에서 세포를 빠르게 분리할 수 있다는 점이며, 이를 통해 유전자 및 세포 표면 마커 발현을 변화시키는 것으로 알려진 세포 배양 과정을 거치지 않을 수 있습니다.

이 기술의 영향력은 암, 외상 또는 감염으로 인해 발생한 광범위한 골 결손이 있는 환자들에게까지 확장됩니다. 향후에는 ASC 세포군을 분리하여 재생 방식으로 사용하는 것이 가능할 수 있습니다. 두개골 결손 부위는 돔 형태의 두개골 위에 생성되며 경막과 매우 인접해 있기 때문에 생성 방법을 익히기가 어렵으므로, 이 기술에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

본 프로토콜에서는 건강한 인간 공여자의 복부, 옆구리 또는 허벅지 피하 지방을 채취하여 플라스틱 흡입 캐니스터에 보관하여 준비합니다. 지방에 동일한 부피의 멸균 PBS를 첨가하고 30초 동안 부드럽게 흔들어 혼합합니다. 수성층이 가라앉을 때까지 기다린 후, 10 milliliter 플라스틱 피펫을 사용하여 이를 제거합니다.

그 다음, 지방을 커다란 플라스틱 용기에 따라 붓고, 동일한 부피의 소화 혼합물을 첨가합니다. 밀봉된 지방 용기를 70% ethanol로 세척한 후, 파라핀으로 밀봉합니다. 그런 다음, 37 degrees Celsius 인큐베이터에서 분당 180회 회전 속도로 용기를 30분 동안 흔들어 줍니다.

다음으로, 표준 배지를 사용하여 반응 부피를 두 배로 늘려 소화를 중화합니다. 세포를 원심 분리하여 상층액을 조심스럽게 제거하고, 각 펠릿을 5 milliliters의 표준 배지로 재현탁합니다. 그런 다음, 모든 현탁액을 100 micron 필터에 통과시켜 50 milliliter 코니컬 튜브에 담습니다.

여과액을 4°C에서 300 G로 15분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거하고 펠렛을 실온의 RBC 용해 버퍼 5 mL에 다시 현탁합니다. 현탁이 완료되면 실온에서 5분 동안 용해시킵니다. 그 다음, 실온에서 15분 동안 튜브를 원심 분리하고, 텍스트 프로토콜에 따라 분리 단계를 완료합니다.

적절한 세포 분별은 이 프로토콜에서 매우 중요합니다. 먼저, 세포를 100 µL당 100만 개의 세포가 되도록 FACS 버퍼에 재부유시킨 후 얼음 위에 보관하십시오. 그 다음, 최소 1,000만 개의 세포를 BMPR-1B라고 표시된 얼음 위의 플라스틱 원심 분리 튜브로 옮기십시오.

100만 개의 세포를 'unstained'라고 표시된 얼음 위의 튜브로 옮기고, 1 mL의 FACS buffer를 추가합니다. 나머지 세포는 'unsorted'로 표시합니다. 다음으로, BMPR-1B 튜브에 항체를 넣고 가볍게 파이펫팅하여 섞습니다.

제조업체에서 권장하는 시간 동안 이 혼합물을 배양하십시오. 그 다음, FACS 소팅을 위해 세포를 원심 분리하고, 1 mL의 FACS 버퍼에 조심스럽게 재부유시키십시오. 이어서 동일한 과정을 반복하여 세포 농도를 1 x 10⁶ cells/mL로 재부유시키십시오.

이제 세 가지 세포군 모두를 40 micron 세포 스트레이너를 통해 유리 FACS 튜브에 통과시킵니다. 500 microliters FACS 버퍼를 사용하여 필터에 남은 마지막 세포들을 헹궈 냅니다. 이어서 항체 양성 및 음성 세포군을 담을 두 개의 수집 바이알을 준비합니다.

각 튜브에 2 mL의 표준 세포 배양 배지를 채웁니다. FACS 기기에서 먼저 염색되지 않은 세포를 분석하고, 그 결과를 바탕으로 형광 마커의 음성 게이트를 설정합니다. 그 다음, 100 micron 노즐을 사용하여 염색된 세포를 표준 배지가 담긴 각각의 튜브로 분리합니다. 가능하다면 분리 과정 동안 이 튜브들을 4 °C로 냉장 상태로 유지하십시오.

텍스트 프로토콜에 기술된 대로 세포를 스캐폴드에 로딩하여 진행하십시오. 동물을 마취한 후, 수술 부위의 털을 깎아내고 노출된 피부를 포비돈 요오드 용액으로 닦아낸 다음 70% ethanol로 세 번 세척하십시오. 그런 다음, 수술 부위를 노출시킨 상태로 동물에게 드레이프를 씌웁니다.

이제 15번 메스 블레이드를 사용하여 등쪽 두개골의 대부분을 가로지르는 정중 시상 절개를 실시합니다. 그런 다음, 미세 치아 핀셋으로 절개창 오른쪽의 피부를 젖혀 오른쪽 두정골을 노출시킵니다. 오토클레이브 멸균 처리된 4 mm 다이아몬드 코팅 트레핀 드릴 비트를 장착하여 드릴을 준비합니다.

그 다음, 두정골에 결손 부위를 드릴로 뚫되, 결손 부위가 뼈 너머로 확장되지 않도록 하여 경막 층이 손상되지 않게 합니다. 이제 세포 또는 대조군 용액이 포함된 스캐폴드를 결손 부위에 배치하고, 러닝 나일론 봉합사로 피부 절개 부위를 봉합합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 안내된 대로 수술 후 마우스 관리 프로토콜을 진행하십시오.

수술 당일에 실시한 두개골 결손 부위의 Micro CT 스캔은 새로운 결손 부위를 명확하게 보여줍니다. 이후 시점에서 반복 스캔을 실시한 결과, BMPR-1B 양성 세포를 이식한 결손 부위가 BMPR-1B 음성 또는 미분류 세포를 이식한 부위보다 더 빠르게 폐쇄됨을 확인할 수 있습니다. 치유 정도를 전체 상처 폐쇄 비율(%)로 정량화하면 그 차이를 쉽게 알 수 있습니다.

다음으로, 결손 부위가 포함된 두개골 일부를 탈칼슘화하고 Movat's pentachrome 염색을 통해 대조군과 비교하여 재생된 새로운 뼈를 식별하였습니다. 이 염색법은 연골과 뼈, 그리고 그 사이의 모든 성숙 단계를 구분할 수 있게 해줍니다. 분리되지 않은 세포와 비교했을 때, BMPR-1B 양성 세포는 재생 과정에 강력한 영향을 미쳤으며, 특히 결손 경계 부위에서 가장 두드러졌습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 환자 맞춤형 ASC를 분리하고 이를 이용하여 골 결손을 치료하는 이 실험의 임상적 잠재력에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

이 실험을 통해 다양한 계통 분화 능력을 가진 ASCs를 분리하기 위한 FACS, 시간에 따른 서로 다른 세포 유형과 조직의 치유 과정을 분석하기 위한 micro CT, 그리고 더 많은 골 치유 실험을 구상하기 위한 본 실험의 두개골 결손 모델과 같이 골 치유에 관한 더 많은 질문에 답하기 위한 다양한 후속 실험을 진행할 수 있습니다. 인체 조직을 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 장갑 착용, 보호경 사용 및 모든 유해 폐기물의 적절한 처리 등 적절한 예방 조치를 반드시 취하시기 바랍니다.