Name: 인플루엔자 바이러스 단일 클론 항 체를 중화의 탈출 변종의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 학습하세요 인플루엔자 A 바이러스 혈구응집소 억제 및 중화 활성을 이용한 단일 클론 항체 표위 분석 방법입니다. 이 기술은 백신 설계와 바이러스 저항 메커니즘 이해에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 자금을 일부 알레르기 국립 연구소와 전염병에서 연방 자금, 건강의 국가 학회, 학과의 보건 및 인적 서비스, CEIRS 아래 계약 HHSN272201400008C (F.K.); NIH U19AI109946-01 (F.K.); 그리고 P01AI097092-04S1 (P.E.L.)입니다.

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저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

대부분 탈출 돌연변이 통해 식별 된 잔류물의 정확 하 게 되어,이 방법의 주요 주의 사항 중 하나 이지만 탈출 이체의 점 돌연변이 의해 결정 되는 항 체의 분자 풋프린트 내에서 반드시 매핑되지 않을 수 있습니다. 구조 분석입니다. 이것은 원심 allosteric 효과 유사한 돌연변이 잔류물의 위치를 구조적 변화에 지도 하는 특정 잔류물에 돌연변이의 능력 때문 이다. 또 다른 한계는이 방법만 중화 항 체;에 대 한 구현 될 수 있습니다. 항 체를 체 외에서 선택적 압력 부족 돌연변이 탈출 이어질 것입니다. 그러나,이 제한 탈출 변종 이전 특징이 중화 항 체에 의해 생성 된 패널의 사용으로 극복할 수 있습니다. 황갈색 외. H7N9 바이러스를 중화 mAb의 탈출 변형 사용 비 중화 항 체7의 epitope를 지도.
그럼에도 불구 하 고, 탈출 이체의 세대를 통해 항 체의 epitopes를 elucidating 결정학 및 cryo 전자 현미경 검사 법, 둘 다 장비의 광범위 한 투자 요구에 대안을 제공 합니다. 다른 대안 mAbs 알라닌 스캔 또는 펩 티 드 스캔/자르기 돌연변이 사용 하 여 최소한의 바인딩 영역을 결정 하는. 알라닌 mutagenesis 스캔 이체의 많은 수를 생성 하는 펩 티 드 검색 하는 것은 선형 epitopes30으로 제한 하는 동안29, 심사 하는 동안에 작업의 상당한 금액을 요구할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 아무 특별 한 장비 또는 기술을 요구 하 고 사실, 사용 기존 생체 외에서 중화 분석 관심의 항 체의 탈출 이체를 생성 하도록 수정.
여러 구절 (예를 들어, 스토킹 특정 항 체)를 요구 하는 생성 탈출 변종에 대 한 프로토콜 높은 통로 0 항 체의 시작 농도에 따라 달라 집니다. 그것은 주의 측면에 잘못을 항 체의 절반 최대한 억제 농도 보다 낮은 반 로그에 로그 시작 강력한 바이러스 성장에 대 한 허용을 좋습니다. 연구원 면역 저압의 높은 titer 바이러스 문화 바이러스 인구에서 큰 유전 변이 가질 것 이라고 추측 수 있습니다. 도 이체 다음 구절에서 항 체 농도 점차적으로 증가 하 여 대 한 선택할 수 있습니다. 바이러스 성장 감소, 그 바이러스 상쾌한 양의 이전 구절에서 항 체 농도의 동일한 금액을 유지 하면서 다음 구절에서 늘릴 수 있습니다.
보편적인 인플루엔자 백신의 대부분의 목표는 HA의 스토킹 지역으로 강력한 항 체 응답을 이끌어내는 것 이다. 줄기-특정 항 체를 탈출 이체의 분석은 인플루엔자 바이러스 체력과 면역 압력 사이의 관계를 정의에서 중요 한. 흥미롭게도, 탈출 돌연변이 바이러스 스토킹 관련 mAbs에서 유래한 murine LD50 연구4에서 모든 감쇠 vivo에서 했다. 이러한 연구는 예방 접종 스토킹 기반 플랫폼에 대 한 강한 케이스를 제공합니다. 또한,이 프로토콜 작은 분자 억제제 같은 다른 안티 바이러스 화합물에 탈출 돌연변이 식별 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 마지막으로,이 방법론 인플루엔자 바이러스 표면 glycoproteins에 국한 되지 않습니다 하지만 다른 바이러스 성 glycoproteins의 epitopes를 결정 하도 더 넓게 적용 될 수 있습니다.

다른 RNA 바이러스와 마찬가지로, 인플루엔자 A 바이러스는 다양 한 항 원 이체 복제1,2,3의 각 라운드의 생성을 허용 하는 오류 중 합 효소를 소유한 다. 인플루엔자 바이러스는 항 체 바인딩의 손실에 지도 하는 표면 glycoproteins에 돌연변이의 축적을 통해 달성 된다 항 원 편 류를 통해 인간의 면역 반응을 회피 하 고 적응 하는 놀라운 능력. 바이러스 성 표면 glycoproteins, 하 및 응집 (NA)의 항 원 편 류를 다르게 매년 백신을 관리 하 고 필요를 필요로 합니다.
격리 및 항 원 특정 항 체의 생성 기술 발전 백신 유도 mAbs4,5,6,,78의 높은 수를 얻지 못했다. 차례로, 인플루엔자 A 바이러스를 광범위 하 게 중화 mAbs의 epitopes의 특성은 크게 주 었 여러 범용 인플루엔자 백신 후보자9,,1011의 개발 12,,1314. mAb의 항 원 발자국 elucidating 중립화의 구조적 결정 요인 밝혀 고 백신 디자인으로 정보 접근에 대 한 수 있습니다. 그러나, 그것은 현실도 구조적으로 바이러스 성 항 원15, 에 epitopes를 지도 하기 위하여 엑스레이 결정학 또는 cryo 전자 현미경 검사 법을 통해 mAbs의 광범위 한 패널 특성 실험실에 대 한 비용 효율적인 16 , 17 , 18.
엑스레이 결정학 또는 cryo 전자 현미경 검사 법 고가의 장비, 전문된 기술 및 잠재적으로 광범위 한 양의 데이터를 생성 하는 시간이 필요 합니다. 대체 하 고 빠른 접근 활용 오류가 RNA 의존을 통해 다양 한 바이러스 인구의 급속 한 세대 mAbs19,20의 epitopes를 결정 하기 위해 탈출 돌연변이 생성에 RNA 중 합 효소 21,,2223. 이스케이프 변종의 생성 어떤 특별 한 장비 또는 기술을 요구 하지 않는다 고 기존의 실험실 시 약 및 장비와 함께 수행할 수 있습니다.
여기, 인플루엔자 HA를 인식 하는 mAb 바인딩에 필요한 중요 한 잔류물의 매핑 허용 하는 방법을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Falcon 96웰 투명 평면 바닥 TC 처리 배양 마이크로플레이트(뚜껑 포함</td><td>) Corning, Inc.</td><td></td><td>미세중화 분석에 대한 353072 분석 플레이트 사용</td></tr><tr><td>Falcon 96-well clear V-bottom plate</td><td>Corning, Inc.</td><td></td><td>혈구응집 억제 분석을 위한 353263 분석 플레이트 사용</td></tr><tr><td>: 1X Minimal Essential Medium (MEM)</td><td>Gibco</td><td>11095080</td><td>Infection medium</td></tr>, <tr><td>Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK) 처리 트립신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td>는 <td>미성숙 HA0를 HA1 및 HA2</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV)로 절단합니다.</td><td>EMD 밀리포어</td><td>MAB8258B</td><td>인플루엔자 A 바이러스의 NP 단백질을 인식하는 항체</td></tr><tr><td>비오틴화 항-NP 일차 항체(IBV)</td><td>EMD 밀리포어</td><td>MAB8260B-5</td><td>인플루엔자 B 바이러스의 NP 단백질을 인식하는 항체</td></tr><tr><td>스트렙타비딘-HRP 항체</td><td>EMD 밀리포어</td><td>18-152</td><td>비오틴화 항-NP 항체</td></tr><tr><td>HRP 기질(SIGMAFAST-OPD)의 2차 항체로 사용됩니다.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9187-5SET</td> HRP 96-well V-바닥 플레이트<td>용 o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 수용성 기판</td></tr><tr><td></td><td>Nunc</td><td>249662</td> 혈구 응<td>집 분석에 사용되는 분석 플레이트</td></tr><tr><td>닭 적혈구</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7201403</td><td>인플루엔자 바이러스가 TRIzol을 응집시키는 능력을 평가하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td></td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td>RNA</td></tr><tr><td>추출 Superscript III</td><td>Invitrogen</td><td>12574018</td><td>Reverse transcriptase</td></tr><tr><td>Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Isolation of amplified PCR product</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Transfection reagent</td></tr><tr><td>Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11013</td><td>Fluorescent secondary antibody for human 항체</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>쥐 항체용 형광 2차 항체</td></tr><tr><td>6-well polystyrene microplate</td><td>Corning, Inc.</td><td></td><td></td>353934</tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 장기 보관 극저온 튜브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5012-0020</td><td>바이러스 배양 상등액</td></tr><tr><td>재조합 A/California/04/09 (H1)</td>의 <td>HA 및 NA를 발현하는 Palese Laboratory 재조합 바이러스 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)의 내부 분절로</td><td></td><td></td></tr><tr><td>재조합 A/Shanghai/1/13 (H7)</td>A<td>/Shanghai/1/13 (H7N9)의 HA 및 NA를 A/푸에르토리코/8/34 (H1N1)의 내부 분절로 발현하는</td> <td>Palese Laboratory</td><td></td> 재조합 바이러스</tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen gel extration kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>DNA 단편의 실리카 멤브레인 기반 정제</td></tr></tbody></table>

인플루엔자 바이러스 단일 클론 항 체를 중화의 탈출 변종의 생성

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

인플루엔자 바이러스는 호스트 면역 반응을 회피 하 고 적응 하는 놀라운 능력을 전시 한다. 한 가지 방법은 바이러스의 표면 glycoproteins에서 발생 하는 항 원 변화를 통해 이다. 탈출 이체의 세대에 elucidating 바이러스 면역 검출을 탈출 하는 방법을 식별 하는 항 체 바인딩에 필요한 중요 한 잔류물에 강력한 방법입니다. 여기, 우리 인플루엔자 A 바이러스도 변종 바이러스 성 조류 (HA)에 대 한 감독 또는 murine 단일 클론 항 체 (mAbs)를 이용 하 여 생성 하는 방법에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 기술 사용 하 여 우리는 이전 중요 한 잔류물 머리 나는 새로운 조류 H7N9 하의 줄기를 대상으로 항 체 바인딩을 위한 필요한 특징. 프로토콜은 다른 바이러스 시스템에 쉽게 적용할 수 있습니다. 탈출 이체의 분석은 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp) 저항 및 바이러스, 부여 결정 항 원 편 류를 모델링 및 백신 치료제의 설계에 중요 합니다.

우리가 이전 계절 인플루엔자 바이러스 백신, H7N9 예방 접종, 또는 순차적 DNA/재조합 HA 단백질 예방 접종4,5 에 의해 유도 된 인간과 murine mAbs에 탈출 변종 생성 하이 방법의 사용 6,7. 위에서 설명한 항 체가 고 microneutralization 분석 실험 사용 하 여 다음4,5을 계속 하는 특정 프로토콜의 우리에 게 먼저 특징 이었다. 항 체 07-5 D 03, 07-5F01, 07-5 G 01, 07-4B03, 07-4E02, 07-4 D 05 조류 H7N9 바이러스 (A/상하이/1/2013) (표 1)에 대 한 안녕 고 중화 활동을 발견 하 고 따라서 프로토콜 1 (2.1 단계) 이용 되었다. S6-B01 (표 1), 042-100809-2F04, 045-051310-2B06, 41-5E04 등이 활동 부족 중화와 mAbs에 대 한 프로토콜 2 (2.2 단계) 탈출 변종을 생성 하 사용 되었다. 탈출 돌연변이 매핑 밝혀 항 체의 많은 바이러스 성 하4,5 (그림 4)에 다른 위치에서 중요 한 잔류물을 인식. 이 부정적인 항 체 줄기 지역4,5 탈출 점 돌연변이와 돌연변이 생성이 긍정적인 항 체의 대부분 있다 H7 하의 이전에 보고 된 항 원 사이트 근처 돌연변이 잔류물, 탈출 하는 동안 .
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>항 체</td>
			<td>안녕하세요 활동</td>
			<td>NEUT 활동</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5 D 03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5F01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5 G 01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4B03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4E02</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4 D 05</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41-5E04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>045-051310-2B06</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>042-100809-2F04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6-B01</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 항 체가 고 중화 활동의 테이블. 개인 실험 H7N9 백신 접종에서 고립 된 10 H7 전용 mAbs 전시 다른 시험관에 항 바이러스 활동5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">앞으로 뇌관 (5' 3')</td>
			<td colspan="4">반전 뇌관 (5' 3')</td>
			<td colspan="2">Thermocylcer 조건</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV</td>
			<td colspan="4">TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG</td>
			<td colspan="4">ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT</td>
			<td colspan="2">60 분 42 º C, 20 94 º C의 2 분/5 사이클 94 º C s, 30 50 º C s 3 분 30 s 68 º C 20 94 º C의 40 주기 다음 s, 58 ° C 30에 대 한 s 그리고 10 분 동안 68 º C에서 최종 확장 시간 3 분 30 s 68 º C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBV</td>
			<td colspan="4">GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC</td>
			<td colspan="4">CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC</td>
			<td colspan="2">60 분, 30 분 동안 55 ° C, 20 94 º C의 2 분/5 사이클 94 º C 45 º C s, 30 40 º C s 3 분 30 s 68 º C 20 94 º C의 40 주기 다음 s 58 º C 30에 대 한 s, 그리고 10 분 동안 68 º C에서 최종 확장 시간 3 분 30 s 68 º C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: 범용 인플루엔자 바이러스 뇌관. 인플루엔자 A27 B28 바이러스 및 그들의 각각 thermocycler 조건 하 세그먼트의 확대를 위한 뇌관 쌍.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig1.jpg"> 
그림 1: 안녕 분석 결과. 두 개의 마우스 H1 특정 mAbs 7B2 (머리 전용) 및 6F12 (스토킹 관련) 96-잘 V-하단 플레이트, 그리고 (B)는이 분석 결과23의 결과의 예를 사용 하 여 작업을 테스트 하는 분석 결과 설정에 대 한 도식 (A) A <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig2.jpg"> 
그림 2: Microneutralization 분석 결과. Microneutralization 분석 결과 두 인간의 mAbs 4D 055 와 CR911417의 활동을 테스트 설정에 대 한 도식 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig3.jpg"> 
그림 3: 탈출 돌연변이의 발생. 제안 하는 방법론은이 항 체에 의해 전시 microneutralization 활동에 종속 됩니다. (A)에 대 한 탈출 돌연변이 생성 중화이 긍정적인 항 체 필요할 수 있습니다. 계란, 단일 통로 (B) 항 체가 부정 중화 항 체 량 증가 함께 여러 구절을 포함 수 있습니다. 세포 조직 문화입니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig4.jpg"> 
그림 4:는 epitope 지도 새로운 조류 H7N9 하의 탈출 돌연변이 변형 생성의 예. 백신 유발 항 체 격리 후보와 개인에서 H7N9 인플루엔자 백신 탈출 돌연변이 변종을 생성 하는 데 사용 했다. 각 찌 꺼 기는 mAb의 효율적인 바인딩에 필요한 중요 한 아미노산의 위치 빨간 나타냅니다에 표시. 데이터는 Dunand 헨리 외., 20154에서 적응 했다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

우리는 우리가 대상으로 인플루엔자 A 바이러스의 바이러스 성 조류 인간 또는 murine 단일 클론 항 체의 바인딩을에 필요한 중요 한 잔류물을 식별 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜은 다른 바이러스 표면 glycoproteins 그리고 그들의 해당 중화 항 체에 적용할 수 있습니다.

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

이 방법의 전반적인 목표는 중화 단클론 항체의 에피토프를 규명하는 구체적인 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이 방법은 숙주-바이러스 상호작용을 정의하고, 치료제 및 진단 도구를 개발하는 등 면역학 및 바이러스학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 이 모든 과정은 백신 설계에 기여할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특수 기기나 장비 없이 기본적인 조직 배양 및 분자 생물학 기법만으로 수행할 수 있다는 점입니다.시연은 Peter Palese 연구실의 MD, PhD 과정 학생인 Mark Bailey가 진행하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로, 혈구 응집 억제(hemoagglutination inhibition, HI) 및 중화 활성을 기반으로 한 항체 특성 분석부터 이 절차를 시작하십시오. HI 활성을 가진 중화 항체는 먼저 관심 항체를 1배 PBS에 희석하여 농도가 증가하는 네 가지 희석액을 각 희석당 100 µL 부피로 준비함으로써 추가 분석을 수행합니다.다음으로, 1배 PBS에 1mL당 100만 plaque-forming unit의 농도로 바이러스 스톡을 400µL 부피로 준비합니다. 그런 다음, 1mL당 100만 plaque-forming unit의 바이러스 100µL를 각 항체 희석액 100µL 또는 1배 PBS 100µL와 혼합합니다. 샘플을 5% CO₂가 포함된 37°C 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다.짧게 볼텍싱한 후, 각 혼합물 200 µL를 특정 병원균이 없는 유정란에 주입합니다. 그 후, 이산화탄소 없이 37 °C에서 40~44시간 동안 유정란을 배양합니다. 배양이 끝나면, 유정란을 4 °C에서 최소 6시간 동안 보관하여 바이러스에 감염된 배아를 희생시킵니다.다음으로, 이전에 설명한 것과 같이 계란에서 요막액을 수확합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 HI 분석을 수행하여 탈출 변이체를 확인합니다. HI 활성이 없는 중화 항체에 대한 탈출 변이체를 생성하려면, 항체의 양을 점진적으로 늘려가며 바이러스를 계대 배양해야 합니다.6-웰 플레이트에 MDCK 세포를 웰당 100만 개의 밀도로 분주합니다. 5% carbon dioxide가 포함된 37°C 인큐베이터에서 세포를 최소 4시간 동안 배양합니다. 그동안 바이러스 스톡을 mL당 100만 plaque-forming units 농도로 희석합니다.TPCK 처리된 트립신이 포함된 1배 MEM에서 0.02 mg/mL 농도의 항체 희석액 250 µL를 준비합니다. 이후의 모든 계대 배양에는 더 높은 농도의 항체를 사용하십시오. 희석된 바이러스 250 µL를 희석된 항체 250 µL와 혼합하거나, 항체 미처리 대조군으로 1배 MEM 250 µL를 혼합합니다.바이러스-항체 혼합물을 5% 이산화탄소가 포함된 37°C 배양기에서 30분 동안 배양합니다. 세포 배양이 끝나면 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 배지를 흡입 제거하고, 1 mL의 1x PBS로 세포 단층을 세척합니다. 혼합물 500 µL를 웰에 넣고 5% 이산화탄소가 포함된 37°C 배양기에서 1시간 동안 배양합니다.1시간 후, TPCK 처리된 trypsin이 포함된 1배 MEM 2mL를 각 웰에 추가합니다. 감염 48시간 후에 현미경으로 세포병성 효과(cytopathic effect, CPE) 징후를 확인하거나, 혈구응집 시험을 수행하여 바이러스 증식 여부를 검출합니다. 항체를 추가한 배양액에서 CPE 증식이 확인되면, 상층액을 여러 개의 크라이오튜브에 수집합니다.튜브에 계대 횟수를 표시하여 -80 °C에서 보관하십시오. 상층액 100 µL를 따로 보관하여 TPCK trypsin과 항체가 첨가된 1× MEM 2 mL를 사용하여 신선한 MDCK 단일층에 감염시키십시오. 매 계대마다 항체 무첨가 대조군을 반드시 포함하시기 바랍니다.최종 항체 농도가 0.6 mg/mL일 때도 바이러스 성장이 가능할 때까지, 매 계대마다 항체 농도를 점진적으로 높입니다. 각 계대별 상청액을 여러 개의 바이알에 나누어 담아 -80 °C에서 냉동 보관합니다. 텍스트 프로토콜에 상세히 기재된 대로 탈출 변이체의 분리 및 분석 단계를 계속 진행합니다.후보 H7N9 인플루엔자 A 백신을 접종한 개인으로부터 분리한 백신 유도 항체를 사용하여 escape mutant 변이체를 생성했습니다. Escape mutant 매핑 결과, 많은 항체가 바이러스 HA의 서로 다른 위치에 있는 주요 잔기를 인식하는 것으로 나타났습니다. 빨간색으로 표시된 각 잔기는 단클론 항체의 효율적인 결합에 필요한 핵심 아미노산의 위치를 나타내며, 대부분의 HI 양성 항체는 이전에 보고된 H7HA의 항원 결정기 부근에서 escape mutant 잔기를 가졌습니다. HI 음성 항체는 스토크(stock) 영역에서 점 돌연변이가 있는 escape mutant를 생성했습니다.이 기술을 숙달하면 다른 병원체에 대한 보호의 구조적 결정 요인을 규명하는 데 적용할 수 있습니다. 이 기술은 단클론 항체의 회피 변이체 생성뿐만 아니라 항바이러스 화합물에 대한 변이체 생성에도 제한 없이 적용 가능합니다. 이 영상을 시청한 후에는 in vitro에서 회피 변이체를 생성하여 단클론 항체의 결합 에피토프를 규명하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 절차를 수행할 때, 바이러스를 다루는 과정에서 주의를 기울이고 적절한 개인 보호 장구를 사용하는 것이 중요함을 기억하십시오.

generation-escape-variants-neutralizing-influenza-virus-monoclonal

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 중화 인플루엔자 바이러스 단클론 항체의 탈출 변종을 생성하는 기술을 보여줍니다. 항체 중화 바이러스 현탁액을 배아 계란에 주입하여 탈출 변이체를 선택적으로 증식시킵니다. 그 결과 주로 탈출 변이체의 바이러스 집단이 발생하며, 이는 Hemagglutination 분석을 통해 확인되었습니다.

중화 항체에 대한 인플루엔자 바이러스 탈출 변이의 생성

이 비디오는 한랭 적응 재조합 인플루엔자 바이러스를 만드는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 인간 세포를 양방향 플라스미드로 형질주입한 후 저온 배양에서 배양하여 백신 생산에 적합한 바이러스를 생성하며, 따뜻한 조건에서 복제가 감소하는 것이 특징입니다.

백신을 위한 재조합 생독감 인플루엔자 바이러스 생성

복제 cDNA를 같은 유전자를 역 참조 방식에서 재조합 arenaviruses의 구조는 연구자 arenavirus의 생물학의 다양한 측면, 특정 바이러스 유전자 산물의 역할뿐만 아니라, 서로 다른 특정 도메인 및 잔류의 기여를 조사 할 수 있습니다 . 마찬가지로, 인간의 병원성 arenaviruses을 방지하기 위해 효과적이고 안전한 백신의 생성에 새로운 가능성을 제공하는 백신 개발을위한 FDA 승인 세포주 (베로)의 유전학 기술을 역으로 수행합니다.

FDA 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 Arenavirus의 생성

여기에서 우리는 곤충 세포에 새로운 중국어 H7N9 바이러스에서 파생 제대로 접혀 기능 인플루엔자 바이러스 표면 항원을 표현하는 방법에 대해 설명합니다. 기술은 어떤 바이러스 성 또는 세포 표면 단백질의 ectodomains을 표현하도록 할 수있다.

배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 소설 H7N9 인플루엔자 바이러스의 기능 재조합 적혈구 응집소와 뉴 라미니다 아제 단백질의 발현

하이브리도마 기술을 기반으로 한 단클론 항체 생성을 위해 최적화된 프로토콜이 제시됩니다. 마우스는 면역접합체로 면역되었습니다. 비장 세포는 PEG와 전기 충격에 의해 불멸의 골수종 세포와 융합되었습니다. 항체 생산 하이브리도마 세포는 HAT 및 항원 특이적 ELISA 스크리닝에 의해 선택되었습니다.

하이 브리 도마 기술에 의해 쥐 단일 클론 항체의 생성

이 연구는 설명   영상 기반의 마이크로 중화 분석은 바이러스의 항원 성 관계를 분석합니다. 이 프로토콜은 평판 스캐너를 사용하고 적정, 적정 정량, 중화, 중화 정량 등 4 단계가있다. 분석은 현재 순환 인플루엔자 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 바이러스와 함께 잘 작동합니다.

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

항 체에 의해 그 대상 인플루엔자 바이러스 조류 Fc 중재 effector 기능 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 또한 Fc 중재 면역 유도의 단일 클론 항 체 또는 polyclonal 세라 다른 바이러스 표면 glycoproteins를 대상으로 능력을 평가 하기 위해 적응 수 있습니다.

독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 Fc 중재 Effector 기능을 평가 하는 방법

인플루엔자 중화 항 체는 인플루엔자 감염의 보호와 연관. Microneutralization 분석 실험 인간 혈 청의 중화 항 체를 측정 하 고 자주 독감 인간의 혈 청 학에 대 한 사용 됩니다. 인플루엔자 예방 접종 또는 감염 다음 현대 3C.2a 및 3C.3a A(H3N2) 바이러스 중화 항 체 titers 측정 MDCK-SIAT1 세포를 사용 하 여 microneutralization 분석 결과 설명 합니다.

사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 Microneutralization에 의해 인간의 세라에 A(H3N2) 바이러스를 중화

높은 처리량,이 연구에 설명 합니다 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 특정 중화 항 체 titer를 확인 하려면 이미징 기반 마이크로 중화 분석 결과. 이 분석 결과 형식은 다른 샘플 형식에 대해 테스트 되었습니다.

향상 된 높은 처리량 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV) 마이크로 중화 분석 결과

이 프로토콜은 2개의 인플루엔자 A 긴장에서 봉투 당단백질을 가진 높은 역가 감염성 바이러스성 의사 입자 (pp)를 생성하는 실험 적인 프로세스및 그들의 감염성을 결정하는 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 다른 봉투 당단백질을 가진 봉투바이러스의 그밖 모형의 pps를 개발하기 위하여 높게 적응합니다.

고병원성 H5N1 및 조류 H7N9 바이러스의 엔벨로프 당단백질을 가진 고적퇴력 감염성 인플루엔자 슈도타입 입자 의 생산

이 프로토콜은 SARS-CoV-2 변이체의 감염성과 중화 항체에 대한 민감도를 신속하게 정량화하기 위한 플랫폼으로 새로운 하이브리드 알파바이러스-SARS-CoV-2 슈도바이러스(Ha-CoV-2)의 적용을 설명합니다.

SARS-CoV-2 변이체 및 중화 항체의 신속한 정량화를 위한 Ha-CoV-2 슈도바이러스 적용

학습하세요 인플루엔자 A 바이러스 혈구응집소 억제 및 중화 활성을 이용한 단일 클론 항체 표위 분석 방법입니다. 이 기술은 백신 설계와 바이러스 저항 메커니즘 이해에 활용됩니다.

인플루엔자 바이러스 단일 클론 항 체를 중화의 탈출 변종의 생성

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