인플루엔자 바이러스 단일 클론 항 체를 중화의 탈출 변종의 생성

이 방법의 전반적인 목표는 중화 단클론 항체의 항원결정기를 규명하는 방법에 대한 작업 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이 방법은 숙주 바이러스 상호 작용을 정의하고 치료법 및 진단 도구를 개발하는 데 도움이 될 수 있는 면역학 및 바이러스학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이 모든 것은 백신 설계에 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특별한 도구나 장비 없이 기본 조직 배양 및 분자 생물학 기술로 수행할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 Peter Palese 연구실의 MD, PhD 학생인 Mark Bailey입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 혈응집 억제(HI) 및 중화 활성을 기반으로 하는 항체의 특성화로 이 절차를 시작합니다. HI 활성을 갖는 중화 항체는 먼저 희석액당 100마이크로리터의 부피로 1배 PBS에서 농도를 증가시키는 관심 항체의 4가지 희석액을 준비하여 추가로 분석합니다.

다음으로, 400마이크로리터 부피에서 PBS의 1배로 밀리리터당 100만 개의 플라크 형성 단위의 바이러스 스톡을 준비합니다. 그런 다음 바이러스 1밀리리터당 100만 플라크 형성 단위의 100마이크로리터를 각 항체 희석액 100마이크로리터 또는 PBS의 1배인 100마이크로리터와 혼합합니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소로 샘플을 1시간 동안 배양합니다.

잠시 와류를 일으킨 후 각 혼합물 200마이크로리터를 특정 병원체가 없는 배아 계란에 주입합니다. 그런 다음 이산화탄소가 없는 섭씨 37도에서 40-44시간 동안 알을 품습니다. 부화 후 바이러스에 감염된 배아 난자를 섭씨 4도에서 최소 6시간 동안 놓아 희생합니다.

다음으로, 앞서 설명한 대로 계란에서 알란토스 액체를 수확합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 HI assay를 수행하여 escape variant를 확인합니다. HI 활성이 부족한 중화 항체에 대한 탈출 변이체를 생성하려면 증가하는 항체가 존재하는 상태에서 바이러스를 통과해야 합니다.

MDCK 세포를 6웰 플레이트에 웰당 100만 개의 세포 밀도로 플레이트화합니다. 5%의 이산화탄소가 함유된 섭씨 37도의 인큐베이터에서 최소 4시간 동안 세포를 배양합니다. 한편, 바이러스 재고를 밀리리터당 100만 개의 플라크 형성 단위로 희석합니다.

250 μl 용량의 TPCK 처리 트립신을 사용하여 1 회 MEM에서 밀리리터당 0.02 밀리그램의 항체 단일 희석액을 준비합니다. 다음의 모든 계대에 대해 더 높은 항체 농도를 사용하십시오. 250마이크로리터의 희석된 바이러스와 250마이크로리터의 희석된 항체 또는 250마이크로리터의 MEM을 무항체 대조군으로 혼합합니다.

바이러스 항체 혼합물을 섭씨 37도의 인큐베이터에서 30% 이산화탄소로 5분 동안 배양합니다. 세포를 배양한 후 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 배지를 흡인하고 PBS의 1 밀리리터로 세포의 단층을 세척합니다. 500마이크로리터의 혼합물을 웰에 넣은 후 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소를 1시간 동안 배양합니다.

1시간 후, 웰에 1배 MEM의 2밀리리터에 TPCK 처리된 트립신을 보충합니다. 감염 후 48시간이 지나면 현미경으로 세포병성 효과(CPE)의 징후를 확인하거나 혈응집 분석을 수행하여 바이러스 성장을 감지합니다. 항체가 보충된 배양액에 성장 CPE가 있는 경우, 여러 cryotubes에서 상등액을 수확합니다.

튜브에 통로 번호를 표시하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. TPCK 트립신과 항체가 보충된 1배 MEM의 2밀리리터로 MDCK의 새로운 단층을 감염시키기 위해 100마이크로리터의 상등액을 절약하십시오. 모든 통로에 대해 항체가 없는 대조군을 포함하는 것을 잊지 마십시오.

최종 농도가 항체 1밀리리터당 0.6mg이라도 바이러스 성장이 여전히 생존할 수 있을 때까지 연속적인 각 계대에서 항체 농도를 증가시킵니다. 각 통로의 상등액 여러 바이알을 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. text protocol에 자세히 설명된 대로 escaped variants의 분리 및 분석을 계속합니다.

후보 H7N9 인플루엔자 A 백신을 접종한 개인으로부터 분리된 백신 유도 항체를 사용하여 탈출 돌연변이 변이를 생성했습니다. 탈출 돌연변이 매핑은 많은 항체가 바이러스 HA의 고유한 위치에서 중요한 잔류물을 인식하는 것으로 나타났습니다. 빨간색으로 표시된 각 잔기는 단클론 항체의 효율적인 결합에 필요한 중요 아미노산의 위치를 나타내는 반면, 대부분의 HI 양성 항체는 이전에 보고된 H7HA의 항원 부위 근처에서 돌연변이 잔기를 탈출했습니다. HI-음성 항체는 스톡 영역에 점 돌연변이가 있는 탈출 돌연변이를 생성했습니다.

일단 숙달되면 이 기술을 적용하여 다른 병원체에 대한 보호의 구조적 결정 요인을 설명할 수 있습니다. 이 기술은 단클론 항체의 탈출 변형체를 생성하는 것뿐만 아니라 항바이러스 화합물에 대해서도 생성합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 in vitro에서 탈출 변이체를 생성하여 단클론 항체의 결합 항원결정기를 밝히는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안 바이러스로 작업할 때 주의하고 적절한 개인 보호 장비를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.