인플루엔자 바이러스 단일 클론 항 체를 중화의 탈출 변종의 생성

이 방법의 전반적인 목표는 중화 단클론 항체의 에피토프를 규명하는 구체적인 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이 방법은 숙주-바이러스 상호작용을 정의하고, 치료제 및 진단 도구를 개발하는 등 면역학 및 바이러스학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 이 모든 과정은 백신 설계에 기여할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특수 기기나 장비 없이 기본적인 조직 배양 및 분자 생물학 기법만으로 수행할 수 있다는 점입니다.

시연은 Peter Palese 연구실의 MD, PhD 과정 학생인 Mark Bailey가 진행하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로, 혈구 응집 억제(hemoagglutination inhibition, HI) 및 중화 활성을 기반으로 한 항체 특성 분석부터 이 절차를 시작하십시오. HI 활성을 가진 중화 항체는 먼저 관심 항체를 1배 PBS에 희석하여 농도가 증가하는 네 가지 희석액을 각 희석당 100 µL 부피로 준비함으로써 추가 분석을 수행합니다.

다음으로, 1배 PBS에 1mL당 100만 plaque-forming unit의 농도로 바이러스 스톡을 400µL 부피로 준비합니다. 그런 다음, 1mL당 100만 plaque-forming unit의 바이러스 100µL를 각 항체 희석액 100µL 또는 1배 PBS 100µL와 혼합합니다. 샘플을 5% CO₂가 포함된 37°C 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다.

짧게 볼텍싱한 후, 각 혼합물 200 µL를 특정 병원균이 없는 유정란에 주입합니다. 그 후, 이산화탄소 없이 37 °C에서 40~44시간 동안 유정란을 배양합니다. 배양이 끝나면, 유정란을 4 °C에서 최소 6시간 동안 보관하여 바이러스에 감염된 배아를 희생시킵니다.

다음으로, 이전에 설명한 것과 같이 계란에서 요막액을 수확합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 HI 분석을 수행하여 탈출 변이체를 확인합니다. HI 활성이 없는 중화 항체에 대한 탈출 변이체를 생성하려면, 항체의 양을 점진적으로 늘려가며 바이러스를 계대 배양해야 합니다.

6-웰 플레이트에 MDCK 세포를 웰당 100만 개의 밀도로 분주합니다. 5% carbon dioxide가 포함된 37°C 인큐베이터에서 세포를 최소 4시간 동안 배양합니다. 그동안 바이러스 스톡을 mL당 100만 plaque-forming units 농도로 희석합니다.

TPCK 처리된 트립신이 포함된 1배 MEM에서 0.02 mg/mL 농도의 항체 희석액 250 µL를 준비합니다. 이후의 모든 계대 배양에는 더 높은 농도의 항체를 사용하십시오. 희석된 바이러스 250 µL를 희석된 항체 250 µL와 혼합하거나, 항체 미처리 대조군으로 1배 MEM 250 µL를 혼합합니다.

바이러스-항체 혼합물을 5% 이산화탄소가 포함된 37°C 배양기에서 30분 동안 배양합니다. 세포 배양이 끝나면 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 배지를 흡입 제거하고, 1 mL의 1x PBS로 세포 단층을 세척합니다. 혼합물 500 µL를 웰에 넣고 5% 이산화탄소가 포함된 37°C 배양기에서 1시간 동안 배양합니다.

1시간 후, TPCK 처리된 trypsin이 포함된 1배 MEM 2mL를 각 웰에 추가합니다. 감염 48시간 후에 현미경으로 세포병성 효과(cytopathic effect, CPE) 징후를 확인하거나, 혈구응집 시험을 수행하여 바이러스 증식 여부를 검출합니다. 항체를 추가한 배양액에서 CPE 증식이 확인되면, 상층액을 여러 개의 크라이오튜브에 수집합니다.

튜브에 계대 횟수를 표시하여 -80 °C에서 보관하십시오. 상층액 100 µL를 따로 보관하여 TPCK trypsin과 항체가 첨가된 1× MEM 2 mL를 사용하여 신선한 MDCK 단일층에 감염시키십시오. 매 계대마다 항체 무첨가 대조군을 반드시 포함하시기 바랍니다.

최종 항체 농도가 0.6 mg/mL일 때도 바이러스 성장이 가능할 때까지, 매 계대마다 항체 농도를 점진적으로 높입니다. 각 계대별 상청액을 여러 개의 바이알에 나누어 담아 -80 °C에서 냉동 보관합니다. 텍스트 프로토콜에 상세히 기재된 대로 탈출 변이체의 분리 및 분석 단계를 계속 진행합니다.

후보 H7N9 인플루엔자 A 백신을 접종한 개인으로부터 분리한 백신 유도 항체를 사용하여 escape mutant 변이체를 생성했습니다. Escape mutant 매핑 결과, 많은 항체가 바이러스 HA의 서로 다른 위치에 있는 주요 잔기를 인식하는 것으로 나타났습니다. 빨간색으로 표시된 각 잔기는 단클론 항체의 효율적인 결합에 필요한 핵심 아미노산의 위치를 나타내며, 대부분의 HI 양성 항체는 이전에 보고된 H7HA의 항원 결정기 부근에서 escape mutant 잔기를 가졌습니다. HI 음성 항체는 스토크(stock) 영역에서 점 돌연변이가 있는 escape mutant를 생성했습니다.

이 기술을 숙달하면 다른 병원체에 대한 보호의 구조적 결정 요인을 규명하는 데 적용할 수 있습니다. 이 기술은 단클론 항체의 회피 변이체 생성뿐만 아니라 항바이러스 화합물에 대한 변이체 생성에도 제한 없이 적용 가능합니다. 이 영상을 시청한 후에는 in vitro에서 회피 변이체를 생성하여 단클론 항체의 결합 에피토프를 규명하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 수행할 때, 바이러스를 다루는 과정에서 주의를 기울이고 적절한 개인 보호 장구를 사용하는 것이 중요함을 기억하십시오.