Name: 화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: 학습하세요 화학 유인 그라데이션에서 다중 세포 반응을 3D 분석하는 PDMS 기반 장치 제작 방법을. 이 기술은 조직체를 활용하여 약한 신호를 효과적으로 감지하고 세포 행동을 연구할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공합니다.

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이 작업은 AJE (NSF PD-11-7246, 유방암 연구 재단 (BCRF-17-048) 및 NCI U54 CA210173) 및 AL (U54CA209992)에 대 한 보조금에 의해 지원 되었다.

모든 동물 작업은 검토 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 진행 되었다, 존스 홉킨스 대학, 의학의 학교.
1. mesofluidic 장치의 제작
<ol><li>3D CAD 소프트웨어를 사용 하 여 PDMS 장치용 몰드 마스크를 설계 합니다.</li>
	<li>열 저항 수 지가 있는 스테레오 리소 그래피 장비를 사용 하 여 금형을 인쇄 합니다. 참고: 여기에 설명 된 절차는 상업용 3D 프린팅 서비스에 의해 수행 되었습니다.</li>
	<li>경화제와 함께 PDMS 모노 머 용액을 10:1 비율로 철저히 섞어 줍니다. 3 mL의 PDMS 혼합물을 소자의 제조에 요구 하였다. 총 체적은 조작 하는 금형의 수에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>진공을 적용 하 여 혼합물을 가스 제거 하 고 1 시간 동안 내부 실험실 진공 또는 진공 건조 기에 감압 펌프를 사용 한다.</li>
	<li>접착 테이프로 몰드 표면을 살짝 두 드려 먼지를 제거한 다음 PDMS 혼합물을 몰드에 부 어 넣습니다. 거품이 공정에 도입 되는 경우, 진공 건조제에 탈 기를 반복 한다. 금형의 기둥 사이에 갇힌 기포는 날카로운 바늘로 파고 하 여 제거 할 수 있습니다. 참고: 실 온에서의 탈 기 공정은 1 시간 이내에 이루어져야 합니다.</li>
	<li>80 ° c에서 2 시간 동안가 열 하 여 PDMS를 경화 시킨다. 몰드가 실 온에서 냉각 되도록 합니다.</li>
	<li>블레이드를 사용 하 여 몰드와 PDMS 사이의 경계를 자른 다음 몰드에서 PDMS를 조심 스럽게 벗 겨 냅니다.</li>
	<li>22 mm x 22mm 커버 슬립에 맞게 PDMS 파트를 트림 하 고 입구에 구멍을 뚫습니다. 참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.</li>
	<li>낮은 보풀 조직으로 표면을 닦 고 70% 에탄올로 PDMS 부분과 22mm x 22mm 커버 슬립을 청소 합니다. 그런 다음 접착 테이프로 큰 먼지 입자를 제거 합니다.</li>
	<li>PDMS 부품과 커버 슬립을 자동 멸 균 (121 ° c, 습식 15 분간 건조) 또는 1 시간 동안 자외선에 노출 시키는 방법으로 소독 합니다.</li>
	<li>조직 배양 후드에 5 분간 코로나 방전 총으로 PDMS 파트와 커버 슬립의 바닥면을 처리 한 후 함께 결합 한다. 주의: 폴리스 티 렌 폼과 같은 비 전도성 물질을 바닥에 놓고이 과정에서 모든 전도 물질을 제거 하십시오. 콜라겐 젤과 유리 커버 슬립 사이의 결합을 증가 시키기 위해 치료 후 5 분 이내에 즉시 장치에 교원 질을 주입 하십시오.</li>
</ol>2. 세포 준비: 1 차 유 방 관 능 분리
참고: 유 방 관 능 분리의 세부 사항은 이전 작업11에서 찾을 수 있습니다. 임의의 종류의 단일 세포 또는 관 능 노이 드를 자신의 절연/분리 프로토콜에 따라 제조할 수 있다.
<ol><li>쥐의 유선 조직을 메스로 하 여 조직을 이완 하 고 37 ° c에서 30 분 동안 50 mL의 콜라 게 나 제/트립 신 용액 (마우스 당 10ml)의 0.1 g을 사용 하 여 보충 하 고, 트립 신과 콜라 게 나 제, 0.1의 g , FBS의 5 mL, 1 μ g/m l 250 μ l 및 50 μ g/mL 겐 타 마이 신의 50 μ l.</li>
	<li>콜라 게 나아 제/트립 신 용액을 10 분 동안 1250 x g 에서 원심 분리 하 여 흡 인에 의해 상층 액을 제거 한다. DMEM의 10ml의 세포를 분산 시키고 10 분 동안 1250 x g 에서 원심 분리기를 분리 합니다. 흡 인에 의해 DMEM/F12를 제거한 후, DNase (2 단위/μ l)의 40 μ l로 보충 된 4Ml/f12 DMEM의 세포를 재 중단 하십시오.</li>
	<li>2-5 분 동안 DNase 용액을 손으로 흔들고 10 분간 1250 x g 에서 원심 분리 합니다.</li>
	<li>단일 세포에서 4 개의 차동 원심 분리 (펄스-1250 x g )를 통해 소기관을 분리할 수 있으며 의도 한 속도에 도달한 후 원심 분리기 3-4을 중지 합니다. 각 펄스 사이에, 상층 액을 흡 인 하 고 10ml의 DMEM/F12에서 펠 렛을 소생 한다.</li>
	<li>콜라겐 준비를 위해 1% 페니실린/streptomycin와 1% 인슐린 트랜스 페 린-셀 렌-X와 DMEM의 원하는 양의 성장 배지의 최종 펠 렛을 재 일시 중단 하십시오.</li>
</ol>3. 콜라겐 준비 및 주입
참고: 다른 유형의 ECM 젤은 자체 겔 화 프로토콜에 따라 제조할 수 있습니다.
<ol><li>콜라겐 타입 I 용액 (3.78 mg/ml)을 준비 하 고, 10 배 DMEM, 1nnaoh 용액을 얼음에 정상적인 성장 배지로 제조 하였다. 참고: 절차가 완료 될 때까지 얼음을 보관 하십시오.</li>
	<li>1 N NaOH 용액 6 μ l를 추가 하 고, 200 μ l의 성장 배지 및 50 μ l의 DMEM을 미리 냉장 된 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣고 용액을 완전히 섞어 줍니다.</li>
	<li>425 μ l의 콜라겐을 미리 혼합 된 용액에 넣고 파이 펫 팅을 통해 철저히 섞어 줍니다.</li>
	<li>콜라겐 혼합물을 짧게 (5 초 미만) 원심 분리 하 여 혼합물 로부터 기포를 제거 한다.</li>
	<li>중성화 된 콜라겐 용액을 얼음 위에 1 시간 동안 보관 하 여 섬유 형성을 유도 한다.</li>
	<li>세포 현 탁 액의 50 μ l을 콜라겐 혼합물에 넣고 완전히 섞어 줍니다. 참고: 최종 콜라겐 농도는 2mg/ml입니다.</li>
	<li>전체 챔버가 채워질 때까지 PDMS 디바이스의 입구를 통해 200 μ l pipet를 사용 하 여 용액을 주입 한다. 콜라겐 혼합물이 기둥의 틈새를 통과 하는 경우, 겔 화 후에 날카로운 외과 잎으로 과잉 콜라겐 젤을 잘라냅니다.</li>
	<li>상기 장치를 배양 기에 37 ° c에서 1 시간 동안 5% co2로 유지 하 여 겔 화를 유도 한다.</li>
	<li>양쪽에 있는 저장소를 성장 매체로 채우고 공초점 이미징이 수행 될 때까지 5% CO2를 사용 하 여 37 ° c의 인큐베이터에 장치를 보관 하십시오.</li>
</ol>4.3D 이미징 및 정량화
<ol><li>라이브 셀 이미징 배양 챔버를 공초점 현미경에 설치 하 고 온도와 CO2 내지 37을 각각 미리 설정 한다. 습도를 높이기 위해 챔버의 저수지에 물을 추가 하 고 필요한 경우 젖은 물티슈를 챔버에 놓습니다.</li>
	<li>챔버에 PDMS 디바이스를 배치 하 고 그라데이션 형성에서 EGF의 ' 소스 '로 서 하나의 저장소에 EGF를 추가 한다. 다른 저장소는 공간적으로 등급을 매긴 EGF 분포의 개발에 필요한 ' 싱크 '를 제공 합니다. 2.5 nM의 EGF를이 연구에서 0.5 nM/mm의 기울기를 만들기 위한 싱크에 첨가 하였다.</li>
	<li>관심 있는 소기관의 부피를 덮는 Z 스택의 범위를 설정 하 고 이미징을 시작 합니다. 주의: 광 독성을 피하려면 공초점 이미징에서 낮은 레이저 강도를 시도 하거나 다중 광자 이미징 기술을 사용 하십시오.</li>
	<li>상업용 소프트웨어나 사용자 지정 프로그램을 사용 하 여 2D 이미지 스택에서 3D 이미지를 재구성할 수도 있습니다. 소기관 또는 개별 세포의 이동 으로부터 연장 되는 지점의 길이와 각도를 측정 한다. 여기서, ImageJ를 사용 하 여 상기 관 능 체를 중심으로 자유형 윤곽을 그려 정량화를 수행 한다.</li>
</ol>

<ol><li>Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+extracellular+matrix+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).</li>
<li>Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+emerging+paradigms+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins: emerging paradigms of signal transduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Stem+Cell+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Engineering Stem Cell Organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li>
<li>Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+3D+matrix+microenvironment+regulates+cell+migration+through+spatiotemporal+dynamics+of+contractility-dependent+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions.</a> Nature Communications. 6, 8720(2015).</li>
<li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry+%28Palo+Alto%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Zervantonakis, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li>
<li>Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluidic+device+to+study+directional+angiogenesis+in+complex+tissue+and+organ+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models.</a> Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+lapse+investigation+of+antibiotic+susceptibility+using+a+microfluidic+linear+gradient+3D+culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).</li>
<li>Ellison, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+enhances+the+capacity+of+cell+ensembles+to+sense+shallow+gradients+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li>
</ol>

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PDMS 몰드의 제작은 상업용 3D 프린팅 서비스를 사용 하 여 수행 되었지만, 사내 하이 엔드 3D 프린터로도 수행할 수 있습니다. 다양 한 3D 제작 방법 중에서 입체 리소 그래피는 고해상도 몰드 생성에 권장 됩니다. PDMS 경화는 고온 (80 ° c)에서 발생 하기 때문에 인쇄를 아웃소싱 할 경우 재료는 충분히 열적으로 내성이 있어야 하며이를 명시적으로 지정 해야 합니다. 열 후 경화는 부품의 열 저항을 높이기 위해 인쇄 서비스 회사와 논의 할 수 있습니다. 인쇄 서비스 및 재료의 세부 사항은 재료 표에명시 되어 있습니다.
경화 된 PDMS의 기계적 성질은 경화 온도에 따라 달라진 다. PDMS 혼합물을 오븐에서 경화 하기 전에 오랜 시간 동안 실 온에서 보관 하면, 완전 경화 후에도 너무 탄성이 된다. 따라서, 실 온에서의 탈 기 공정은 1 시간 이내에 이루어져야 한다. 탈 기는 PDMS 내의 미세 기포를 제거 하는 데 도움을 줄 수 있는 ...

생리 적 환경에서 세포는 셀 외 기질 (ECM)에 내장 되어 과다 한 생체 분자에 노출 됩니다. 세포와 주변 미세 환경 사이의 상호 작용은 마이그레이션, 성장, 분화 및 생존1을포함 하 여 다양 한 표현 형을 제어 하는 세포내 프로세스를 조절 합니다. 많은 것은 종래의 2D 세포 배양에서 세포 거동에 대해 배웠다. 그러나 3D 하이드로 겔에 내장 된 세포에 대 한 생체 내 이미징 및 실험의 출현으로, 세포 거동에 중요 한 차이는 간단한 2D 시험관 내 배양과 3D 조직 유사 환경에서 인식 되었습니다. 셀이 ECM 섬유와 상호 작용 하 고 3D 매트릭스 내에서 기계적 특성을 감지 하는 동안 젤의 재료 강성은 2D 시험관 시스템에서 완전히 독립 된 변수가 아닙니다. 차원은 초점 부착 형성을 변경 하 여 다른 세포 형태학과 행동을 초래 합니다. 또한 2D 표면의 셀은 3D에서 모든 방향으로 열린 셀 보다 더 적은 신호 전달에 노출 됩니다.
이러한 한계는 생체 조직의 공간적 및 화학적 복잡성을 나타내고 체 내 조직 기능을 더 잘 예측 하는 3D 시스템에 대 한 관심을 증가 시켰습니다. 그들은 ECM3,4에 무작위로 산재 된 세포에 세포 마이크로 구조체를 자체 조립 하는 것과 같은 다양 한 형태로 개발 되었습니다. 미세 제조 기술의 최근 진보는 표현 형 변화를 연구 하기 위한 3d 배양 시스템 (5,6,7,8,9 )의 출현을 촉진 하 고 가용성 신호에 대 한 세포 반응; 그러나, 기술 장벽은 연구 실험실에서 널리 사용을 제한 합니다. 대부분의 경우 제작 공정에는 포토 리소 그래피 기법과 배경 지식을이 필요 합니다. 더욱이, 장치를 성공적으로 구축 하 고 장기간에 걸쳐 장치의 최적 기능을 달성 하기 위해 다양 한 요인을 제어 해야 합니다.
우리의 방법은 정의 된 화학 유인 구배와 함께 3 차원 미세 환경에 세포 및 멀티 세포 소기관을 통합 하 고 EGF10에 대 한 상피 반응을 분석 하기 위한 3d PDMS 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 당사의 데이터에의 하면, 얕은 EGF 그라데이션에 반응 하는 소기관의 용량은 갭 접합부를 통한 세포 간 화학적 커플링에서 발생 합니다. 이는 취약 하 고 시끄러운 공간적으로 등급이 매겨진 입력을 보다 정밀 하 게 감지할 수 있는 소기관의 가능성을 시사 합니다. 제조 공정은 청정 실 시설이 나 포토 리소 그래피 기술이 필요 하지 않습니다. 그러나, 3D PDMS 디바이스는 3D 생리학적 환경의 필요한 요인을 포함 한다. 이 방법은 3D 셀룰러 동작을 연구 하는 데 도움이 될 것 이며 다른 세포 유형, chemoattractants 및 ECM 조합으로 큰 연구 잠재력이 있습니다.

<table><tbody><tr><td>22mm x 22mm 커버슬립&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 I, 랫</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>CB-40236</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐이즈</td><td>시그마-알드리치</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>COMSOL 다중물리 4.2</td><td>COMSOL Inc</td><td></td><td>확산 역학 시뮬레이션에 사용</td></tr><tr><td>10x DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2429</td><td></td></tr><tr><td>DEME/F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4623</td><td></td></tr><tr><td>EGF 재조합 마우스 단백질</td><td>Thermo Fisher</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td></td><td></td><td>분기 길이와 각도를 측정하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>5750-060</td><td></td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>비트플레인</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마-알드리치</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>인슐린-트랜스페린-셀레늄-X</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>저보푸라기 조직</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>Kimtech 와이프</td><td></td></tr><tr><td>금형 재료</td><td>Proto labs</td><td>Accura SL5530&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>금형 인쇄 장비</td><td>프로토 랩</td><td>Stereolithogrphy</td><td>최대 치수 : 127mm x 127mm x 63.5mm, 레이어 두께 : 0.0254mm</td></tr><tr><td>몰드 프린팅 서비스</td><td>프로토 랩 사용자</td><td>정의</td><td>https://www.protolabs.com/</td></tr> <tr><td>NaOH</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 / 스트렙토 마이신</td><td>VWR</td><td>16777-164P</td><td></td></tr><tr><td>스피닝 디스크 컨 포칼 현미경</td><td>Solamere Technology Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>전자 현미경 과학</td><td>184 SIL ELAST KIT&nbsp;</td><td>PDMS 키트</td></tr><tr><td>트립신</td><td>시그마-알드리치</td><td>T9935</td><td></td></tr></tbody></table>

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3d 분석

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

2D 세포 배양 시스템의 다양 한 한계는 살아있는 조직의 공간적 및 화학적 복잡성을 더 잘 모방 하 고 생체 내 조직 기능을 모방 하는 3D 세포 배양 및 분석 플랫폼에 대 한 관심을 촉발 시켰습니다. 최근 미세 제조 기술의 진보는 세포가 잘 정의 된 세포 외 기질 (ECM)과 가용성 또는 매트릭스 관련 생체 분자의 정의 된 집합으로 통합 될 수 있는 생체 외 환경에서의 개발을 촉진 시켰다. 그러나, 기술 장벽은 연구 실험실에서 그들의 대폭적인 사용을 제한 했습니다. 여기서, 우리는 정의 된 화학 유인 구배와 함께 3D 미세 환경에서 세포와 멀티 셀로 노이 드와 3D 문화와 실험을 위한 간단한 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 이 플랫폼의 사용은 상피 세포와 유기 체의 반응의 분석을 위해 표 피 성장 인자 (EGF)와 같은 성장 인자의 그라데이션에 관한 것 이다. EGF 그라데이션은 유 방 소기관에서 지시 된 지점 형성으로 이어지는 며칠 동안 장치에서 안정 하였다. 이 분석을 통해 셀 그룹에의 한 집단 그라데이션 감지가 더 민감하고 단일 셀 이라고 결론을 내릴 수 있었습니다. 우리는 또한 포토 리소 그래피 시설이 나 고급 소프트 리소 그래피 기술이 필요 하지 않은 제조 방법을 설명 합니다. 이 방법은 암을 포함 하 여 발달 및 병리학 적 상태 분석의 맥락에서 3D 세포 거동을 연구 하는 데 도움이 될 것입니다.

EGF는 유 방 땀 샘의 형태 형성을 촉진 하는 필수 레 귤 레이 터 이며, 침 습성 암 성장에서 유방암 상피 세포의 이동을 유도 하는 중요 한 화학 유인 제입니다. 위에서 설명한 메조 스코프 유체 장치를 사용 하 여 정의 된 EGF 그라데이션 (도 1a, B)에 대 한 세포의반응을 연구 하였다. 이 장치는 폭이 5mm, 길이 10mm, 높이 1mm의 문화 영역을 생성 합니다. 배양 영역의 측면은 표면 장력을 통해 세포 배양 영역 내의 액체 ECM 및 세포 혼합물을 트랩 하는 데 사용 되는 육각형 기둥에 의해 개방 우물에서 분리 된다. 우리는이 3D 문화의 크기를 감안할 때, 포토 리소 그래피10에 의해 적절 한 크기의 몰드를 구성 하는 것이 매우 어렵고, 비싸고, 시간이 많이 소요 될 것 이라는 점을 ...

우리는 셀과 다중 세포 소기관으로 3D 문화와 실험을 위한 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 이 장치는 정의 된 화학 유인 구배가 있는 3D 미세 환경에서 가용성 신호에 대 한 셀룰러 응답을 분석 할 수 있습니다. 유기 체는 약한 시끄러운 입력의 검출에 단일 세포 보다 낫다.

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

체외 배양과 3D 조직과 같은 환경의 단순화된 2D의 차이는 살아있는 조직의 공간및 화학적 복잡성을 나타내는 3D 시스템에 대한 관심을 증가시켰습니다. 제조 공정에는 시설 또는 포토리소그래피 기술이 필요하지 않습니다. 그러나, 3D PDMS 장치는 3D 생리환경 적용을 위해 필요한 벡터를 포함한다.중유체 장치 제조를 위해 적절한 3차원 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어 프로그램을 사용하여 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 장치에 대한 금형 의 마스크를 설계하고 열저항성 수지로 스테레오 리소그래피 장비를 사용하여 금형을 인쇄합니다. 금형이 준비되면 금형당 PDMS 단조근 용액 3밀리리터를 경화제와 10 대 1 비율로 혼합하고 진공을 사용하여 진공 건조기에서 1시간 동안 분해합니다. 탈수의 끝에서 접착제 테이프를 사용하여 금형 표면에서 먼지를 제거하고 탈기 PDMS 용액으로 금형을 조심스럽게 채웁니다.다음으로 실온에서 금형이 냉각되기 전에 2시간 동안 PDMS를 섭씨 80도에서 치료합니다. 금형이 터치로 냉각되면 블레이드를 사용하여 금형과 PDMS 사이의 경계를 절단하고 금형에서 PDMS를 조심스럽게 벗깁니다. PDMS를 22mm 22mm 커버슬립에 맞게 다듬고 입구에 구멍을 뚫습니다.낮은 보풀 티슈와 70%에탄올을 사용하여 장치를 닦고 덮개 슬립을 닦고 새로운 접착제 테이프로 장치를 두드려 큰 먼지 입자를 제거합니다. 그런 다음 PDMS 장치와 커버슬립을 121°C에서 121도의 건조하고 15분 동안 건조하고 PDMS 부품의 바닥 표면을 염색하고 코로나 방전 총으로 5분 동안 코로나 배출총으로 커버슬립을 처리한 후 조각을 결합합니다. 장치를 로드하려면 먼저 1%페니실린 및 연쇄상 구균 및 1%인슐린 전달-셀레늄-x로 보충된 적절한 성장 배지에 대한 관심 있는 세포를 다시 중단합니다.다음으로 매머진 세포 현탁액 의 50 마이크로리터를 425 마이크로리터의 갓 준비된 중화 콜라겐 용액과 혼합하고 콜라겐 세포 현탁액으로 200 마이크로리터 파이펫을 채웁니다. 전체 챔버가 채워질 때까지 입구를 통해 액수들을 PDMS 장치에 주입하고 1시간 동안 5%의 이산화탄소로 인큐베이터에 장치를 배치하여 성장 배지로 양쪽의 저수지를 채우고 공초점 이미징이 될 때까지 인큐베이터로 장치를 반환한다. 3D 이미징 및 정량화를 위해, 살아있는 세포 이미징 배양 챔버를 공초점 현미경에 설치하고 온도와 이산화탄소를 각각 섭씨 37도 및 5%로 미리 설정합니다.이미징 챔버 저장소에 물을 추가하여 챔버를 가습하고 필요에 따라 젖은 물티슈를 챔버에 넣고 PDMS 장치를 챔버에 배치합니다. 그라데이션 형성의 요인의 원천으로서 저장소 중 하나에 표피 성장 인자를 추가하여 다른 저수지를 떠나 공간적으로 등급이 매겨진 표피 성장 인자 분포의 개발을 위한 싱크로 작용한다. 그런 다음 관심있는 오르가노이드의 양을 포함하는 Z 스택의 범위를 설정하고 이미징을 시작합니다.실험의 끝에서, 적절한 이미지 분석 프로그램을 사용하여 오르가노이드 또는 개별 세포의 이동에서 확장되는 분기의 길이와 각도를 측정합니다. 실리코와 체외 검사 모두에서 공급원 또는 싱크 저장소의 보충 없이 약 2일 동안 지속되는 세포 배양 영역을 가로지르는 안정적인 선형 표피 성장 인자 그라데이션의 형성을 밝혀내고, 6.4킬로달톤의 단백질인 표피 성장 인자는 상대적으로 짧은 기간 동안 입증된 콜라겐 겔 내에서 안정적인 확산 기반 그라데이션을 형성할 수 있음을 시사한다. 유방 오르가노이드는 밀리리터당 0.5 나노몰러를 갖는 선형 그라데이션에 표피 성장 인자가 추가될 경우 3일 동안 방향 편향이 없는 공간적으로 균일한 2.5 나노몰어 표피 성장 인자의 존재에서 여러 가지를 형성한다.그러나 분기 형성은 상당한 방향 편향을 표시합니다. 참고로, 갭 접합 억제제를 첨가하면 그라데이션에 반응하는 오르가노이드의 능력을 억제합니다. 콜라겐 용액의 pH는 겔화 및 세포 생존가능성에 매우 중요합니다.콜라겐이 혼합하기 전에 중화되지 않으면 세포 생존가능성이 낮습니다. 이 방법은 보다 현실적인 조직 모델링을 수용하기 위하여 확장될 수 있고 젤 내의 개별 적인 세포에서 혈관 네트워크 대형을 수용할 수 있었습니다.

3d-analysis-of-multi-cellular-responses-to-chemoattractant-gradients

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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Dictyostelium discoideum 응답 심각한 기계적인 자극의 평가

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학습하세요 화학 유인 그라데이션에서 다중 세포 반응을 3D 분석하는 PDMS 기반 장치 제작 방법을. 이 기술은 조직체를 활용하여 약한 신호를 효과적으로 감지하고 세포 행동을 연구할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공합니다.

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

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