Name: 초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 34 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 배아에서 단백질과 RNA 국소화를 위한 면역조직화학 및 계내 분포 기법을 활용한 발달생물학 연구 방법을. 슬라이드 부착력 향상과 시각화 개선이 가능합니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (#31771377 / 31571273 / 31371256), 국립 교육부 (#MS2014SXSF038)의 외국 저명한 과학자 프로그램 (National Department of Education Central Universities Research Fund) (#GK201301001 / 201701005 / GERP-17-45)의 지원을 받았으며 XZ는 우수 박사 학위 논문 기금 (#2019TS082 / 2019TS079), 산시 성 교육부의 핵심 프로그램 (#20JS138), 산시 성 과학 기술부의 자연 과학 기초 연구 프로그램 청소년 프로젝트 (#2020JQ-885).

1. 포도즙 한천 플레이트의 제조
<ol><li>한천 5g과 자당 5g을 증류수 150mL에 첨가한다. 한천과 자당이 완전히 용해 될 때까지 전자 레인지를 사용하여 삶으십시오. 100 % 포도 주스 50 mL와 용액을 함께 섞는다.</li>
	<li>100% 프로피온산 1 mL를 첨가하여 최종 농도를 0.5% 프로피온산으로 만든다. 준비된 용액 25 mL를 각 플레이트에 붓는다. 한천이 응고된 후, 배지를 4°C에 보관한다.</li>
</ol>2. 코팅 슬라이드
<ol><li>슬라이드를 세제로 전처리하십시오. 슬라이드를 수돗물로 3 번, 증류수로 한 번 씻으십시오. 이어서, 슬라이드를 45°C 오븐에서 2시간 동안 건조시켰다.</li>
	<li>슬라이드를 약 450 mL의 이크로메이트 칼륨 황산 용액 (20 g의 디크로메이트 칼륨, 40 mL의 증류수 및 400 mL의 진한 황산)에 24 시간 동안 담그십시오. 슬라이드를 수돗물로 3 번, 증류수로 한 번 씻으십시오.<ol>
<li>슬라이드를 45°C 오븐에서 두 시간 동안 건조시킨다. 95% 에탄올에 2시간 이상 담그십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>황산크롬칼륨 0.5g과 젤라틴 5g을 증류수 1L에 첨가한다. 사용 전에 60°C 수조에 녹인다. 크롬 명반 젤라틴은 장기간 동안 4°C에서 저장될 수 있다.</li>
	<li>크롬 명반 젤라틴 10 μL를 슬라이드에 떨어뜨리고 용액으로 슬라이드의 전체 표면을 완전하고 고르게 덮는다. 젤라틴 측면이 있는 슬라이드를 42°C의 오븐에 48시간 동안 올려 놓는다. 제조된 슬라이드는 추후 사용을 위해 4°C에서 보관할 수 있다. 참고: 이 단계는 매우 중요한 단계입니다. 완전한 코팅이 필요합니다. 초파리와 그 배아의 경우,이 슬라이드 코팅 접근법은 폴리 라이신 코팅보다 더 효율적으로 보입니다.</li>
</ol>3. 초파리 배아 임베딩
<ol><li>
초파리 배아 수집 참고 : 우리는 초 파리 배아를 0-2 시간 (싱크 리얼 블라스토 배엽), 2-3 시간 (세포 배반엽), 3-12 시간 (초기 gastrula) 및 12-24 시간 (후기 gastrula)18의 4 기간에 수집했습니다. 각 기간에서 주요 배아 유형의 비율은 표 1에 나타내었다.<ol>
<li>플라스틱 수집 병에 400-500 마리의 파리를 넣고 효모 추출물이 들어있는 포도 주스 한천 접시로 병을 덮으십시오. 초파리 배아는 실온에서 포도 주스 한천 위에 놓여진다.</li>
		<li>4 기간의 배아를 수집하고, 각 플레이트에 PBS 2 mL (137 mM NaCl, 2.7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4)를 부드럽게 첨가하여 배아를 부유시켰다. 약 200개의 배아를 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 2분 동안 얼음 위에 두어 배아를 정착시킨다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>사전 임베딩<ol>
<li>초파리 배아 200개를 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 2 분 동안 보관하여 배아를 정착시킨 다음 피펫으로 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 튜브에 50% 표백제 1mL를 넣고 2분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 참고 : 표백제는 신선하게 준비해야하며 표백제의 양은 수집 된 배아의 양에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
		<li>여과지에 부어 배아를 부드럽게 모으고 매번 PBS 1 mL로 3 번 씻으십시오.</li>
		<li>배아를 여과지로 약 5 mL의 n-헵탄으로 옮긴다.</li>
		<li>혼합물을 신선한 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮긴다. 메탄올 1 mL를 첨가하고 부드럽게 흔든다. 침강 후 배아를 수집하십시오.</li>
		<li>상층액을 제거하고 배아를 PBS 1 mL로 3-5회 세척한다.</li>
		<li>배아를 400μL의 Bouin 용액(71% 포화 피크르산, 24% 포르말린, 5% 아세트산)으로 30분 동안 고정시킵니다. 고정된 배아를 매번 5분 동안 PBS 1 mL에 3회 세척한다.</li>
		<li>배아를 응집시키려면, 샘플을 고무 마개로 옮기고 PBS를 제거한다.</li>
		<li>1.2% 아가로스-PBS 용액을 준비하고 용액을 60°C로 유지한다. 200 μL의 1.2% 아가로스-PBS 용액을 배아 상에 첨가하여 한천 블록에 고정시킨다.</li>
		<li>스토퍼에서 블록을 꺼내 PBS에 저장하십시오. 참고 : 사전 임베딩 접근법 중에 프로 워밍은 성공을 위해 중요합니다. 우리는이 단계에서 사용될 원심 분리 튜브 및 마이크로 피펫 팁이 작동하기 전에 완전히 미리 따뜻해야한다고 강력히 제안합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>파라핀 임베딩<ol>
<li>미리 포매된 한천 블록을 각각 15분 동안 35% 에탄올, 50% 에탄올, 75% 에탄올 및 85% 에탄올에 담그십시오. 그런 다음 95 % 에탄올과 100 % 에탄올에 2 번 담그십시오. 참고 : 블록의 배아 수에 따라 각 블록 부피의 약 5-10 배에 이어 15-30 분 동안 등급이 매겨진 고정제가 필요합니다.</li>
		<li>배아 블록을 100% 에탄올 및 자일렌(1:1 비율) 용액에 15분 동안 담그십시오.</li>
		<li>블록을 1분 동안 자일렌으로 옮겨 배아 조직을 투명하게 만든다.</li>
		<li>블록을 자일렌과 파라핀 (1:1 비율)에 30분 동안 잠급니다.</li>
		<li>블록을 파라핀 I, 파라핀 II 및 파라핀 III에 각각 2 h 동안 침지시킨다.</li>
		<li>임베딩 박스를 미리 파라핀으로 채운 다음 블록을 부드럽게 수평으로 임베딩 박스 하단으로 옮깁니다. 파라핀이 자연적으로 응고된 후, 고형화된 파라핀 블록은 4°C에서 저장될 수 있다. 참고: 사전 내장된 샘플은 다음 단계에 따라 냉동 절제에 사용할 수 있습니다. 배아가 전술한 바와 같이 아가로오스로 미리 포매된 후에, 샘플은 단순히 OCT 화합물에 포매된다. 그 후, 냉동 절제술은 일상적인 냉동 절제 프로토콜에 따라 수행 될 수 있습니다. 이어서, 규칙적인 염색 접근법이 절편에 사용될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 헤마톡실린-에오신 염색
<ol><li>초파리 배아 섹션을 준비하십시오. 준비된 절편을 60°C의 오븐에 15분 동안 놓은 다음, 절편을 각각 10분 동안 2회 크실렌에 침수시킨다. 절편을 100% 에탄올과 자일렌(1:1 비율)에 1회 2분 동안 잠급니다.</li>
	<li>절편을 100% 에탄올 I, 100% 에탄올 II, 95% 에탄올, 85% 에탄올, 75% 에탄올, 50% 에탄올 및 증류수에서 3분 동안 수화시킨다.</li>
	<li>2 분 동안 헤마 톡실린 용액으로 절편을 얼룩지게하십시오. 슬라이드를 1% 산 알코올 용액(염산 1 mL, 70% 에탄올 100 mL)에 빠르게 담그고 슬라이드를 증류수로 세척한다.</li>
	<li>슬라이드를 50% 에탄올, 75% 에탄올, 85% 에탄올 및 95% 에탄올에 순차적으로 담그십시오.</li>
	<li>1 분 동안 에오신 용액으로 섹션을 얼룩지게하십시오.</li>
	<li>슬라이드를 95% 에탄올 I, 95% 에탄올 II, 95% 에탄올 III, 100% 에탄올 I, 100% 에탄올 II 및 100% 에탄올 III에서 각각 1분 동안 탈수시킨다.</li>
	<li>슬라이드를 100% 자일렌 I, 100% 자일렌 II 및 100% 자일렌 III에서 매번 5분 동안 클리어합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 중립 balsam으로 슬라이드를 장착하십시오.</li>
</ol>5. 주기적인 산-은 메테나민 염색
<ol><li>초파리 배아의 파라핀 부분을 증류수로 탈파라핀화하고 수화시킨다.</li>
	<li>절편을 실온에서 15분 동안 1% 주기적 산으로 산화시킨다.</li>
	<li>슬라이드를 증류수에서 각각 1분 동안 3회 헹구십시오.</li>
	<li>슬라이드를 약 40 mL의 갓 여과된 은 메테나민 작업 용액(3% 메테나민, 5% 질산은, 5% 붕산나트륨 용액)에 넣고 60°C에서 1시간 및 20분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 슬라이드를 증류수로 1 분 동안 헹구십시오.</li>
	<li>슬라이드를 0.2% 염화금으로 2분 동안 톤한 다음, 슬라이드를 증류수에서 1분 동안 헹구었다.</li>
	<li>슬라이드를 3분 동안 3% 티오황산나트륨에 넣은 다음, 슬라이드를 증류수에서 1분 동안 헹구었다.</li>
	<li>슬라이드를 헤마톡실린에서 30초 동안 반염색합니다. 달리기 수돗물에 슬라이드를 3-5 분 동안 씻으십시오.</li>
	<li>슬라이드를 각각 5분 동안 70% 에탄올, 80% 에탄올, 95% 에탄올 I, 95% 에탄올 II, 95% 에탄올 III, 100% 에탄올 I, 및 100% 에탄올 II에서 탈수시킨다.</li>
	<li>슬라이드를 각각 5분 동안 100% 자일렌 I, 100% 자일렌 II 및 100% 자일렌 III에서 클리어합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 중립 balsam에 슬라이드를 장착하십시오.</li>
</ol>6. 면역조직화학
<ol><li>초파리 배아의 파라핀 절편을 표준 프로토콜19에 따라 PBS로 탈파라핀화하고 재수화시킨다.</li>
	<li>실온에서 10 분 동안 메탄올 중 0.3 % H2O2로 슬라이드를 처리하고 빛을 피하십시오.</li>
	<li>적절한 항원 검색 버퍼를 식물성 증기선에서 슬라이드가 있는 용기 내에서 대략 100°C로 예열한다. 컨테이너에는 뚜껑도 있어야합니다. 슬라이드를 컨테이너에 넣습니다. 증기선의 뚜껑을 닫습니다.<ol>
<li>이 시점부터 20 분 동안 용기를 증기선에 보관하십시오. 슬라이드 용기의 뚜껑을 완전히 조여서 김이 나는 과정에서 수증기가 들어갈 수 있도록해서는 안됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>슬라이드를 실온으로 복귀시킨 후 PBS-T(PBS with Tween-20, pH 7.2)로 3회 5분 동안 부드럽게 헹구고, 슬라이드를 PBS로 각각 1분 동안 3회 헹구었다.</li>
	<li>슬라이드를 실온에서 60분 동안 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단한다.</li>
	<li>슬라이드를 1차 항체(1:1000에서 항-FKBP12)로 4°C에서 밤새 또는 실온에서 4시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>슬라이드를 PBS-T로 각각 5분 동안 4회 세척한다.</li>
	<li>슬라이드를 이차 항체(항토끼, 1:5,000)와 접합된 HRP 표지된 중합체와 함께 실온에서 90분 동안 적용한다. 사진 표백을 피하기 위해 어둠 속에서이 작업을 수행하십시오.</li>
	<li>슬라이드를 PBS-T로 각각 5분 동안 3회 세척한다.</li>
	<li>슬라이드를 5% 3,3'-디아미노벤지딘-테트라하이드로클로라이드(DAB)로 2-10분 동안 현미경 하에서 반응 생성물의 색상이 적절해질 때까지 인큐베이션한다.</li>
	<li>슬라이드를 헤마톡실린으로 30초 동안 반염색하고 슬라이드를 증류수로 각각 5분 동안 2회 세척한다.</li>
	<li>슬라이드를 각각 1분 동안 50% 에탄올, 70% 에탄올, 90% 에탄올, 95% 에탄올 및 100% 에탄올로 탈수시킨다.</li>
	<li>슬라이드를 각각 5분 동안 100% 자일렌 I, 100% 자일렌 II 및 100% 자일렌 III에서 클리어합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 중립 balsam에 슬라이드를 장착하십시오.</li>
</ol>7. 현장 혼성화
참고: 초파리 배아 절편은 0.01% 디에틸 피로카보네이트(DEPC) 처리수로 제조하였다. 현장 혼성화에 사용되는 모든 액세서리 는 DEPC 하룻밤 처리를 미리 적용합니다.
<ol><li>리보프로브 준비<ol>
<li>주형 DNA를 선형화하여 5' 오버행을 생성하는 제한 효소를 사용하여 클로닝된 삽입물로부터 하류의 제한 효소 부위에서 절단한다. 선형화 후, 페놀/클로로포름 추출 및 후속 에탄올 침전을 통해 주형 DNA를 정제한다. 표준 프로토콜을 사용합니다.</li>
		<li>정제된 주형 DNA 1 μg을 RNase가 없는 원심분리 튜브에 첨가한다. 원심 분리기 튜브를 얼음 위에 놓습니다. DEPC 처리된 물을 총 부피 13 μL에 충분히 첨가한다.<ol>
<li>그런 다음 다음 시약을 순서대로 첨가한다: 2 μL의 10x NTP 표지 혼합물, 2 μL의 10x 전사 완충액, 1 μL의 보호기 RNase 억제제, 2 μL의 RNA 폴리머라제 SP6 또는 RNA 폴리머라제 T7.</li>
		</ol>
</li>
		<li>피펫팅과 원심분리기로 반응을 짧게 혼합한다. 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 참고: 더 긴 인큐베이션은 표지된 RNA의 수율을 증가시키지 않는다. 반응 튜브에 적용된 짧은 스핀 (~ 800 rpm)은 다음 단계를 계속하기 전에 필요합니다. 이 스핀은 인큐베이션에서 생성 될 수있는 모든 내용물이 튜브의 바닥으로 올 수있게합니다.</li>
		<li>2 μL의 RNase-free DNase I을 첨가하여 주형 DNA를 제거하고 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>2 μL의 200 mM EDTA (pH 8.0)를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 참고: DIG 표지된 RNA 프로브는 1년 동안 에탄올 중에서 -15 내지 -25°C에서 저장될 수 있다.</li>
	</ol></li>
	<li>초파리 배아 섹션의 사전 혼성화<ol>
<li> 초파리 배아의 절편을 42°C 오븐에 48시간 동안 놓는다.</li>
		<li>슬라이드를 100% 자일렌에서 10분 동안 두 번 분리하십시오.</li>
		<li>슬라이드를 5분 동안 100% 에탄올, 95% 에탄올, 90% 에탄올, 70% 에탄올 및 50% 에탄올에 순차적으로 침수시켜 수화시킨다.</li>
		<li>슬라이드를 PBS에서 5분 동안 3회 인큐베이션하여 조직으로부터 고정 용액/Bouin의 용액을 제거하였다.</li>
		<li>슬라이드를 100 mmol/L 글리신/PBS 용액으로 각각 5분 동안 2회 세척한다.</li>
		<li>슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 2회 세척한다.</li>
		<li>슬라이드를 PBS 중의 0.3% 트리톤 X-100으로 15분 동안 인큐베이션하여 멤브레인을 투과시킨다.</li>
		<li>슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척한다.</li>
		<li>슬라이드를 15 μg/mL RNase-free 프로테이나제 K에서 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>슬라이드를 PBS 중의 4% 파라포름알데히드로 3분 동안 인큐베이션하여 소화를 정지시킨다.</li>
		<li>슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 2회 세척한다.</li>
		<li>슬라이드를 100 mM 트리에탄올아민 완충액 (pH 8.0)에서 0.25% (v/v) 아세트산 무수물과 함께 각각 5분 동안 2회 인큐베이션한다.</li>
		<li>DEPC 물을 슬라이드 수분 챔버에 넣으십시오. 슬라이드에 20μL의 사전 혼성화 용액(연어 정자 DNA 100μg/mL 포함)을 추가합니다. 슬라이드를 슬라이드 수분 챔버에 넣으십시오. 슬라이드를 42°C에서 4시간 동안 인큐베이션한다. 참고 : 젖은 상자의 뚜껑의 견고성을 보장하고 젖은 상자는 사전 혼성화 용액과 후속 하이브리드화 용액의 조직으로부터의 휘발 및 편차를 방지하기 위해 항상 수평으로 유지되어야합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>초파리 배아 섹션의 혼성화<ol>
<li>예비 혼성화 용액을 제거하고 슬라이드를 각각 5분 동안 0.2x SSC(150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산나트륨, pH 7.0)로 3회 세척한다. 조직 샘플 주위의 0.2x 초과 SSC를 닦아냅니다.</li>
		<li>30 μL의 프로브 혼성화 용액 (사전 혼성화 용액으로 희석하여 2-6 ng의 디곡신 표지 RNA 프로브 포함)을 피펫으로 적용하십시오. 슬라이드를 대략 20 h 동안 42°C에서 슬라이드 수분 챔버 내에서 인큐베이션한다. 참고 : 마지막 메모의 제안으로 캡 견고성을 확인하십시오. 그렇지 않으면, 사전 혼성화 또는 사전 혼성화의 누출로 인한 드라이업은 슬라이드에서 의사 양성을 포함한 더러운 배경을 생성합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>교 잡<ol>
<li>혼성화 용액을 제거하고 슬라이드를 4x SSC 용액으로 37°C에서 각각 15분 동안 4회 세척한다.</li>
		<li>슬라이드를 2x SSC 용액에서 20 μg/mL의 RNase A로 37°C에서 30분 동안 세척한다.</li>
		<li>슬라이드를 37°C에서 15분 동안 1x SSC 용액으로 세척한다.</li>
		<li>슬라이드를 37°C에서 15분 동안 0.5x SSC 용액으로 세척한다.</li>
		<li>슬라이드를 37°C에서 15분 동안 0.1x SSC 용액으로 세척한다.</li>
		<li>슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척한다.</li>
		<li>슬라이드를 세척 완충액 (100 mM 말레산, 150 mM NaCl, 0.3% (v/v) 트윈 20, pH 7.5)에서 1분 동안 세척한다.</li>
		<li>슬라이드를 갓 제조된 블로킹 용액 100 mL(트윈 20이 없는 말레산 완충액 중 2% 양 혈청)에 30분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>슬라이드를 20 mL의 항체 용액에서 45분 동안 인큐베이션한다.<ol>
<li>항체를 각 사용 전에 원래의 바이알에서 10,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 필요한 양을 표면으로부터 조심스럽게 피펫팅한다. 항-디곡시게닌-AP 1:5000 (150 mU/mL)을 블로킹 용액에 희석하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>슬라이드를 100 mL의 세척 완충액으로 각각 15분 동안 2회 세척하여 결합되지 않은 항체 접합체를 제거하였다.</li>
		<li>슬라이드를 2-5분 동안 20 mL의 검출 완충액 (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5)에서 평형화시킨다.</li>
		<li>슬라이드를 갓 준비된 컬러 기판 용액 10 mL와 함께 슬라이드 수분 챔버에서 인큐베이션한다. 반응은 몇 분 안에 시작되고 16 시간 후에 완료됩니다. 색상이 변하는 동안 흔들거나 섞지 마십시오.</li>
		<li>슬라이드를 50 mL의 증류수로 5분 동안 세척하여 반응을 중지시킨다.</li>
		<li>어둠 속에서 밤새 샘플을 말리십시오.</li>
		<li>슬라이드를 70% 에탄올, 80% 에탄올, 90% 에탄올, 95% 에탄올, 100% 에탄올 I 및 100% 에탄올 II에서 각각 3분 동안 탈수시킨다.</li>
		<li>슬라이드를 각각 20분 동안 100% 자일렌 I, 100% 자일렌 II 및 100% 자일렌 III에서 클리어합니다.</li>
		<li>중립 발삼으로 슬라이드를 장착하십시오.</li>
		<li>반전된 현미경 및 제조업체 소프트웨어로 이미지를 문서화하고 분석합니다. ImageJ를 사용하여 세로 축을 따라 또는 배아의 차동 영역 내에서 양성 신호의 밀도에 따라 분포 분석을 수행합니다. 참고: 단계 7.4.12에서 갓 준비된 컬러 기판 용액과 함께 인큐베이션하는 동안, 반응 색상은 맨눈으로 볼 수 있다. 색상 발달이 어떻게 스테레오 스코프로 검사 될 수 있는지에 대한이 관찰. 일단 반응 색상이 합리적이면 단계 7.4.13을 수행하여 반응을 중지시킬 수 있다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Weisleder, N., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Ca2%2B+sparks+in+aging+skeletal+and+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle.</a> Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).</li>
<li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcium Sparks.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+Receptors%3A+Functional+Structure+and+Their+Regulatory+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors.</a> Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).</li>
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RyRs 및 IP3Rs 매개 칼슘 신호 전달은 척추 동물 및 무척추 동물 모두의 많은 생리 학적 및 병리학 적 과정에서 근본적인 경로입니다1,2,3,4. 인간에서, RyR2 유전자에서 CPVT 관련 R4496C 돌연변이와 같은 점 돌연변이는 심근세포의 사르코플라스마 망상으로부터 칼슘 누출을 유발하여, 심장 기능 장애를 초래한다. 이러한 돌연변이는 신체 활동 중 갑작스런 심장 사망의 위험이 높은 부정맥으로 존재하며,이 돌연변이를 운반하도록 설계된 마우스 모델에서 재현 가능합니다. 운동 조건 하에서,이 칼슘 누출 돌연변이를 가진 마우스는 야생형 카운터 파트에 의해 입증되지 않은 심장 갑작스런 사망을 경험했습니다.18,20,21,22.<sup c...

칼슘 유도 칼슘 방출 신호전달(CICR)은 골격/평활근 및 심장 혈관 기능, 세포 증식 및 아폽토시스, 발달, 노화, 신경 시냅스 가소성 및 재생과 같은 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다1,2,3,4,5,6 . 리아노딘 수용체 (RyRs) 및 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트 수용체 (IP3Rs)는 그들의 조절인자인 단백질 키나아제 A (PKA), Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 II (CaMKII), FK506 결합 단백질 (FKBPs), 칼세퀘스트린 (CSQ), 트리아딘 및 junctin1,2,3,4,5,6에 의해 조절되는 칼슘 신호전달 경로의 주요 플레이어이다. . 이러한 단백질의 비정상적인 인간 발현 및 돌연변이는 부정맥7 및 종양원성 증식8,9과 같은 병리학적 생리학을 야기할 수 있다.
FKBPs는 RyRs에 의해 소포체(ER)로부터의 칼슘 방출을 조절한다. 이 과정은 수축 메커니즘에 필수적이며, 따라서 배아 RyRs1,2와 함께 칼슘 유도 칼슘 방출을 통해 미오신 액틴 수축에 의해 생성 된 모든 기계적 움직임을 담당합니다. 마우스 모델에서, RyR2 및 그 조절인자 FKBP12/Calstabin의 부족은 배아 발달 동안 또는 산후 초기 기간10,11,12에서 변함없이 치명적이다. FKBP12 / Calstabin 녹아웃 마우스는 배아 발달 중 불규칙한 여기 수축 결합 (EC) 및 뇌 부종으로 심각한 심장 결함을 나타냅니다. 이는 FKBP12/Calstabin이 심장 및 뇌 발달 모두에 중요한 RyR2 채널 발현을 조절하는 데 필수적인 역할을 한다는 것을 나타냅니다10.
RyR 실시 칼슘 스파크는 수정 된 메다카 난자의 접합체 형성 단계에서 처음 발견되었습니다13,14. 그러나 초기 배아 발달에서 칼슘 신호 전달의 기능에 대한 연구는 거의 수행되지 않았습니다. 초파리 멜라노가스터에서, DmFKBP12 S107 돌연변이체로부터 얻은 결과는 유충 발달과 건강한 수명에 대한이 유전자의 중요성을 뒷받침하는 강력한 증거를 제공하며, 이는 산화 스트레스에 대한 기능에 기인합니다15,16. 최근에, 우리는 초기 초파리 멜라노가스터 개발 동안 FKBP12/Calstabin 단백질 및 메신저 RNA의 동적 국소화를 확인했다17. 이 방법론에 기술된 접근법을 사용하여, 우리는 세포융합 배반엽 (0-2 h), 세포 배반배엽 (2-3 h), 초기 gastrula (3-12 h), 및 후기 gastrula (12-24 h) 동안 D. melanogaster에서 FKBP12/Calstabin의 발현을 추적할 수 있었다. 이 논문에서, 우리는 고전적인 파라핀 절편을 위한 전-배아 임베딩, 배아 절편에 대한 예비코팅 슬라이드 처리, 조직-화학 염색 및 면역염색, 유전자 발현의 확인을 위한 mRNA 인-시츄 혼성화를 포함하는 이전 연구에서 모든 접근법의 상세한 프로토콜을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>-20&deg; C 냉장고</td><td>Meiling 생물학 & 의료용</td><td>DW-YL270</td><td>리젠트 보관에 사용</td></tr><tr><td>-80&deg; C 초저온 냉장고</td><td>Thermo</td><td>Forma 90 시리즈</td><td>리젠트 저장에 사용</td></tr><tr><td>한천</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>WXBB6360V</td><td>포도 주스 한천 플레이트</td></tr><tr><td>준비 Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>digoxigenin 표지 화합물</td></tr><tr><td>검출 : 생화학 인큐베이터</td><td>Shanghai Bluepard Instruments</td><td>LRH-250</td><td>현장 Hybridization</td></tr><tr><td>Bouin의 솔루션</td><td>Sinopharm 화학 시약 베이징</td><td>69945460</td><td>Drosophila Embryo Embedding</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>540BH07808</td><td>In-situ Hybridization</td></tr><tr><td>Centrifuge tube</td><td>Denville</td><td>C-2170</td><td>Drosophila Embryo Collection</td></tr><tr><td>Chrome Alum</td><td>Sinopharm 화학 시약 베이징</td><td>10001018</td><td>코팅 슬라이드</td></tr><tr><td>항온 수조</td><td>Jintan Henfeng Instruments</td><td>KW-1000DC</td><td>Hematoxylin-Eosin 염색, 면역 조직 화학, 현장 혼성화 및주기적 산 -은 메테 나민 염색</td></tr><tr><td>Dako REAL EnVision 감지 시스템</td><td>Dako</td><td>K5007</td><td>면역조직화학반응 또는 제자리 혼성화 반응에서 1차 항원 항체에 결합하고 표적은 염색으로 표지됩니다.</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>현장 교잡</td></tr><tr><td>DIG RNA 라벨링 키트</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>SP6 및 T7 RNA 중합효소를 사용한 체외 전사를 통한 diagoxigenin-UTP로 RNA 라벨링</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 <</td><td>em>Drosophila melanogaster mutant</td></tr><tr><td>의 재고전기 돌풍 건조 오븐</td><td>Tianjin Taiste Instruments</td><td>101-0AB</td><td>코팅 슬라이드 및 파라핀 임베딩용</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230251</td><td>Hematoxylin-Eosin 염색</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sinopharm 베이징에서 화학 시약</td><td>100092680파라</td><td>핀 임베딩, Hematoxylin-Eosin 염색, 면역조직화학, 현장 혼성화 및 주기적인 산-은 Methenamine 염색</td></tr><tr><td>베이징의 젤라틴</td><td>시노팜 화학 시약</td><td>10010328</td><td>코팅 슬라이드</td></tr><tr><td>금 염화물</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>379948</td><td>주기적 산 -은 메테 나민 염색</td></tr><tr><td>헤마 톡실린</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>H3136</td><td>헤마 톡실린 -에오신 염색</td></tr><tr><td>고순도 PCR 제품 정제 키트</td><td>Roche</td><td>11732668001</td><td>PCR 제품</td></tr> <tr><td>정제 용지능형 항온 및 습도 상자</td><td>Ningbo Jiangnan Instruments</td><td>HWS</td><td>플라이 유지 보수</td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>HyAgarose</td><td>14190108029</td><td></td></tr><tr>베이징 <td>10014108</td><td>초파리 배아 수집</td>현미경 ZEISS Observer.A1<td></td><td></td>에 메탄올 Sinopharm 화학 시약</tr> 사전 내장 <tr><td></td><td></td><td></td><td>Hematoxylin-Eosin 염색, 면역조직화학, 현장 혼성화 및 주기적 산-은 메테나민 염색</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>MeVid Labware 제조</td><td>P105-2001</td><td>코팅 슬라이드</td></tr><tr><td>베이징의 중성 검</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10004160</td><td>Hematoxylin-Eosin 염색</td></tr><tr><td>N-헵탄</td><td>Sinopharm 베이징의 화학 시약</td><td>40026768</td><td>Drosophila Embryo 수집</td></tr><tr><td>파라핀 저미는</td><td>기계 Huahai 과학 기구</td><td>HH-2508III</td><td> 현장 교잡</td></tr><tr><td>파라핀</td><td>Sinopharm 베이징에 화학 시약</td><td>69019461</td><td>파라핀 끼워넣</td></tr>는 <tr><td>pH/mV 미터</td><td>Sartorius</td><td>PB-10</td><td>해결책의 PH 값 결정을 위해</td></tr><tr><td>질산은</td><td>Sinopharm 베이징 10018461에서 화학 시약</td><td></td><td>주기적인 산-은 메테나민 염색</td></tr><tr><td>초순수 미터</td><td>Thermo</td><td>AFXI-0501-P</td><td>현장 하이브리드화</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sinopharm 화학 시약 베이징</td><td>10023418</td><td>파라핀 임베딩</td></tr></tbody></table>

초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 rna 계내 분포를 위한 프로토콜

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

칼슘 유도 칼슘 방출 신호 (CICR)는 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을합니다. 세포 증식 및 아폽토시스, 발달 및 노화, 뉴런 시냅스 가소성 및 재생에 이르기까지 모든 세포 활성은 Ryanodine 수용체 (RyRs)와 관련이 있습니다. 칼슘 신호 전달의 중요성에도 불구하고, 초기 개발에서 그 기능의 정확한 메커니즘은 불분명하다. 임신 기간이 짧은 유기체로서, 초파리 멜라노가스터의 배아는 발달 중에 CICR 관련 단백질 및 그들의 조절자의 분포 및 국소화를 조사하기위한 주요 연구 대상입니다. 그러나 지질이 풍부한 배아와 키틴이 풍부한 쵸리온으로 인해 유리 표면에 배아를 장착하기가 어려워 유용성이 제한됩니다. 이 연구에서는 초파리 배아를 슬라이드에 부착하는 것을 크게 향상시키는 실용적인 프로토콜과 성공적인 조직 화학, 면역 조직 화학 및 현장 혼성화를위한 세부 방법을 소개합니다. 크롬 명반 젤라틴 슬라이드 코팅 방법 및 배아 사전 임베딩 방법은 초파리 배아 단백질 및 RNA 발현을 연구하는 데 수율을 극적으로 증가시킵니다. 이 접근법을 입증하기 위해, 우리는 초파리 멜라노가스터의 초기 배아 발달 동안 RyR의 잘 알려진 조절자 인 DmFKBP12 / Calstabin을 연구했습니다. 우리는 싱크로나이셜 배반배엽 단계에서 DmFKBP12를 확인하고 개발 중에 DmFKBP12의 동적 발현 패턴을 보고 하였다: 초기에는 세포융합 배반엽에서 고르게 분포된 단백질로서, 그 후 세포 배반배엽 동안 피질의 기저층으로 미리 국소화하고, 초기 위축에서 삼겜층 단계 동안 원시적 뉴런 및 소화 구조에 분배하기 전에. 이 분포는 RyR이 이러한 층에서 유래 한 중요한 장기 시스템에서 중요한 역할을 설명 할 수 있습니다 : 식도 하 및 식도 신경절, 복부 신경계 및 근골격계.

도면은 시험 및 실험을 위해 높은 지질 및 키틴 함유 초파리 배아 (표 1)를 유리 슬라이드 표면에 부착시키는 문제를 극복하기 위해 사용되는 프로토콜을 설명합니다. 그림 1에 표시된 크롬 명반 젤라틴 슬라이드 코팅 방법을 활용하여 슬라이드 표면에 초파리 배아의 부착을 강화했으며, 그림 2에 표시된 배아 사전 임베딩 방법을 사용하면 네 가지 초기 개발 단계 (즉, 세포 배반배엽, 세포 배반엽, 초파리 배아의 초기 및 후기 gastrula). 도 3은 세포융합 및 세포성 배반배엽 단계에서 검출된 FKBP12/Calstabin 항체의 단백질 분포를 보여준다. 이러한 조직화학적 결과로부터, FKBP12 발현은 동시성 배반배엽(패널 A 내지 H)에서 덜 편광되고, 이어서 트로피토배엽 ...

여기에서, 우리는 초파리 배아 단백질 및 RNA의 검출 및 국소화를 위한 프로토콜을 기술한다 수집에서 사전-포베딩 및 포매, 면역염색, 및 mRNA 를 계내 혼성화에 이르게 한다.

초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

임신 기간이 짧은 유기체로서, 초파리 멜라노가스터의 배아는 발달 중에 단백질과 그 조절자의 분포와 국소화를 조사하기위한 주요 연구 대상입니다. 그러나 지질이 풍부한 배아와 키틴이 풍부한 쵸리온으로 인해 유리 표면에 배아를 장착하기가 어려워 유용성이 제한됩니다. 이 연구에서는 초파리 배아를 슬라이드에 부착하는 것을 크게 향상시키는 실용적인 방법을 소개하고 성공적인 조직 화학, 면역 조직 화학 및 현장 혼성화를위한 방법을 자세히 설명합니다.여기에 표시된 단계 전에 슬라이드를 세제로 씻은 다음 오븐에 넣어 건조하기 전에 수돗물과 증류수로 헹구어 야합니다. 건조 슬라이드는 헹구고 다시 건조되기 전에 24 시간 동안 칼륨 디크로메이트에 부드럽게 담근 다음 적어도 두 시간 동안 95 % 에탄올에 넣어야합니다. 이 단계 동안, 당신은 우리의 방법에 따라 추가 슬라이드 또는 크롬 명반 젤라틴을 준비 할 수 있습니다.젤라틴은 사용 전에 60도 목욕 물에 보관할 수 있습니다. 슬라이드를 코팅하려면 소량의 젤라틴을 슬라이드의 한쪽 가장자리에 떨어뜨립니다. 그런 다음 다른 유리 슬라이드를 사용하여 젤라틴을 천천히 고르게 드래그하여 코팅 할 슬라이드 표면을 가로 질러 드래그하십시오.이렇게하면 얇고 균일 한 레이어가 만들어집니다. 랙 또는 건조 장치에 넣기 전에 오븐에 보관하여 하룻밤 또는 48 시간 동안 완전히 건조시킬 수 있습니다. 배아는 포도 주스 한천 플레이트를 사용하여 수집되며, 일단 준비되면 포도 주스 한천 플레이트를 제거 할 수 있습니다.플레이트를 PBS로 붓고 부착 된 배아를 제거하기 위해 부드러운 브러시로 부드럽게 닦으십시오. PBS를 함유하는 배아를 1.5 밀리리터 원심분리 튜브로 제거하고 얼음 위에 쉴 수 있게 한다. 배아가 얼음 위에 정착되면, 상청액 PBS를 부드럽게 제거한다.튜브 바닥에있는 배아를 방해하지 않도록주의하십시오. 50% 표백제 1mL를 시료에 넣고 2분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 여과에 의해 표백제를 제거하고 배아를 PBS로 세 번 세척한다.n- 헵탄을 준비하십시오. 일단 준비가되면, 용액 내에서 여과지를 부드럽게 흔들어서 여과지에서 n-헵탄으로 배아를 씻으십시오. 배아가 n-헵탄 플레이트의 바닥에 정착하도록하고이 n- 헵탄을 새로운 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브에 수집하십시오.튜브에 한 밀리리터의 메탄올을 첨가하고, 용액이 침전되도록 허용한 다음, n-헵탄 메탄올을 흡인시킨다. 배아를 PBS로 세 번 내지 다섯 번 세척하여 잔류 메탄올을 제거하였다. 이 여분의 PBS를 제거하고 Bouin의 고정제를 추가하고 배아를 고정시키기 위해 30 ~ 60 분 동안 정착 할 수 있도록하십시오.Bouin의 고정제를 제거하고 배아를 PBS로 다시 세 번 세척하십시오. PBS에 1.2% 아가로스를 준비하고 60도 수조에서 따뜻하게 유지한 다음, 저장되어진 여분의 PBS를 부드럽게 흡인하여 매립용 배아를 준비한다. 바닥에있는 배아를 방해하지 않도록주의 한 다음 용액 하단의 배아 플러그를 흡인하고 병 뚜껑 몰드에 부드럽게 놓습니다.1.2% 아가로스 겔을 첨가하기 전에 이 주형으로부터 임의의 추가 PBS를 흡인한다. 이들 아가로스 플러그를 저장하기 위해 PBS의 용액을 준비한다. 일단 아가로스가 응고되면, 개별 플러그는 저장을 위해 이 PBS로 이동될 수 있다.여기서 우리는 순차적 인 탈수 과정을 보여줍니다. 매번 인큐베이션을 위해 15 분을 허용한다. 그런 다음 100 % 에탄올에서 제거하고 에탄올과 자일렌의 일대일 용액에 또 다른 15 분 동안 고정하십시오.이 일대일 용액에서 제거되면 순수한 자일렌에서 일분 동안 제거하십시오. 이제 조직 샘플은 가온된 일대일 자일렌 파라핀 용액으로 이동될 준비가 되었습니다. 100 % 파라핀에 최종 임베딩하기 전에 30 분 동안 그대로 두십시오.100 % 파라핀 중 첫 번째 파라핀으로 이동하여 두 시간 동안 휴식을 취하십시오. 이 과정을 두 개와 세 개의 파라핀에서 반복하십시오. 이제 샘플을 몰드로 옮길 준비가 되었으며 몰드는 왁스로 채워져 임베딩 공정을 완료할 수 있습니다.초파리 배아의 임베딩. 초파리 배아의 준비된 파라핀 절편을 60도 오븐에 15 분 동안 놓습니다. 자일렌의 100 % 용액에 넣으십시오.그런 다음 재수화를 시작합니다. 슬라이드를 이러한 각 솔루션에 각각 세 분 동안 놓습니다. 슬라이드가 증류수에 있으면 헤마톡실린 용액에 두 분 동안 놓습니다.완료되면 슬라이드에서 가능한 한 많은 용액을 배출하십시오. 일단 슬라이드가 증류수로 세척되면, 슬라이드를 에오신으로 1분 동안 염색한다. 마지막으로, 에오신으로부터 슬라이드를 제거하고 증류수로 세척한다.이 슬라이드가 깨끗해지면 이제 최종 탈수 과정을 시작합니다. 최종적으로 5분 동안 100%xylene에 넣는다. 이 과정은 100 % xylene의 두 가지 새로운 용액에서 반복되며 슬라이드의 한쪽 가장자리를 따라 소량의 중성 껌을 떨어 뜨립니다.이 커버 슬립을 잡고 슬라이드의 한쪽 가장자리에 부드럽게 놓습니다. 먼저 슬라이드를 100% 자일렌에 배치하여 디파라핀화합니다. 슬라이드가 증류수에서 제거되면 1 % 주기적 산 용액으로 덮어야합니다.그런 다음 과량의 용액을 버리고 증류수로 헹구십시오. 슬라이드를 예열된 용액에 직접 위치시킨다. 이것이 완료되면 슬라이드를 증류수로 헹구고 0.2 % 금 염화물로 용액을 1 ~ 2 분 동안 착색합니다.다음으로, 증류수를 사용하여 3분 동안 3% 티오황산나트륨으로 조직을 고정시켰다. 그런 다음 헤마톡실린으로 염색하십시오. 역염색 후, 얼룩은 여기에 나타낸 바와 같이 증류수의 어느 튜브로 세척될 수 있다.그런 다음 탈수 과정으로 넘어갑니다. 슬라이드를 100 % 자일렌에 직접 넣은 다음 소량의 중성 껌을 슬라이드 모서리에 바르십시오. 커버 슬립으로 부드럽게 덮으십시오.이전과 같이 디파라핀화와 자일렌을 사용하여 슬라이드 준비를 시작합니다. 이어서, 일대일 자일렌 에탄올을 투입한다. 일단 슬라이드가 탈파라핀화되면, 우리는 그들의 조직을 재수화하기 시작하고 마지막으로 PBS에서 시작합니다.슬라이드를 메탄올로 만든 0.3% 과산화수소에 10분 동안 놓는다. 그런 다음 슬라이드를 20 mLs의 표적 검색 용액으로 덮습니다. 그런 다음 슬라이드를 염색 상자에 넣을 수 있습니다.스테인더 박스를 증기선에 넣고 용액이 빠져 나가지 않고 슬라이드가 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 얼룩 상자 뚜껑을 완전히 닫아서 김이 나는 과정에서 수증기가 빠져 나올 수 있도록해서는 안됩니다. PBS-T에서 세 번 부드럽게 헹구었다.과량의 용액을 버리고 PBS로 이 과정을 반복한다. 다음으로, 슬라이드를 과산화물 블록에서 다섯 내지 10분 동안 인큐베이션한 다음, PBS-T에서 다시 여러 번 헹구고 PBS에서 헹구었다. 항체를 준비하고 조직에 직접 떨어 뜨립니다.이어서, 이들 조직은 네 시간 동안 또는 실온에서 인큐베이션될 수 있다. 이차 항체는 실온에서 90분 동안 인큐베이션되어야 하며, 이는 2 내지 10분 동안 5%DAB로 염색된다. 적절한 색을 얻은 후 증류수로 헹구고 헤마톡실린으로 역염색하십시오.이 헤마톡실린 염색 후, 슬라이드는 순차적으로 탈수될 수 있다. 슬라이드를 100 % 자일렌에 넣고 세 분 동안 담그십시오. 그런 다음 소량의 중성 껌을 슬라이드의 한쪽 가장자리에 떨어 뜨립니다.껌을 놓으면 슬라이드 커버를 가져 와서 슬라이드의 한쪽 가장자리에서 부드럽게 놓습니다. 정제된 선형화된 주형 DNA의 한 마이크로그램을 멸균 RNase-free 반응 바이알에 첨가한다. 그런 다음 멸균 RNase-free DEPC 처리 이중 증류수를 충분히 첨가하여 총 샘플 부피를 13 마이크로 리터로 만듭니다.그런 다음 간단히 원심분리하고 섭씨 37도에서 두 시간 동안 배양한다. RNase 보호 실험을 위해, 우리는 주형 DNA를 제거하기 위해 RNase-1, RNase-free의 두 마이크로 리터로 15 분 동안 배양하는 것이 좋습니다. 일단 인큐베이션 단계가 완료되면, 8의 pH에서 0.2 몰 EDTA의 2 마이크로리터를 첨가하여 반응을 중지시킨다.여기에 표시된 단계 이전에 슬라이드는 이전에 입증 된 프로토콜에 따라 탈파라핀화되고 재수화되었습니다. 재수화 후 슬라이드를 각각 5분 동안 pH 7.4에서 PBS 리터당 0.01몰로 인큐베이션하여 조직으로부터 고정제액을 제거하였다. PBS로 헹구고 난 후, 다섯 분 동안 리터당 100 밀리몰 글리신 용액으로 헹구어 조직으로부터 유리 알데히드 그룹을 제거하였다.이 단계 후, 슬라이드를 PBS로 다섯 분 동안 헹구십시오. 다음에, 헹굼하기 전에 15분 동안 0.3%트리톤 X-100을 함유하는 PBS에서 인큐베이션한 다음, 프로테이나제 K.Next의 마이크로리터당 1마이크로그램으로 다시 인큐베이션하고, 슬라이드를 pH 7.2에서 4%파라포름알데히드 및 PBS로 3분 동안 고정시킨다. 이어서, 0.25% 아세트산 무수물을 함유하는 0.1몰 트리에탄올아민 완충액 pH 8로 인큐베이션하기 전에 슬라이드를 세척한다.이 단계에서 상자를 기울여 솔루션으로 전체 적용 범위를 보장하도록 선택할 수 있습니다. 상자는 건조 혼성화 상자의 바닥에 20 % 글리세롤 또는 DEPC 물을 첨가하여 제조됩니다. 다음으로, 슬라이드를 20 마이크로리터의 사전 혼성화 용액으로 덮는다.연어의 정자 DNA는 각 슬라이드에 밀리리터 당 100 마이크로 그램의 농도로 제공됩니다. 그런 다음 섭씨 42도에서 4 시간 동안 배양하십시오. 이것은 미리 준비된 가습 상자에서 수행되어이 과정에서 용액이 건조되지 않도록합니다.하이브리드화 후 단계에서는 혼성화 용액이 샘플에서 완전히 헹구어지는 것이 매우 중요합니다. 이것은 4 배 농도 SSC, 두 배 농도 1 배 농도, 0.5 배 농도 및 0.1 배 농도 SSC 용액을 사용하여 37도에서 15 분의 연속 헹굼에서 수행 할 수 있습니다. 각각 섭씨 37도에서 15분 동안 배양한다.이것이 완료된 후, 세척 완충액을 첨가하기 전에 각각 다섯 분 동안 PBS로 세 번 세척한다. 세척 완충액은 다음 단계 전에 일분 동안 헹구어 져야하며 다음 용액을 추가하기 전에 세척 버퍼가 슬라이드에서 완전히 건조되었는지 확인하십시오. 각 슬라이드에 블로킹 용액 100 밀리리터를 넣고 슬라이드를 30 분 동안 인큐베이션하십시오.이것은 좋은 얼룩을 보장하기 위해 가볍지 않은 환경에서 가장 잘 수행됩니다. 다음으로 슬라이드를 20 mLs의 항체 용액에서 다시 30분 동안 인큐베이션한다. 항체 용액을 슬라이드에 직접 바르면 조직을 완전히 덮을 수 있습니다.인큐베이션이 완료되면 100 밀리리터의 세척 버퍼를 적용하십시오. 광자유 조건에서 15분 동안 인큐베이션하여 결합되지 않은 항체 접합체를 제거한다. 세척 버퍼를 제거하십시오.다음으로, 20 밀리리터의 검출 완충액을 적용하고 약 4분 동안 인큐베이션하였다. 네 분 후, 검출 버퍼를 제거한다. 슬라이드를 건조시켜 추가 용액이 없도록 하고 갓 준비한 컬러 기판 용액 10밀리리터를 첨가합니다.이 반응은 몇 분 안에 시작되지만 16 시간 후에 완료됩니다. 따라서 가벼운 자유 상태에서 그 기간 동안 배양을 허용하십시오. 일단 밴드가 검출되는 원하는 스폿이 50 밀리리터의 TE 완충액으로 슬라이드를 세척하여 반응을 중지시킨다.그런 다음 이전에 보여준 탈수 과정과 중성 껌 장착 과정을 완료하십시오. 도 하나 및 두 개는 초파리 배아 발달에서 FKBP12 및 DmFKBP12의 발현 프로필에 대한 파라핀 절편에 대한 크롬 알루미늄 젤라틴 코팅 방법 및 임베딩 방법을 입증한다. 도 셋은 세포융합 세포 배반엽 단계에서 검출된 FKBP12 항체의 단백질 분포를 보여준다.이러한 조직화학적 결과로부터, FKBP12 발현은 세포융합 배모엽에서 덜 편광되고, 이어서 트로피스토배엽 상피 아래의 기저막 내에서 국소화되기 시작하여 전방 및 후방에서 발견되는 더 많은 발현과 함께 구배를 알려준다는 것을 알 수 있다. 초파리 배아의 초기 및 후기 가스 관계 단계를 따르는 그림 네 개는 FKBP12 단백질이 원시 배아 조직의 특정 건축 성분으로 제한됨을 보여준다. 초기 및 후기 위장 배아 단계에서 관찰 된 것보다 세포 외 분포가 적습니다.흥미롭게도, 상기 기술된 동적 단백질 분포는 도면 5에서 볼 수 있는 바와 같이 FKBP12의 MRI 수준의 상응하는 변화를 수반하지 않는다. 단백질 발현을 나타내는 것은 아직 알려지지 않은 전사 후 분자 메커니즘의 결과이다. 리아노딘 수용체 매개 칼슘 신호전달은 척추동물 및 무척추동물 모두의 많은 생리학적 및 병리학적 과정에서 근본적인 경로이다.이 유전자의 돌연변이는 질병 또는 조기 심장 사망으로 이어지는 많은 생리 학적 장애를 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 그러나 초기 초파리 발달에서이 유전자가 수행하는 역할은 연구하기가 어려웠습니다. 배아의 통과 성분으로서, 지질이 풍부한 배아와 키틴이 풍부한 쵸리온은 초기 초파리 발달에서 단백질과 배아 발현에 대한 연구를 어렵게 만듭니다.이 논문에 설명 된 슬라이드 코팅, 배아 매립 및 면역 조직 화학 기술은 우리가 ryanodine 수용체 단백질 및 mRNA의 동적 분포를 자세히 연구 할 수있게 해주었습니다. 우리는 이러한 기술과 Drosophila의 초기 개발 단계에서 다른 단백질을 연구 할 수 있기를 희망합니다.

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