초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜

임신 기간이 짧은 유기체로서, 초파리 멜라노가스터의 배아는 발달 중에 단백질과 그 조절자의 분포와 국소화를 조사하기위한 주요 연구 대상입니다. 그러나 지질이 풍부한 배아와 키틴이 풍부한 쵸리온으로 인해 유리 표면에 배아를 장착하기가 어려워 유용성이 제한됩니다. 이 연구에서는 초파리 배아를 슬라이드에 부착하는 것을 크게 향상시키는 실용적인 방법을 소개하고 성공적인 조직 화학, 면역 조직 화학 및 현장 혼성화를위한 방법을 자세히 설명합니다.

여기에 표시된 단계 전에 슬라이드를 세제로 씻은 다음 오븐에 넣어 건조하기 전에 수돗물과 증류수로 헹구어 야합니다. 건조 슬라이드는 헹구고 다시 건조되기 전에 24 시간 동안 칼륨 디크로메이트에 부드럽게 담근 다음 적어도 두 시간 동안 95 % 에탄올에 넣어야합니다. 이 단계 동안, 당신은 우리의 방법에 따라 추가 슬라이드 또는 크롬 명반 젤라틴을 준비 할 수 있습니다.

젤라틴은 사용 전에 60도 목욕 물에 보관할 수 있습니다. 슬라이드를 코팅하려면 소량의 젤라틴을 슬라이드의 한쪽 가장자리에 떨어뜨립니다. 그런 다음 다른 유리 슬라이드를 사용하여 젤라틴을 천천히 고르게 드래그하여 코팅 할 슬라이드 표면을 가로 질러 드래그하십시오.

이렇게하면 얇고 균일 한 레이어가 만들어집니다. 랙 또는 건조 장치에 넣기 전에 오븐에 보관하여 하룻밤 또는 48 시간 동안 완전히 건조시킬 수 있습니다. 배아는 포도 주스 한천 플레이트를 사용하여 수집되며, 일단 준비되면 포도 주스 한천 플레이트를 제거 할 수 있습니다.

플레이트를 PBS로 붓고 부착 된 배아를 제거하기 위해 부드러운 브러시로 부드럽게 닦으십시오. PBS를 함유하는 배아를 1.5 밀리리터 원심분리 튜브로 제거하고 얼음 위에 쉴 수 있게 한다. 배아가 얼음 위에 정착되면, 상청액 PBS를 부드럽게 제거한다.

튜브 바닥에있는 배아를 방해하지 않도록주의하십시오. 50% 표백제 1mL를 시료에 넣고 2분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 여과에 의해 표백제를 제거하고 배아를 PBS로 세 번 세척한다.

n- 헵탄을 준비하십시오. 일단 준비가되면, 용액 내에서 여과지를 부드럽게 흔들어서 여과지에서 n-헵탄으로 배아를 씻으십시오. 배아가 n-헵탄 플레이트의 바닥에 정착하도록하고이 n- 헵탄을 새로운 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브에 수집하십시오.

튜브에 한 밀리리터의 메탄올을 첨가하고, 용액이 침전되도록 허용한 다음, n-헵탄 메탄올을 흡인시킨다. 배아를 PBS로 세 번 내지 다섯 번 세척하여 잔류 메탄올을 제거하였다. 이 여분의 PBS를 제거하고 Bouin의 고정제를 추가하고 배아를 고정시키기 위해 30 ~ 60 분 동안 정착 할 수 있도록하십시오.

Bouin의 고정제를 제거하고 배아를 PBS로 다시 세 번 세척하십시오. PBS에 1.2% 아가로스를 준비하고 60도 수조에서 따뜻하게 유지한 다음, 저장되어진 여분의 PBS를 부드럽게 흡인하여 매립용 배아를 준비한다. 바닥에있는 배아를 방해하지 않도록주의 한 다음 용액 하단의 배아 플러그를 흡인하고 병 뚜껑 몰드에 부드럽게 놓습니다.

1.2% 아가로스 겔을 첨가하기 전에 이 주형으로부터 임의의 추가 PBS를 흡인한다. 이들 아가로스 플러그를 저장하기 위해 PBS의 용액을 준비한다. 일단 아가로스가 응고되면, 개별 플러그는 저장을 위해 이 PBS로 이동될 수 있다.

여기서 우리는 순차적 인 탈수 과정을 보여줍니다. 매번 인큐베이션을 위해 15 분을 허용한다. 그런 다음 100 % 에탄올에서 제거하고 에탄올과 자일렌의 일대일 용액에 또 다른 15 분 동안 고정하십시오.

이 일대일 용액에서 제거되면 순수한 자일렌에서 일분 동안 제거하십시오. 이제 조직 샘플은 가온된 일대일 자일렌 파라핀 용액으로 이동될 준비가 되었습니다. 100 % 파라핀에 최종 임베딩하기 전에 30 분 동안 그대로 두십시오.

100 % 파라핀 중 첫 번째 파라핀으로 이동하여 두 시간 동안 휴식을 취하십시오. 이 과정을 두 개와 세 개의 파라핀에서 반복하십시오. 이제 샘플을 몰드로 옮길 준비가 되었으며 몰드는 왁스로 채워져 임베딩 공정을 완료할 수 있습니다.

초파리 배아의 임베딩. 초파리 배아의 준비된 파라핀 절편을 60도 오븐에 15 분 동안 놓습니다. 자일렌의 100 % 용액에 넣으십시오.

그런 다음 재수화를 시작합니다. 슬라이드를 이러한 각 솔루션에 각각 세 분 동안 놓습니다. 슬라이드가 증류수에 있으면 헤마톡실린 용액에 두 분 동안 놓습니다.

완료되면 슬라이드에서 가능한 한 많은 용액을 배출하십시오. 일단 슬라이드가 증류수로 세척되면, 슬라이드를 에오신으로 1분 동안 염색한다. 마지막으로, 에오신으로부터 슬라이드를 제거하고 증류수로 세척한다.

이 슬라이드가 깨끗해지면 이제 최종 탈수 과정을 시작합니다. 최종적으로 5분 동안 100%xylene에 넣는다. 이 과정은 100 % xylene의 두 가지 새로운 용액에서 반복되며 슬라이드의 한쪽 가장자리를 따라 소량의 중성 껌을 떨어 뜨립니다.

이 커버 슬립을 잡고 슬라이드의 한쪽 가장자리에 부드럽게 놓습니다. 먼저 슬라이드를 100% 자일렌에 배치하여 디파라핀화합니다. 슬라이드가 증류수에서 제거되면 1 % 주기적 산 용액으로 덮어야합니다.

그런 다음 과량의 용액을 버리고 증류수로 헹구십시오. 슬라이드를 예열된 용액에 직접 위치시킨다. 이것이 완료되면 슬라이드를 증류수로 헹구고 0.2 % 금 염화물로 용액을 1 ~ 2 분 동안 착색합니다.

다음으로, 증류수를 사용하여 3분 동안 3% 티오황산나트륨으로 조직을 고정시켰다. 그런 다음 헤마톡실린으로 염색하십시오. 역염색 후, 얼룩은 여기에 나타낸 바와 같이 증류수의 어느 튜브로 세척될 수 있다.

그런 다음 탈수 과정으로 넘어갑니다. 슬라이드를 100 % 자일렌에 직접 넣은 다음 소량의 중성 껌을 슬라이드 모서리에 바르십시오. 커버 슬립으로 부드럽게 덮으십시오.

이전과 같이 디파라핀화와 자일렌을 사용하여 슬라이드 준비를 시작합니다. 이어서, 일대일 자일렌 에탄올을 투입한다. 일단 슬라이드가 탈파라핀화되면, 우리는 그들의 조직을 재수화하기 시작하고 마지막으로 PBS에서 시작합니다.

슬라이드를 메탄올로 만든 0.3% 과산화수소에 10분 동안 놓는다. 그런 다음 슬라이드를 20 mLs의 표적 검색 용액으로 덮습니다. 그런 다음 슬라이드를 염색 상자에 넣을 수 있습니다.

스테인더 박스를 증기선에 넣고 용액이 빠져 나가지 않고 슬라이드가 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 얼룩 상자 뚜껑을 완전히 닫아서 김이 나는 과정에서 수증기가 빠져 나올 수 있도록해서는 안됩니다. PBS-T에서 세 번 부드럽게 헹구었다.

과량의 용액을 버리고 PBS로 이 과정을 반복한다. 다음으로, 슬라이드를 과산화물 블록에서 다섯 내지 10분 동안 인큐베이션한 다음, PBS-T에서 다시 여러 번 헹구고 PBS에서 헹구었다. 항체를 준비하고 조직에 직접 떨어 뜨립니다.

이어서, 이들 조직은 네 시간 동안 또는 실온에서 인큐베이션될 수 있다. 이차 항체는 실온에서 90분 동안 인큐베이션되어야 하며, 이는 2 내지 10분 동안 5%DAB로 염색된다. 적절한 색을 얻은 후 증류수로 헹구고 헤마톡실린으로 역염색하십시오.

이 헤마톡실린 염색 후, 슬라이드는 순차적으로 탈수될 수 있다. 슬라이드를 100 % 자일렌에 넣고 세 분 동안 담그십시오. 그런 다음 소량의 중성 껌을 슬라이드의 한쪽 가장자리에 떨어 뜨립니다.

껌을 놓으면 슬라이드 커버를 가져 와서 슬라이드의 한쪽 가장자리에서 부드럽게 놓습니다. 정제된 선형화된 주형 DNA의 한 마이크로그램을 멸균 RNase-free 반응 바이알에 첨가한다. 그런 다음 멸균 RNase-free DEPC 처리 이중 증류수를 충분히 첨가하여 총 샘플 부피를 13 마이크로 리터로 만듭니다.

그런 다음 간단히 원심분리하고 섭씨 37도에서 두 시간 동안 배양한다. RNase 보호 실험을 위해, 우리는 주형 DNA를 제거하기 위해 RNase-1, RNase-free의 두 마이크로 리터로 15 분 동안 배양하는 것이 좋습니다. 일단 인큐베이션 단계가 완료되면, 8의 pH에서 0.2 몰 EDTA의 2 마이크로리터를 첨가하여 반응을 중지시킨다.

여기에 표시된 단계 이전에 슬라이드는 이전에 입증 된 프로토콜에 따라 탈파라핀화되고 재수화되었습니다. 재수화 후 슬라이드를 각각 5분 동안 pH 7.4에서 PBS 리터당 0.01몰로 인큐베이션하여 조직으로부터 고정제액을 제거하였다. PBS로 헹구고 난 후, 다섯 분 동안 리터당 100 밀리몰 글리신 용액으로 헹구어 조직으로부터 유리 알데히드 그룹을 제거하였다.

이 단계 후, 슬라이드를 PBS로 다섯 분 동안 헹구십시오. 다음에, 헹굼하기 전에 15분 동안 0.3%트리톤 X-100을 함유하는 PBS에서 인큐베이션한 다음, 프로테이나제 K.Next의 마이크로리터당 1마이크로그램으로 다시 인큐베이션하고, 슬라이드를 pH 7.2에서 4%파라포름알데히드 및 PBS로 3분 동안 고정시킨다. 이어서, 0.25% 아세트산 무수물을 함유하는 0.1몰 트리에탄올아민 완충액 pH 8로 인큐베이션하기 전에 슬라이드를 세척한다.

이 단계에서 상자를 기울여 솔루션으로 전체 적용 범위를 보장하도록 선택할 수 있습니다. 상자는 건조 혼성화 상자의 바닥에 20 % 글리세롤 또는 DEPC 물을 첨가하여 제조됩니다. 다음으로, 슬라이드를 20 마이크로리터의 사전 혼성화 용액으로 덮는다.

연어의 정자 DNA는 각 슬라이드에 밀리리터 당 100 마이크로 그램의 농도로 제공됩니다. 그런 다음 섭씨 42도에서 4 시간 동안 배양하십시오. 이것은 미리 준비된 가습 상자에서 수행되어이 과정에서 용액이 건조되지 않도록합니다.

하이브리드화 후 단계에서는 혼성화 용액이 샘플에서 완전히 헹구어지는 것이 매우 중요합니다. 이것은 4 배 농도 SSC, 두 배 농도 1 배 농도, 0.5 배 농도 및 0.1 배 농도 SSC 용액을 사용하여 37도에서 15 분의 연속 헹굼에서 수행 할 수 있습니다. 각각 섭씨 37도에서 15분 동안 배양한다.

이것이 완료된 후, 세척 완충액을 첨가하기 전에 각각 다섯 분 동안 PBS로 세 번 세척한다. 세척 완충액은 다음 단계 전에 일분 동안 헹구어 져야하며 다음 용액을 추가하기 전에 세척 버퍼가 슬라이드에서 완전히 건조되었는지 확인하십시오. 각 슬라이드에 블로킹 용액 100 밀리리터를 넣고 슬라이드를 30 분 동안 인큐베이션하십시오.

이것은 좋은 얼룩을 보장하기 위해 가볍지 않은 환경에서 가장 잘 수행됩니다. 다음으로 슬라이드를 20 mLs의 항체 용액에서 다시 30분 동안 인큐베이션한다. 항체 용액을 슬라이드에 직접 바르면 조직을 완전히 덮을 수 있습니다.

인큐베이션이 완료되면 100 밀리리터의 세척 버퍼를 적용하십시오. 광자유 조건에서 15분 동안 인큐베이션하여 결합되지 않은 항체 접합체를 제거한다. 세척 버퍼를 제거하십시오.

다음으로, 20 밀리리터의 검출 완충액을 적용하고 약 4분 동안 인큐베이션하였다. 네 분 후, 검출 버퍼를 제거한다. 슬라이드를 건조시켜 추가 용액이 없도록 하고 갓 준비한 컬러 기판 용액 10밀리리터를 첨가합니다.

이 반응은 몇 분 안에 시작되지만 16 시간 후에 완료됩니다. 따라서 가벼운 자유 상태에서 그 기간 동안 배양을 허용하십시오. 일단 밴드가 검출되는 원하는 스폿이 50 밀리리터의 TE 완충액으로 슬라이드를 세척하여 반응을 중지시킨다.

그런 다음 이전에 보여준 탈수 과정과 중성 껌 장착 과정을 완료하십시오. 도 하나 및 두 개는 초파리 배아 발달에서 FKBP12 및 DmFKBP12의 발현 프로필에 대한 파라핀 절편에 대한 크롬 알루미늄 젤라틴 코팅 방법 및 임베딩 방법을 입증한다. 도 셋은 세포융합 세포 배반엽 단계에서 검출된 FKBP12 항체의 단백질 분포를 보여준다.

이러한 조직화학적 결과로부터, FKBP12 발현은 세포융합 배모엽에서 덜 편광되고, 이어서 트로피스토배엽 상피 아래의 기저막 내에서 국소화되기 시작하여 전방 및 후방에서 발견되는 더 많은 발현과 함께 구배를 알려준다는 것을 알 수 있다. 초파리 배아의 초기 및 후기 가스 관계 단계를 따르는 그림 네 개는 FKBP12 단백질이 원시 배아 조직의 특정 건축 성분으로 제한됨을 보여준다. 초기 및 후기 위장 배아 단계에서 관찰 된 것보다 세포 외 분포가 적습니다.

흥미롭게도, 상기 기술된 동적 단백질 분포는 도면 5에서 볼 수 있는 바와 같이 FKBP12의 MRI 수준의 상응하는 변화를 수반하지 않는다. 단백질 발현을 나타내는 것은 아직 알려지지 않은 전사 후 분자 메커니즘의 결과이다. 리아노딘 수용체 매개 칼슘 신호전달은 척추동물 및 무척추동물 모두의 많은 생리학적 및 병리학적 과정에서 근본적인 경로이다.

이 유전자의 돌연변이는 질병 또는 조기 심장 사망으로 이어지는 많은 생리 학적 장애를 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 그러나 초기 초파리 발달에서이 유전자가 수행하는 역할은 연구하기가 어려웠습니다. 배아의 통과 성분으로서, 지질이 풍부한 배아와 키틴이 풍부한 쵸리온은 초기 초파리 발달에서 단백질과 배아 발현에 대한 연구를 어렵게 만듭니다.

이 논문에 설명 된 슬라이드 코팅, 배아 매립 및 면역 조직 화학 기술은 우리가 ryanodine 수용체 단백질 및 mRNA의 동적 분포를 자세히 연구 할 수있게 해주었습니다. 우리는 이러한 기술과 Drosophila의 초기 개발 단계에서 다른 단백질을 연구 할 수 있기를 희망합니다.