Name: 이중 챔버 투과성 지원 시스템의 송곳니 장 오가노이드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 배우세요 이중 챔버 투과성 지원 시스템을 활용한 송곳니 장 오가노이드 배양 방법으로 약물 투과성 예측의 신뢰성을 높이는 기술입니다. 이 방법은 개와 인간 모델에서 경구 투여 약물의 흡수를 정확하게 평가하는 데 활용됩니다.

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우리는 아이오와 주립 대학 직원의 수의학 진단 실험실, 즉 헤일리 램버트, 에밀리 라헤, 로잘린 브라나만, 빅토리아 그린, 제니퍼 그롤츠-아구창에게 샘플의 적시 처리에 대한 감사를 표하고 싶습니다. 우리는 또한 투과성 실험을위한 재료를 제공 한 Jodi Smith와 Bethann Valentine에게 감사드립니다. 또한 그림 9에 도움을 준 David Diaz-Reganon에게도 감사드립니다. 그림 6을 제외한 모든 수치는 BioRender.com 로 작성되었습니다. 저자는 교수진 스타트업, ISU VPR 밀러 상, ISU VPR 밀러 어워드, NSF SBIR 서브어워드에서 ISU # 1912948에 대한 지원을 인정하고자 합니다.

K. Allenspach는 LifEngine Animal Health and 3D Health Solutions의 공동 설립자입니다. 그녀는 Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics 및 Mars의 컨설턴트로 활동하고 있습니다. J.P. Mochel은 LifEngine Animal Health and 3D Health Solutions의 공동 설립자이며 Ceva Animal Health 및 Ethos Animal Health의 컨설턴트로 활동하고 있습니다. 이 기사는 저자의 견해를 반영하며 식품 의약품 안전청의 승인, 견해 또는 정책을 나타내는 것으로 해석되어서는 안됩니다. 다른 저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

투과성 지지 장치 내의 송곳니 장내 오가노이드 배양물은 전통적인 약물 투과성 분석법(40 )과 신규한 시험관내 송곳니 모델(41)을 연결하는 독특한 개념이다. 다양한 유형의 송곳니 장 오가노이드를 사용하고 최소한의 조정으로 실험의 목표에 따라 평가할 수 있습니다. 그룹당 3-4 웰에서 관심있는 약물의 여러 농도를 테스트하는 것이 좋습니다. 농도는 약물의 예상 장 농도를 기준으로 할 수 있습니다. 또한, 이전 연구를 사용하면 연구 설계에 적합한 시점을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 재현성을 높이고 문제 해결을 돕기 위해 연구 설계에 대한 적절한 문서화가 이루어져야합니다.
이 기술은 방법42의 참신함으로 인해 몇 가지 한계가 있으며, 주로 실험 설계의 표준화가 부족하고 실험실에서 프로토콜을 실행하기 때문입니다. 이러한 표준화의 부족은 다른 그룹(43)에 의해 인정되었으며, 송곳니 3D 오가노이드 단층 프로토콜은 실험실 간 재현성을 유도하고 이 시스템에 표준화를 도입할 것이다. 데이터 분석에 대한 표준화 된 접근 방식은 재현성을 향상시키고 다른 실험실의 투과성 지원 시스템에서 송곳니 오가노이드를 사용하여 예비 약물 테스트 결과를 강화할 수 있습니다. 송곳니 3D 오가노이드 모델은 또한 Caco-2 세포44,45,46과 마찬가지로 모델 약물의 시험관내 Papp 값을 알려진 인간 또는 개 생체 내 장 흡수와 비교하는 데이터 세트가 부족합니다. 일단 이러한 데이터가 생성되면,이 송곳니 오가노이드 모델은 약물 개발 동안 장 투과성을 평가하기 위해 활용 될 수있다.
적절하게 해리 된 세포의 높은 밀도를 시드하기 위해 투과성 지지 시스템에 오가노이드를 시드 할 때주의를 기울이는 것이 중요합니다. 시스템의 TEER 값은 엄격한 단층에서 성장할 때 더 신뢰할 수 있고 재현 가능합니다. 단층의 장기간의 배양은 장의 생리적 값으로부터 더 멀리 도달하는 TEER 값의 기하 급수적 인 증가로 이어질 수 있습니다. 그런 다음 이러한 3D 구조의 H &amp; E 섹션은 막에 더 가까운 장세포의 변경된 구조로 서로 위의 여러 층의 세포를 보여줍니다.
송곳니 장내 오가노이드 단일층의 성공적인 확장 후, 약물의 겉보기 투과성 계수(Papp) 식44를 계산함으로써 기존의 2D 세포 분석과 동일한 방식으로 결과를 분석할 수 있다. Papp 값(Eq(2) 참조)은 셀룰러 단일층(47)을 가로지르는 수송 속도를 기술한다.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
는 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq03.jpg" style="margin: auto;"> 농도 대 시간 곡선의 초기 기울기(예를 들어, nmol/s)이다. A는 삽입물의 면적(cm2)이고, C0는 공여체 챔버(37) 내의 약물 또는 화합물의 초기 농도이다. 단층 무결성에 대한 신뢰할 수 있는 인식은 표준화가 필요한 투과도 분석의 중요한 부분입니다. 광 현미경 및 TEER 측정은 투과성 지원 시스템에서 송곳니 오가노이드를 평가하고 실험의 정확한 타이밍을 결정하는 데 도움이 되는 것이 좋습니다. 추가적으로, 제로 분자 투과성 마커 (예를 들어, FITC-덱스트란, 루시퍼 옐로우, PEG-400)는 오가노이드 단층 완전성을 기능적으로 평가하는데 사용될 수 있다. 테스트 된 화합물이 운송업자의 영향을받는 경우주의를 기울여야합니다. P-당단백질(P-gp)은 일반적인 유출 펌프의 예로서 사용된다. 잘 알려진 P-gp 프로브 기판과 비교하여 유출 비율 (P app, BL-AP / Papp, AP-BL)을 생성해야합니다.
광 현미경 (위상 대비로 일반 또는 강화)은 가능한 세포 과성장을 평가하면서 2D 또는 3D 단층 및 필터 삽입물의 무결성을 확인하는 데 매우 중요한 방법입니다. 도 7은 건강한 송곳니 장내 오가노이드 세포 배양물을 인식하기 위한 가이드로서 작용할 수 있다. TEER 값은 세포간 접합의 형성과 오가노이드 배양물을 온전한 장 상피로 분화시키는 중요한 척도이다. 송곳니 장 오가노이드는 장세포와 잔 세포로 분화됩니다 (그림 6). 이러한 점액-생성 세포는 약물-점액 상호작용의 연구를 허용하며, 이는 전통적인 2D 세포 배양물(48)을 사용하여 달성하기 어려웠다. 장내분비 세포의 존재는 Chandra et al.33에 의해 송곳니 장 오가노이드에서 이전에 확인되었다.
TEM을 사용하는 제주날, 장폐색 및 결장 오가노이드로부터 유래된 송곳니 오가노이드 단층의 추가적인 특성화가 제공된다. TEM 이미지는 단단한 접합부와 미세 융모 형성을 포함한 세포 미세 구조를 보여 주며 번역 의학에서 이러한 오가노이드 모델의 복잡성과 유용성을 더욱 보여줍니다. 실험 결과에 기초하여, 투과성 지지체 상의 오가노이드 배양물을 시딩 후 11일째와 13일째 사이에 실험을 위해 준비하였다(도 9). 이 시점의 TEER 값은 1,500에서 2,500 사이Ω.cm2 사이였습니다. TEER 값의 고원 단계는 TEER 값이 천천히 감소하기 시작하기 전에 실험을 시작해야하는 매우 제한된 시간 동안 지속됩니다. TEER 값은 또한 일부 약물 또는 약물 제품 부형제가 TEER 값 판독에 큰 영향을 줄 수 있는 단층(예를 들어, 타이트한 접합부)과 상호작용할 수 있기 때문에 중요한 실험 결과를 표시하는 데 중요한 부분이 될 수 있다. 이것만으로도 실험을위한 데이터 역할을 할 수 있습니다.
이중 챔버 세포 배양 장치에서 송곳니 장내 오가노이드는 생성된 세포 단일층의 독특한 구조로 인해 경구 약물 투과성 이외의 분야에 적용될 수 있다. 예를 들어, 이들은 미생물학 연구 (예를 들어, GI 미생물 세균총의 변경의 영향), 바이러스 흡수 연구, 약물 - 약물 상호 작용 및 약물 수송 메커니즘(49)에 사용될 수 있다. 공여체 챔버는 전형적으로 선택된 시험 약물 또는 화합물로 충전되고, 수신기 챔버로부터의 분취량은 다양한 시점에서 취해진다. 이들 분취량은 고성능 액체 크로마토그래피, 질량 분광법, 효소-결합 면역흡착 분석, 또는 다른 기술을 사용하여 분석될 수 있고, 용질이 단층을 통해 투과하는 양 및 속도를 결정할 수 있다.
이러한 연구는 약물 투과성을 정확하게 평가하기 위해 손상되지 않은 단층이 필요합니다. 이것은 일반적으로 사용할 수없는 우물을 설명하는 데 필요한 것보다 많은 단층 층을 성장시켜야합니다. 오가노이드 세포 단층은 또한 단층의 정점 또는 기저 측에서 바이러스 흡수를 측정하기 위해 사용될 수 있으며, 바이러스의 세포 흡수를 검출하기 위해 면역 형광 분석을 활용하는 항체를 포함한 판독 값을 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 다수의 약물(즉, 기질 및 억제제)을 공여자 챔버에 적용하여 수송체-기반 약물-약물 상호작용을 식별할 수 있다.
현재의 관찰에 기초하여, 이러한 방법은 배양 인서트의 송곳니 오가노이드에 적용 할 수있을뿐만 아니라 다른 수의학 종 및 장기 시스템에도 적합 할 것이며, 선택한 종 또는 장기 모델에 가장 적합한 사소한 수정이 필요합니다. 송곳니 장 오가노이드 성장을위한 프로토콜은 배양물의 고유 한 특성에 따라 조정되어야했습니다. 따라서, 프로토콜은 다른 종으로 조정될 수 있지만, 프로토콜에 대한 미묘한 변경이 필요할 것이다. 변형은 세포 시딩 밀도의 변화로 시작하고, 관심있는 오가노이드를 적절하게 분화시키기 위해 배지 조성물의 변화로 확장될 수 있다.
표준화, 실험 절차에 대한 상세한 문서화 및 세포 단층의 일관된 모니터링은 투과성 지원 분석 전반에 걸쳐 필요한 중요한 관행이며 송곳니 시스템에 국한되지 않습니다. 이러한 가능한 종 또는 장기 수정은 현장에서의 추가 발전을 위해 문서화하고보고하는 데 중요합니다. 이 모델은 비용 요구 사항, 실험실 간 변동성 및 생체 내 장 흡수를 예측하는 능력에 대한 제한된 데이터와 같은 몇 가지 제한 사항을 가지고 있습니다. 개들은 어떤 경우에는 인간보다 다른 약물 수송체와 대사 효소를 가지고있습니다 50.
또한, 송곳니 오가노이드 시스템은 그러한 모델의 적합성을 결정하기 위해 다른 제조업체로부터의 다양한 다른 이중 챔버 장치 상에서 시험되어야 한다(예를 들어, 상이한 필터 멤브레인 조성물의 적합성이 결정되어야 함). 또 다른 단점은 원고의 약물 투과성 실험 부분이 이전 부분보다 덜 설명적이라는 것입니다. 이는 이 필드의 과도한 정보 때문에 발생합니다. 원고의이 부분의 목표는 이러한 실험의 초석의 가장자리를 자르지 않고 수정 가능한 방식으로 이러한 방법을 설명하는 것이 었습니다. 투과성 실험에 대한 보다 상세한 정보는 Hubatsch et al.37에 의해 수집되었다. 추가적으로, 투과성 삽입물은 공동 배양, 세포 이동, 및 침윤 분석 실험4에 사용될 수 있다.
결론적으로, 이중 챔버 배양 장치의 송곳니 장 오가노이드는 생물 의학 분야 및 번역 의학을 포함한 광범위한 응용 분야에서 사용될 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 실험을 계획하고 생물학 분야의 오가노이드 모델에 대한 실험실 간 데이터 신뢰성을 촉진하기위한 몇 가지 전략을 수립합니다.

투과성 지지 시스템은 전형적으로 장 상피 장벽 1,2를 통해 치료 약물 후보의 겉보기 투과성을 결정하기 위해 사용된다. 이들은 또한 세포 분비3, 세포 이동4 및 약물 독성5를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 시험관내 경구 약물 투과성 분석은 약물 발견 및 개발 과정2의 핵심 단계이며, 개별 약물 후보는 약물 R &amp; D 수명주기6의 초기 단계에서 테스트됩니다. 투과성 지지체 시스템은 멀티웰 플레이트에 배치된 반다공성 멤브레인을 갖는 삽입물로 구성된 이중 챔버 세포 배양 장치이다. 이 시스템은 인서트(7)에서 성장한 세포-단일층의 정점 및 기저측 측에 직접 접근할 수 있게 한다. 이들 시스템에 사용되는 단층은 전형적으로 위장관 상피 세포 (예를 들어, 인간 결장직장 선암종 Caco-2 세포주)8로부터 유래된다. 세포 배양물은 장 상피 세포의 자연적인 미세 구조를 모방하는 편광 상태에서 성장하여, 추가적인 세포 분화, 유사한 미세해부학 및 기능을 가능하게한다7. 투과성 지지 인서트에 대한 자세한 내용은 그림 1에서 확인할 수 있습니다. 전통적으로 장내 약물 투과성을 평가하기 위해 사용되었던 2D 세포 배양물을 사용한 인서트의 시딩은 비교적 저렴하고 배양하기 쉽다9. 이들 시스템은 치료 약물 후보(10,11)의 장 대사를 예측하는 그들의 제한된 능력을 포함하는 몇 가지 주요 한계를 제시한다. 이것은 상피 세포 사이의 타이트한 접합을 통한 수동 흡수, 유출을 통한 활성 경상피 흡수, 또는 흡수 수송체 (예를 들어, P-당단백질, 모노카르복실레이트 수송체 1) 및 장세포에 의해 대사되는 약물에 대한 모든 약물 흡수에 대해 참말이다.
개는 인간과 공통된 환경과 식단을 공유합니다12. 송곳니 장 해부학 및 미생물 구성은 지난 36,000 년 동안 가축화 및 공유 식단에 기인 한 인간 13의 것과 매우 유사합니다14. 불행히도, 이러한 유사성은 또한 질병 발달을위한 일반적인 원인 / 트리거가 될 수 있습니다. 개들은 비만 15, 염증성 장 질환 16, 결장직장 선암종17, 위장관 간질 종양 (GIST)18 및 상대적 장수와 관련된 다양한 다른 병리와 같은 인간과 유사한 만성 이환을 일으킨다 19. 따라서, 송곳니 오가노이드는 One Health Initiative20의 정신으로 이러한 만성 다인자 질환의 역번역 연구에 성공적으로 사용될 수 있다.
Caco-2 세포는 약물 경구 흡수 분석(21)에 가장 많이 사용되는 세포주이다. 이들 세포는 현재 시험관내 장 투과성 검정2,22,23에 대한 "황금 표준" 모델로 간주된다. Caco-2 세포주는24,25,26 발현 수준이 다르지만 인간 장내에서 발견되는 유출 및 흡수 수송체를 발현한다. Caco-2 세포는 또한 약물이 장 유출 수송체22,27의 기질 또는 억제제인지 여부를 결정하기 위한 모델로서 널리 사용된다. Caco-2 세포는 결장 기원이지만 장세포 세포를 모방합니다. 불행히도, Caco-2 세포는 소장9의 상피층으로부터 하나의 세포 유형만을 나타내며, 이는 복잡한 장 상피 세포 유형 조성물을 정확하게 재구성하지 못한다. 예를 들어, 점액 생산에 전념하는 잔 세포는 Caco-2 배양물에서 부재하므로 점액-약물 상호작용은 다른 세포주(28)와의 공동 배양 없이는 평가될 수 없다. 더욱이, Caco-2 배양물은 장내에 전형적으로 존재하는 몇몇 중요한 핵 수용체, 예컨대 프레그난 X 수용체 (PXR), 스테로이드 X 수용체 (SXR), 및 구성적 안드로스탄 수용체 (CAR)29를 발현하지 않는다. 결과적으로, Caco-2 배양물은 이들 수용체(예를 들어, 리팜핀)30의 유도제인 특정 약물에 의한 약물 수송체 및 효소의 유도를 모델링하지 못한다.
3D 장 오가노이드 기술은 이러한 제한 사항 중 일부를 해결합니다19. 오가노이드는 미세침습적 기술(20)을 사용하여 수확된 조직 샘플로부터 확립될 수 있는 성체 줄기 세포로부터 유래된 자기조립된 작제물이다. 인간-유도된 만능 줄기 세포는 장 투과성 모델31,32에 채용되고 있다. 송곳니 오가노이드는 인간 줄기 세포 연구가 윤리적 인 문제33에 의해 제한되기 때문에 인간 오가노이드에 대한 관련 대안을 제공합니다. 또한, 송곳니 오가노이드는 송곳니 약물 투과성, 신진 대사, 활성 수송 및 약물 - 약물 상호 작용을 탐구하기위한 시험관 내 시스템을 제공합니다. 이러한 기술 격차를 해결하기 위해, 투과성 지지 시스템에서 송곳니 장 오가노이드의 일관되고 신뢰할 수 있는 성장이 설명되었다(34). 송곳니 장내 오가노이드를 사용한 투과성 분석은 현재 사용되는 분석법 (Caco-2)과 비교하여 송곳니 장 투과성 및 작은 약물 분자의 신진 대사를 잠재적으로 예측할 수 있습니다. 이러한 중추적 인 특징의 확인은이 새로운 시험관 내 시스템을 세포 내 신진 대사 및 활성 수송에 대한 유도제의 잠재적 인 영향을 탐구하는 미래의 연구에 제공합니다.
송곳니 오가노이드는 장의 상피층에 전형적으로 존재하는 모든 세포 유형으로 구성된다. 기능적 및 미세 해부학 적 관점에서 볼 때, 그들은 송곳니 장19,35의 상피층의 환경을 안정적으로 복제합니다. 더욱이, 점액, 송곳니 특이적 약물 수송체 및 효소의 존재, 및 송곳니 장내 오가노이드에서의 전반적인 세포 분화는 개34에서 생체내에서 보여지는 것과 필적한다. 따라서, 오가노이드는 병든 수의학 환자로부터 단리될 수 있고, 송곳니 경구 약물 투과성(19,36)에 대한 다양한 질병 과정(예를 들어, 만성 장 염증)의 효과를 모델링하는데 사용될 수 있다. 송곳니 장 오가노이드 시스템은 약물 투과성 실험 이외의 다른 설정에서도 사용할 수 있습니다. 이들 3D 구조물은 또한 염증성 장 질환, 결장직장 선암종, 및 위장관 간질 종양(19)에 대해 Chandra et al.에 의해 이전에 기술된 바와 같이 병든 환자로부터 단리될 수 있다.
투과성 지원 시딩 프로토콜은 삽입물에 송곳니 장내 오가노이드 배양을 확립하는 방법을 설명합니다. 이 첫 번째 프로토콜은 세포외 막 매트릭스에 도금 된 확립 된 송곳니 오가노이드 배양물을 해리시키는 방법을 설명합니다. 또한, 콜라겐 I 및 세포외 막 매트릭스를 사용한 삽입물의 예비코팅이 이 프로토콜에서 논의된다. 투과성 지지 인서트에 송곳니 오가노이드를 임베딩하는 것 또한 상세히 설명된다.
두 번째 프로토콜은 인서트에 도금 된 송곳니 3D 오가노이드의 일반적인 유지 보수를 포함하는 단층 유지 보수 프로토콜입니다. 배양물을 새로 고치는 데 사용되는 오가노이드 배지의 빈도 및 부피 및 세포 배양 손상을 방지하는 방법은 상피 단일층의 합류성을 평가하기 위한 실험 방법과 함께 이 두 번째 프로토콜에서 제시된다.
마지막으로, 투과성 실험 프로토콜은 투과성 분석에서 송곳니 장 3D 오가노이드가 실험용으로 준비되었는지 여부와 실험을 수행하기 전에 필요한 검증 단계를 결정하는 방법에 중점을 둡니다. 이 섹션에서는 또한 단층 배양의 챔버에서 치료 약물 후보의 인큐베이션 및 샘플링과 함께 투과성 실험의 설정 및 성공적인 실행에 대해 설명합니다. 단층 무결성을 모니터링하기 위해 낮은 투과성 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC-dextran)의 사용이 또한 논의된다. 마지막으로, 실험 종료 후 결과를 검증하기 위한 시험관내 평가 방법이 기재되어 있다. 투과성 실험은 매우 방대한 주제이며 Hubatsch et al.37에 의해 매우 잘 요약되어 있습니다. 프로토콜의 워크플로우는 그림 2에 요약되어 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig01.jpg"> 그림 1: 투과성 지지 시스템의 송곳니 장 오가노이드. 투과성 지지 인서트는 24웰 플레이트의 웰에 위치한다. 미세 다공성 멤브레인은 해리 된 송곳니 장 오가노이드의 시딩을 허용하며,이 세포는 결국 오가노이드 2D 단일층을 형성합니다. 이 기술은 단층의 AP 및 BL 측면 모두에 대한 액세스를 허용합니다. 오가노이드 배지는 투과성 지지체의 AP 및 BL 챔버 둘 다에 도입된다. 약물 후보의 흡수 (AP→BL) 및 분비 (BL→AP)뿐만 아니라 두 가지 가능한 약물 수송 모드가 예시된다. 약어: AP = apical; BL = 기저측방. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig02.jpg"> 그림 2: 송곳니 오가노이드 투과성 지원 프로토콜의 워크플로우. 투과성 지지체 삽입물은 세포외 막 매트릭스와 콜라겐 I의 혼합물로 예비코팅되고 1시간 동안 인큐베이션된다. 인큐베이션 과정 동안, 오가노이드 배양물은 해리된다. 개별 오가노이드 세포는 인서트에 시딩되고, 기저측성 챔버 내의 배지는 시딩 직후에 첨가되고, 정점 챔버에 배지는 시딩 과정이 끝난 후 24시간 후에 첨가된다. 오가노이드의 유지 및 모니터링에는 단층의 무결성을 평가하기 위한 정기적인 중간 변화, TEER 값 측정 및 광 현미경이 포함됩니다. 실험 전에, 오가노이드는 배지로부터 ROCK 억제제 및 GSKiβ를 제거함으로써 분화되어야 한다. TEER 값은 실험 당일에 측정되며, 오가노이드 단층은 광 현미경을 통해 세포 손상을 검사합니다. 이어서, 배지는 적절한 완충액으로 교환되고 실험 전에 인큐베이션된다. FITC-덱스트란 분석은 단층 완전성의 마커로서 장 투과성 실험39 동안 사용된다. TEER 측정은 실험 후에 취해지고, 광 현미경은 24 시간 후에 결과를 검증합니다. 약어: TEER = 경상피 전기 저항; ROCK = 로-관련 키나제; GSKiβ = 글리코겐 신타아제 베타; F = 형광. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>오가노이드 매체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ROCK 억제제 (Y-27632)</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>SCM 075</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I human</td><td>Sigma</td><td>G9145-.5MG</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>PeproTech</td><td>9094360</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>글루타민 대체물</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR 생명 과학</td><td>J848-500ML</td><td></td></tr><tr><td>인간 R-Spondin-1</td><td>PeproTech</td><td>120-38-500UG</td><td></td></tr><tr><td>쥐 EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-1MG</td><td></td></tr><tr><td>쥐 Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38-250UG</td><td></td></tr><tr><td>쥐 Wnt-3a</td><td>PeproTech</td><td>315-20-10UG</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸-L-시스테인</td><td>시그마</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>프리모신</td><td>인비보젠</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>SB202190 (P38 억제제)</td><td>시그마</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>스테몰CHIR99021 (GSK3&베타;)</td><td>Reprocell</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>TMS (trimethoprim sulfate)</td> <td>Sigma</td><td>T7883-5G</td><td></td></tr> <tr><td>< 강> 시약 < / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>아세트산, 빙하</td><td>피셔 화학</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>알파 D (+) -포도당, 99 + %, 무수</td><td>Acros Organics</td><td>170080010</td><td></td></tr><tr><td>세포 회수 솔루션</td><td>Corning</td><td></td><td></td>354253</tr><tr><td>콜라겐 I, 쥐 꼬리 3 mg/mL</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-덱스트란</td><td>밀리포어 시그마</td><td>68059-1G</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 (37%)</td><td>Fisher Chemical</td><td>F79P-4</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 용액</td><td>시그마</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix For 오가노이드 배양</td><td>Corning</td><td>356255</td><td>세포외막 매트릭스</td></tr><tr><td>파라포름알데히드, 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x(인산염 완충 식염수)</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>트립신 유사 프로테아제</td></tr><tr><td><강력>재료 및 장비</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>9" 파스퇴르 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell 6.5 mm 폴리에스터 막 삽입물은 24-웰 배양 플레이트에 사전 로드되어 있으며, 기공 크기: 0.4 &마이크로; m, 멸균</td><td>코닝</td><td>3470</td><td>투과성 지원</td></tr><tr><td>밀리셀 ERS (프로브)</td><td>Millipore 시그마</td><td>MERSSTX01</td><td></td></tr><tr><td>밀리 셀 ERS-2 전압 저항계</td><td>Millipore 시그마</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Panasonic 인큐베이터</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170ML-PA</td><td></td></tr><tr><td>파라 필름 M 포장 필름</td><td>Bemis Company Inc</td><td>PM996 / EMD</td><td>유연한 실험실 필름</td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트 24 웰</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012929</td><td></td></tr></tbody></table>

이중 챔버 투과성 지원 시스템의 송곳니 장 오가노이드

Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

투과성 지지 시스템은 전형적으로 새로운 치료 약물 후보물질의 경구 투과성을 평가하기 위한 시험관내 도구로서 전통적인 2차원(2D) 세포주와 함께 사용된다. 그러나, 이러한 종래의 세포주의 사용은 타이트한 접합의 변경된 발현, 부분 세포 분화, 및 주요 핵 수용체의 부재와 같은 한계를 갖는다. 이러한 단점에도 불구하고, Caco-2 및 MDCK 모델은 인간 생체내 경구 투과성의 예측을 위해 널리 받아들여지고 검증된다.
개는 위장 해부학 및 인간과의 장내 미생물과의 유사성으로 인해 생물 의학 연구를위한 관련 번역 모델입니다. 따라서, 병행 약물 개발을 지지하며, 개와 인간 모두에서 생체내 약물 투과성 특성을 예측하기 위한 효율적이고 정확한 시험관내 도구의 정교화가 매우 바람직하다. 이러한 도구는 성체 줄기세포로부터 유래된 3차원(3D), 자기조립된 상피 구조를 특징으로 하는 송곳니 장내 오가노이드 시스템일 수 있다.
(1) 투과성 지원 시딩 프로토콜은 인서트에서 송곳니 오가노이드를 해리시키고 시딩하는 실험적 방법을 설명합니다. 송곳니 오가노이드 분리, 배양 및 수확은 이전에이 특별한 문제에서 별도의 프로토콜 세트에 설명되어 있습니다. 송곳니 장내 오가노이드 단일층의 일반적인 유지를 위한 방법은 (2) 단층 유지 프로토콜에서 철저하게 논의된다. 추가적으로, 이 프로토콜은 경상피 전기 저항(TEER) 측정 및 광 현미경을 통해 단층의 구조적 완전성을 평가하는 방법을 기술한다. 마지막으로, (3) 투과성 실험 프로토콜은 실험 결과의 시험관내 검증을 포함하여 실험 직전에 선행하는 작업들을 기술한다.
전반적으로, 이중 챔버 세포 배양 기술과 결합 된 송곳니 오가노이드 모델은 2D 실험 모델과 관련된 한계를 극복함으로써 송곳니와 인간 환자 모두에서 치료 약물 후보의 명백한 구강 투과성에 대한 예측의 신뢰성을 향상시킵니다.

송곳니 오가노이드의 배양을 위한 표준 작동 절차는 이전에 기술되었고, 33, 송곳니 오가노이드 프로토콜은 또한 이 특별 호38에서 상세히 논의되었다. 투과성 지지체 상에서 배양된 송곳니 장내 오가노이드를 고정시키고 파라핀-포매하여 단층 및 세포 집단의 미세해부학을 조사하였다. 파라핀-포매화 과정은 이전에 Gabriel et al.38에 의해 논의되었다. 일상적인 염색 (헤마톡실린 및 에오신)이 수행되었으며, 알시안 블루 염색 기술은 송곳니 오가노이드 단층에서 잔 세포를 검출하는 데 사용되었습니다 ( 그림 7 참조).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig07.jpg"> 도 7: 송곳니 장 오가노이드 단층 염색. 투과성 지지체 내의 결장 기원의 송곳니 장 오가노이드는 파라핀을 포매하고 H&amp;E 및 AB로 염색하였다. 대표적인 이미지는 40x(A) 및 60x(B) 배율에서 광 현미경을 사용하여 촬영되었다. H &amp; E 염색은 원주형 상피 단층을 나타내며 세포의 정점 부분의 미세 융모는 60x 배율로 관찰 될 수 있습니다. AB 염색은 송곳니 장 오가노이드 단일층에서 잔 세포 (진한 파란색)의 존재를 추가로 밝혀냅니다. 스케일 바 = 20 μm (A), 50 μm (B). 약어: H&amp;E = 헤마톡실린과 에오신; AB = 알시안 블루. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
투과성 지지체 상의 오가노이드 배양물을 투과성 실험을 위해 준비하기 위해 10 내지 14일 동안 성장시켜야 한다. 광 현미경은 TEER 값 측정과 함께 사용되어 약물 후보의 투과성 테스트를위한 오가노이드 배양의 준비 상태를 확인합니다. 건강하고 병든 동물로부터의 상이한 송곳니 장내 오가노이드 단층의 대표적인 광 현미경 이미지가 도 8에 제시된다.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig08.jpg"> 그림 8 : 송곳니 장 오가노이드 단층 현미경. 가벼운 현미경에서 볼 수 있듯이 성장하는 단층의 이미지. 건강한 공여체로부터 유래된 오가노이드 단층은 제준 엔테로이드(10x; 40x) 및 콜로노이드(20x; 40x) 배양물로 대표된다. 병든 기증자의 오가노이드 단층은 PLE로 진단된 송곳니 환자로부터 유래된 십이지장(5x; 10x) 및 장폐색(5x; 10x) 엔테로이드로 표현된다. 두 PLE 오가노이드 배양물 모두 오가노이드의 시딩 동안 부적절한 세포 단리의 예이며, 이들 배양물은 3D 오가노이드의 존재 때문에 약물 투과성 분석에 사용될 수 없었다. 단층 눈물 (5x)과 같은 적절한 단층 형성으로부터의 편차의 예는 생물학적 샘플의 신중한 조작에 의해 야기된다. 오가노이드 (10x; 20x)의 장기간의 문화는 오가노이드가 원래의 3D 구조와 유사하기 시작할 때 인서트에서 오가노이드가 오래 유지되기 때문에 발생합니다. 비교를 위해, 약물 투과성 연구에 일반적으로 사용되는 투과성 지지체 상의 전통적인 2D 세포주의 이미지가 제시된다(MDCK-10x; 40x, 및 Caco-2-10x; 20x). 약어: PLE = 단백질-손실 장병증; MDCK = 마딘 - 다비 송곳니 신장. 스케일 막대 = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
오가노이드 단층은 또한 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 중의 3% 파라포름알데히드-3% 글루타르알데히드에 고정되었다. 투과 전자 현미경 (TEM)은 투과성 지지체 상의 오가노이드 배양물의 초구조를 특성화하기 위해 사용되었다. 미세 융모와 단단한 접합부의 미세 해부학 적 구조는 그림 9에서 볼 수 있습니다.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig09.jpg"> 그림 9: 건강한 송곳니 장 오가노이드 단일층의 TEM 이미지. TEM은 제주날 (A), 장막 (B) 및 결장 (C) 오가노이드 단일층의 세포 미세구조를 밝히기 위해 사용되었다. 투과성 지지체 인서트의 미세다공막은 노란색 화살표로 표시되어 있다. 미세 융모 (파란색 화살표)와 단단한 접합부 (빨간색 화살표)의 존재가 이미지에 묘사되어 있습니다. 약어 : TEM = 투과 전자 현미경. 스케일 바 = 5 μm (A), 2 μm (B, C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig09large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
TEER 측정과 광 현미경 모두 수행하여 시스템이 투과성 테스트를 수행할 준비가 되었는지 확인해야 합니다. 이 분석은 TEER가 정상 상태에 도달하면 사용할 준비가되며, 가벼운 현미경 검사는 오가노이드의 손상 또는 과성장을 배제하는 데 도움이됩니다. 송곳니 제준 엔테로이드 및 콜로노이드로 구성된 다섯 그룹의 전형적인 TEER 측정치의 요약이 도 6에 제시되어 있다.
표 1: 오가노이드 매질 및 FAA의 조성. CMGF +, CMGF + R / G 및 FAA의 전체 구성이이 표에 요약되어 있습니다. 약어: ROCK = 로-관련 키나아제; GSKiβ = 글리코겐 신타아제 베타; CMGF+R/G = ROCK 억제제 및 GSKiβ로 강화된 성장 인자를 갖는 완전한 배지; CMGF+ = 성장 인자가 있지만 ROCK 억제제 또는 GSKiβ가 없는 완전한 배지; FAA = 포르말린-아세트산-알코올; EGF = 표피 성장 인자. 이 테이블은 38에서 조정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Table%201%20(8).xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 송곳니 오가노이드에 대한 투과성 지지 시스템에 대한 메모 작성을 위한 표. 약어: TEER = 경상피 전기 저항; ROCK = 로-관련 키나제; GSKiβ = 글리코겐 신타아제 베타; CMGF+R/G = ROCK 억제제 및 GSKiβ로 강화된 성장 인자를 갖는 완전한 배지; CMGF+ = 성장 인자가 있지만 ROCK 억제제 또는 GSKiβ가 없는 완전한 배지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Supplementary%20Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서, 우리는 이중 챔버, 투과성 지원 시스템에서 송곳니 장 오가노이드의 배양을 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 투과성 지지체에서의 오가노이드 시딩, 단층 유지, 및 후속 약물 투과성 실험이 기재되어 있다.

The permeable support system is typically used in conjunction with traditional two-dimensional (2D) cell lines as an in vitro tool for evaluating the oral ...

개 오가노이드 기술과 이중 챔버 투과성 지원 시스템의 결합은 전통적으로 생물 의학 연구 모델에 사용되던 실험용 2D 세포주의 한계를 극복합니다. 이 기술은 송곳니와 인간 환자 모두에서 치료 약물 후보의 명백한 구강 투과성 예측의 신뢰성을 높일 수 있습니다. 이 시스템은 미생물학 연구, 바이러스 흡수 연구, 약물-약물 상호 작용 및 약물 전달 메커니즘을 포함한 다른 생물 의학 연구 분야에 적용할 수 있습니다. 표준화, 실험 절차의 자세한 문서화 및 세포 단층의 일관된 모니터링은 투과성 지지체 분석에 필요한 중요한 관행입니다. 세포외막 기질을 얼음 위에 올려 놓고 해동을 시작합니다. 급격한 해동을 방지하고 응고를 방지하기 위해 얼음에 담그십시오. 냉장 원심분리기를 4도로 사전 냉각합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

3D 오가노이드 배양물을 확립하기 위해 송곳니 장 및 간 조직으로부터 성체 줄기 세포를 수확하는 실험 방법이 기재되어 있다. 또한, 일관된 성장을 보장하고 수확, 바이오 뱅크 및 개 장 및 간 오가노이드 배양을 부활시키기위한 표준 운영 절차를 제공하기위한 실험실 기술이 논의됩니다.

생물 의학 연구에 사용하기위한 3D 송곳니 간 및 장 오가노이드 문화의 표준화 및 유지 보수

생검 유래 장 오가노이드 및 장기 온 칩 기술은 미세 생리학 플랫폼으로 결합되어 영역 별 장 기능을 재구성합니다.

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

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