Name: 높은 생존력 조직 수집을 위한 설치류의 최소 침습 뇌종양 절제술 시행 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 학습하세요 설치류 뇌종양 최소 침습 절제술을 통해 동물 생존과 조직 보존을 동시에 달성하는 방법을. 이 기술은 전임상 연구에서 질병 진행과 치료 효과를 종단적으로 분석하는 데 필수적입니다.

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모든 동물 연구는 메릴랜드 대학과 존스 홉킨스 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. C57BL/6 암컷 마우스, 6-8주령을 본 연구에 사용하였다. 마우스는 상업적 출처로부터 수득하였다( 재료 표 참조). 마스크, 장갑 및 가운 사용을 포함한 모든 생물안전 레벨 2(BSL-2) 규정을 준수했습니다.
1. 초기 두개내 종양 이식
<ol><li>연구의 초기 단계에서, 이전에 발표된 보고서7에 이어 4μL의 인산염 완충 식염수(1x PBS)에 현탁된 100,000개의 세포(GL261 뮤린 신경교종 세포주)를 2.5mm 깊이까지 각 마우스에 두개내 주사합니다.</li>
	<li>종양 이식후 8일 9일에 생체내 영상화 시스템을 사용하여 각각의 마우스에서 종양 신호를 정량화한다. 참고: 필요한 경우 종양 부담에 따라 마우스를 두 그룹으로 계층화합니다. 본 연구에서, 두 그룹은 (1) 상대적으로 작은 종양 부담을 가진 마우스 (평균 생체 발광 신호 = 5.5e + 006 ± 0.1e + 006 광자 / s, n = 10) 및 (2) 상대적으로 큰 종양 부담을 가진 마우스 (평균 생체 발광 신호 = 1.69e + 007 ± 0.2e + 007 광자 / s, n = 10), (p < 0.05, Mann-Whitney 테스트) 9.</li>
	<li>각 그룹을 두 개의 비교 가능한 하위 그룹으로 나눕니다. 참고: 이 연구에서, 두 개의 하위군은 다음과 같다: 미처리 마우스 (n=5) 및 MIRS를 사용하여 외과적 절제술을 받는 종양이 있는 마우스(n=5), (p > 0.05, Mann-Whitney test)9.</li>
	<li>절제 당일부터 시작하여, 종양 성장 패턴에 기초한 빈도로 생체내 영상화 시스템을 사용하여 종양 진행을 추적한다. 참고: GL261 세포주의 경우 절제 당일과 3-6일마다 종양 진행을 추적합니다.</li>
</ol>2. MIRS를 이용한 종양 절제술
<ol><li>유도 챔버에서 이소플루란-O2 가스 혼합물을 사용하거나 자일라진/케타민 용액을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다.<ol><li>가스 마취제를 사용하는 경우 마취 유도를 위해 가스 유속을 1.0mL/min으로 설정하고 기화기를 2.0%로 설정하며 일반적으로 챔버에서 3-5분이 필요합니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>주사 가능한 마취제를 사용하는 경우 0.2mL의 마취액(80-100mg/kg의 케타민 및 10-12.5mg/kg의 자일라진, 재료 표 참조)을 복강 주사하여 마우스를 마취합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>발가락을 꼬집어 적절한 진정 작용을 위해 동물을 평가하십시오. 각막의 건조를 피하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오. 시술 전에 진통제 (0.03-0.06 mg / kg 부 프레 노르 핀을 피하 투여하십시오).</li>
	<li>완전한 진정이 확인되면 입체 프레임( 재료 표 참조)에 마우스를 놓습니다. 알림: 가스 마취제를 사용하는 경우 마우스의 코를 코 원뿔에 넣어 절차 중에 이소 플루 란 -O2 혼합물을 계속받을 수 있습니다 (1.5 %).</li>
	<li>이전 스테이플을 제거한 다음 탈모 크림이나 면도로 머리카락을 제거하십시오. 클로르헥시딘/베타딘 기반 스크럽과 알코올을 번갈아 가며 피부를 소독하십시오. 그런 다음 멸균 메스를 사용하여 이전 수술 흉터를 따라 1cm 세로 정중선 절개를 만듭니다.</li>
	<li>MIRS 핸드피스를 스테이지 어댑터/핸드피스 홀더를 통해 스테레오택틱 암에 부착하여 안정성과 정밀도를 높입니다.</li>
	<li>다음 설정을 사용하여 MIRS 기계( 재료 표 참조)를 설정합니다(그림 1).<ol><li>후면 패널에 설정된 전원 코드를 전원 코드 콘센트에 삽입합니다. 토글(1 = ON, 0 = OFF)하여 시스템의 전원을 켜거나 끕니다.</li>
		<li>질소 호스의 한쪽 끝(콘솔과 함께 제공됨)을 콘솔 후면 패널의 수 피팅에 삽입합니다. 연결 너트를 시계 방향으로 돌려 연결을 조입니다. 알림: 호스의 반대쪽 끝을 질소 공급 장치에 연결해야 합니다.</li>
		<li>호스를 질소 공급 장치에 연결하기 전에 공급 압력이 콘솔에 권장되는 입력 공급 압력인 100psig를 초과하지 않는지 확인하십시오. 알림: 콘솔은 질소가 콘솔에 공급되면 풋 페달로 활성화될 때 자체 흡인을 생성합니다.</li>
		<li>진공 포트의 뚜껑을 고정하고 밀봉하여 진공 시스템의 누출을 방지하십시오. 흡인 시스템의 누출은 MIRS 콘솔의 성능에 영향을 미칩니다.</li>
		<li>설정 또는 프라이밍 중에 흡인이 17 미만이면 콘솔 전면의 흡인 손잡이가 최대 수준(100)으로 설정되어 있는지 확인하고 흡인 시스템에 누출이 없는지 확인하고 질소 입력 공급 압력이 올바른지 확인하십시오.</li>
		<li>풋 페달을 콘솔에 연결하려면 딸깍 소리가 나고 제자리에 맞을 때까지 회색 풋 페달 커넥터를 회색 콘센트에 삽입합니다. 알림: 풋 페달 커넥터는 한 방향으로 콘솔에 연결되며 홈이 있습니다.</li>
		<li>핸드피스를 콘솔에 연결하려면 파란색 핸드피스 커넥터가 딸깍 소리를 내며 제자리에 맞을 때까지 파란색 콘센트에 삽입합니다. 주: 핸드피스 커넥터는 한 방향으로 콘솔에 연결되며 홈이 있습니다.</li>
		<li>시스템을 사용하기 전에 멸균 유체를 조리개로, 튜브 및 핸드피스를 통해 캐니스터로 흡입하여 각 핸드피스를 프라이밍하여 튜브와 핸드피스 내부가 윤활되어 조직 폐색을 줄이도록 합니다.</li>
		<li>콘솔의 전면 패널에서 적절한 모드를 선택하여 단독 또는 절단으로 포부를 준비하십시오. 풋 페달을 사용하여 시작하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>23G MIRS 캐뉼러를 2.5mm 깊이의 버 구멍에 삽입합니다.</li>
	<li>캐뉼러에 연결된 풋 페달을 밟아 절제 과정을 시작하십시오. 핸드피스의 컨트롤 노브를 사용하여 한 번의 전체 사이클(360°) 이상의 절제를 수행합니다. 참고: 더 많은 사이클을 수행할수록 더 많은 양의 종양 조직이 절제됩니다.</li>
	<li>절제 과정이 완료되면 버 구멍에서 23G MIRS 캐뉼러를 빼내고 5mL의 1x PBS를 사용하여 튜브를 세척하고 잔류 파편을 제거합니다.</li>
	<li>입체 프레임에서 마우스를 제거하고 스테이플러 또는 4-0 봉합 재료로 상처를 닫습니다 ( 재료 표 참조).</li>
	<li>마우스를 케이지로 되돌리기 전에 마취에서 회복하는 동안 가열 패드 또는 따뜻한 빛 아래에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>실험이 완료되면 플러싱 을 통해 캐뉼러를 퍼지합니다. 식힌 배지와 공기를 번갈아 가며 절제된 모든 조직을 수집 용기로 다시 "밀어내십시오". 시스템에서 수집 캐니스터를 제거하고 제공된 캡으로 캡을 닫으십시오.</li>
	<li>2.12 단계를 완료 한 후 캐뉼러의 말단 팁을 3 % H 2 O2에 넣고Hg 24-25에서 흡입을 적용하여 흡입 라인을 흡입 수집 캐니스터에 다시 채우고 60-90 초 동안 그대로 두십시오. 공기와 매체가 간헐적으로 펄싱되는 멸균 매체로 플러시하십시오.</li>
	<li>시술 후 신경학적 징후(비정상적인 불규칙한 움직임 또는 발작)가 있는지 마우스를 모니터링합니다.</li>
	<li>심각한 신경 장애가있는 생쥐를 안락사시킵니다 (무기력 해지거나, 수척해 보이거나, 뒤로 구부러 지거나, 불규칙한 움직임이 있음). 참고: 본 연구에서는 시판되는 안락사 용액 200mg/kg( 재료 표 참조)을 사용하여 각 마우스를 안락사시켰습니다.</li>
</ol>3. TPS를 통한 조직 수집
<ol><li>종양 샘플을 RBC 용해 배지( 재료 표 참조)가 포함된 조직 배양 접시에 실온에서 5분 동안 담그십시오. 참고: MIRS에서 TPS로 수확된 조직은 주로 조직의 작은 덩어리와 함께 단일 세포 형태입니다.</li>
	<li>50mL 원뿔형 튜브에 70μm 필터( 재료 표 참조)를 놓고 5mL 주사기의 플런저를 사용하여 종양 샘플을 필터를 통과시킵니다.</li>
	<li>전사 피펫을 사용하여 RPMI-1640 배지를 사용하여 필터를 통해 세포 및 조직 덩어리를 쉽게 통과시킬 수 있습니다.</li>
	<li>4 °C에서 5분 동안 428 x g 로 원심분리합니다. 피펫으로 상청액을 버립니다.</li>
	<li>준비된 RPMI-1640 배지 5mL에 각 샘플을 재현탁합니다.</li>
	<li>조직 생존력을 높이려면, 특히 큰 조직 덩어리가 첫인상으로 시각화되는 경우 필요한 양의 효소 칵테일(DNAse I, 콜라게나제 IV, 디스파스, 파파인 및 EDTA 함유, 재료 표 참조)을 각 샘플에 추가합니다. 와류를 사용하여 용액을 혼합하십시오. 참고: 3.6단계는 선택 사항입니다. 효소 칵테일의 조성(총 부피 5mL/샘플): DNAse I 등급 II 300μL, 콜라게나제/디스파아제 150μL(피브로넥틴, 콜라게나제 IV, I 및 비극성 아미노산 절단), 파파인(비특이적 프로테아제) 250μL, 0.5M EDTA 6μL.</li>
	<li>샘플을 200 rpm, 37 ° C로 설정된 셰이커 인큐베이터에 20 분 동안 놓습니다.</li>
	<li>20분 후, 샘플을 428 x g 에서 4°C에서 5분 동안 회전시킨다. 상청액을 폐기하십시오.</li>
	<li>70μm 세포 스트레이너를 통해 단일 세포를 여과하고 4°C에서 3분 동안 274 x g 로 스핀다운합니다. Trypan Blue 및 혈구계를 사용하여 세포 생존율 분석10 을 수행합니다( 재료 표 참조). 알림: Day 0 생존율은 30%-70% 범위이며 2-3일 이내에 크게 증가합니다.</li>
	<li>필요한 생존력 테스트에 따라 4, 5 또는 6단계로 진행합니다.</li>
</ol>4. 부착 배양에서 성장하는 세포
<ol><li>인증된 층류 후드에서 펠릿을 혈청 함유 부착 배지(예: DMEM, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 용액)에 재현탁하고 부착 세포 플라스크에 세포를 플레이트합니다.</li>
	<li>세포를 조절된 인큐베이션 환경 (37°C, 5%CO2)에 유지한다.</li>
</ol>5. 현탁 배양에서 성장하는 세포 (신경구)
<ol><li>인증된 층류 후드에서 펠릿을 무혈청 완전 줄기세포 배지11 에 재현탁하고 현탁 플라스크에 플레이트합니다.</li>
	<li>신경권 형성을 허용하기 위해 세포를 2-3일 동안 조절된 배양 환경(37°C, 5%CO2)에 유지한다.</li>
	<li>배양 배지에서 신경구를 시각화 한 후 트립신 -EDTA 또는 Accutase ( 재료 표 참조)를 사용하여 계대 배양을위한 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 참고 : 수확 중에 특별한주의를 기울이고 신경 줄기 세포를지지하는 적절한 배지를 사용하는 한, 수확 된 조직의 줄기 세포는 며칠 내에 신경구를 형성해야합니다.</li>
</ol>6. 재 이식을위한 세포 준비
<ol><li>펠릿을 1x PBS 4μL당 100,000개의 살아있는 세포 농도로 재현탁합니다.</li>
	<li>즉시 두개내 종양 이식법을 이용하여 나이브 마우스에 주사한다(단계 1).</li>
</ol>7. 조직 학적 분석
<ol><li>절제술 직후, 뇌를 추출하여 4% 파라포름알데히드(PFA)로 24시간12분 동안 고정합니다.</li>
	<li>뇌가 자당으로 포화 될 때까지 30 % 자당 용액으로 옮깁니다 (용기 바닥까지 가라 앉음).</li>
	<li>뇌를 70 % 에탄올 용액으로 옮깁니다.</li>
	<li>파라핀 블록 임베딩, 절편 및 표준 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 이전에 공개된 보고서13에 따라 수행한다. 참고: 염색을 위해 취한 각 섹션의 두께는 10μm였습니다.</li>
</ol>

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</ol>

BT는 NIH로부터 연구 자금을 지원받으며 Accelerating Combination Therapies *의 공동 소유자이며 Ashvattha Therapeutics Inc.는 그녀의 특허 중 하나를 라이센스했습니다. GW에는 NIH 자금(R01NS107813)이 있습니다. HB는 Insightec의 유료 컨설턴트이자 회사의 의료 자문위원회 의장입니다. 이 협정은 존스 홉킨스 대학의 이해 상충 정책에 따라 검토 및 승인되었습니다. HB는 NIH, 존스 홉킨스 대학 및 자선 단체로부터 연구 자금을 지원받으며 CraniUS, Candel Therepeutics, Inc., Accelerating Combination Therapies *, Catalio Nexus Fund II, LLC *, LikeMinds, Inc *, Galen Robotics, Inc. * 및 Nurami Medical*의 컨설턴트입니다. (*주식 또는 옵션 포함).

종양 절제술은 저등급 및 고급 뇌종양 모두에 대한 신경외과 종양 치료 계획의 초석입니다. 종양의 세포 감소 및 용적 축소는 뇌종양 환자의 신경 기능 개선 및 전체 생존과 상관관계가 있습니다 1,2,5,6. 외과적 절제를 위한 프로토콜이 이전에 설치류 모델에서 기술되었지만, 이러한 프로토콜은 생성된 결과와 전임상 모델의 전반적인 번역 가능성을 혼란스럽게 할 수 있는 몇 가지 제한 사항을 겪었습니다. 예를 들어, 이전에 보고된 외과적 절제 프로토콜에는 뼈 피판을 만들기 위해 3-4개의 작은 버 구멍이 있는 개두술이 포함되었으며, 그런 다음 정상뇌 조직과 비교하여 종양의 착색 및 일관성을 능숙하게 구별하고 구별하는 것이 포함되었습니다6. 이러한 프로토콜은 시간이 많...

교모세포종(GBM)은 성인에서 가장 흔하고 공격적인 원발성 뇌종양입니다. 최근 신경외과, 표적 약물 개발 및 방사선 요법의 발전에도 불구하고 GBM 환자의 5년 생존율은 5% 미만으로 30년 이상 크게 개선되지 않은 통계입니다1. 따라서보다 효과적인 치료 전략이 필요합니다.
새로운 치료법을 개발하기 위해 연구 프로토콜은 (1) 종양 이질성과 미세 환경을 정확하게 요약하는 번역 가능한 전임상 모델을 활용하고, (2) 현재 수술, 방사선 요법 및 화학 요법을 포함하는 GBM 환자에게 사용되는 표준 치료 요법을 반영하고, (3) 절제 된 코어와 잔여 코어의 차이를 설명해야한다는 것이 점점 더 분명 해지고 있습니다. 침윤성 종양 조직 2,3,4,5. 그러나 현재 이용 가능한 대부분의 전임상 뇌종양 모델은 외과적 절제를 시행하지 않거나 상대적으로 시간이 많이 소요되는 외과적 절제모델을 활용하여 상당한 양의 출혈을 초래하거나 표준화가 부족합니다. 또한, 설치류 뇌종양의 절제를 수행하는 것은 임상적으로 비교 가능한 수술 도구 또는 프로토콜이 부족하고 체계적인 조직 수집을 위한 확립된 플랫폼6의 부재로 인해 어려울 수 있습니다(표 1).
본 프로토콜은 다기능 비절제 최소 침습 절제 시스템(MIRS) 및 통합 조직 보존 시스템(TPS)을 사용하여 설치류 뇌종양 절제 및 조직 보존을 위한 표준화된 패러다임을 설명하는 것을 목표로 합니다(그림 1). 이 독특한 기술은 GBM 및 기타 유형의 뇌종양 모델에 대한 전임상 연구의 다양한 연구에 활용할 수있는 표준화 된 플랫폼을 제공 할 것으로 기대됩니다. 뇌종양에 대한 치료 또는 진단 양식을 조사하는 연구원은 이 프로토콜을 구현하여 연구에서 표준화된 절제를 달성할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1 mL 주사기</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 코니컬 튜브</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>200 proof 에탄올</td><td>PharmCo</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 피펫</td><td>CoStar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>70 미크론 필터</td><td>Fisher</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore Sigma</td><td>SIG-SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Anased (자일라진 주사, 100 mg/mL)</td><td>Covetrus</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>마취 시스템</td><td>Patterson Scientific</td><td>78935903</td><td></td></tr><tr><td>마취 가스 폐기물 용기</td><td>Patterson Scientific</td><td>78909457</td><td></td></tr><tr><td>벤치 프로텍터 언더패드</td><td>Covidien</td><td>10328</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6, 6-8주 된 마우스</td><td>Charles River Laboratories</td><td>스트레인 코드 027</td><td></td></tr><tr><td>ChroMini Pro</td><td>Moser</td><td>Type 1591-Q</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase-Dispase</td><td>Roche</td><td>#10269638001</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 자동 세포 계수기</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 혈구계</td><td>Thermo Fisher</td><td>A25750</td><td></td></tr><tr><td>잔해 제거 솔루션</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>#130-109-398</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12 매체</td><td>Corning</td><td>10-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 매체</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Posi-Click</td><td>1149K01</td><td></td></tr><tr><td>안락사 솔루션</td><td>Henry Schein</td><td>71073</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Millipore Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Thermo Fisher</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Invitrogen</td><td>INV-28906</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Henry Schein</td><td>101-4336</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>PeproTech EC</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H-3149</td><td></td></tr><tr><td>hFGF-b</td><td>PeproTech EC</td><td>1001-18B</td><td></td></tr><tr><td>인덕션 챔버</td><td>Patterson Scientific</td><td>78933388</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Covetrus</td><td>11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 기화기</td><td>Patterson Scientific</td><td>78916954</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Covetrus</td><td>11695-0703-1</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Stereotactic frame</td><td>Kopf Instruments</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>Lightfield Microscope</td><td>BioTek</td><td>Cytation 5</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection Unit</td><td>Kopf</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>Micromotor drill</td><td>Foredom</td><td>F210418</td><td></td></tr><tr><td>MRI 시스템</td><td>Bruker</td><td>7T Biospec Avance III MRI 스캐너</td><td></td></tr><tr><td>NICO Myriad System</td><td>NICO Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>안과 연고</td><td>Puralube 수의사 연고</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#P4762</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>#14190250</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Millipore Sigma</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>Percoll 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp;#P4937</td><td></td></tr><tr><td>피펫 컨트롤러</td><td>Falcon</td><td>A07260</td><td></td></tr><tr><td>포비돈-요오드 용액</td><td>Aplicare</td><td>52380-1905-08</td><td></td></tr><tr><td>프로게스테론</td><td>시그마</td><td>P-8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>시그마</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 미디어</td><td>인비트로젠</td><td>INV-72400120</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td>Covetrus</td><td>7319</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들</td><td>Fine Science Tools</td><td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td>스킨 마커</td><td>시간 초과</td><td>D538,851</td><td></td></tr><tr><td>스테이플 제거제</td><td>MikRon</td><td>ACR9MM</td><td></td></tr><tr><td>스테이플러</td><td>MikRon</td><td>ACA9MM</td><td></td></tr><tr><td>스테이플 클레</td><td>이 Adams</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>정위 프레임</td><td>Kopf Instruments</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>봉합사, vicryl 4-0</td><td>Ethicon</td><td>J494H</td><td></td></tr><tr><td>T-75 배양 플라스크</td><td>Sarstedt</td><td>83-3911-002</td><td></td></tr><tr><td>TheraPEAKTM ACK 용해 버퍼 (1x)</td><td>Lonza</td><td>BP10-548E</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>코닝</td><td>MDT-25-053-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

높은 생존력 조직 수집을 위한 설치류의 최소 침습 뇌종양 절제술 시행

Implementation of Minimally Invasive Brain Tumor Resection in Rodents for High Viability Tissue Collection

본 프로토콜은 설치류 뇌종양 절제술 및 조직 보존을 위한 표준화된 패러다임을 기술한다. 임상 실습에서 최대 종양 절제술은 대부분의 뇌종양에 대한 표준 치료 치료법입니다. 그러나 현재 이용 가능한 대부분의 전임상 뇌종양 모델은 절제를 포함하지 않거나 시간이 많이 걸리고 상당한 수술 후 이환율, 사망률 또는 실험적 변동성을 유발하는 외과적 절제 모델을 활용합니다. 또한 설치류에서 절제를 수행하는 것은 임상적으로 비교할 수 있는 수술 도구 또는 프로토콜의 부족과 표준화된 조직 수집을 위한 확립된 플랫폼의 부재를 포함하여 여러 가지 이유로 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜은 다기능, 비 절제 장치 및 장치의 임상 버전에서 채택 된 통합 조직 보존 시스템의 사용을 강조합니다. 본 연구에 적용된 장치는 조정 가능한 흡입과 조리개에 원통형 블레이드를 결합하여 조직을 정밀하게 조사, 절단 및 흡입합니다. 최소 침습 절제 장치는 초기 종양 이식에 사용 된 것과 동일한 버 구멍을 통해 기능을 수행합니다. 이 접근법은 생검 또는 절제 수술 중 국소 해부학의 변경을 최소화하고 심각한 혈액 손실 위험을 줄입니다. 이러한 요인들은 수술 시간(<2분/동물)을 크게 단축하고, 수술 후 동물 생존을 개선하고, 실험 그룹의 변동성을 낮추고, 향후 분석을 위해 절제된 조직과 세포의 높은 생존력을 초래합니다. 이 과정은 ~ 1,400 사이클 / 분의 블레이드 속도로 촉진되며, 이는 선택한 생리 학적 용액으로 채워질 수있는 멸균 폐쇄 시스템으로 조직을 수확 할 수있게합니다. 수술의 영향, 지역화된 종양 절제술 표본의 보존 및 엄격한 비교 분석, 공동 내 전달 치료제를 연구하고 정확하게 모델링하는 것의 중요성이 커짐에 따라 이 독특한 프로토콜은 뇌종양 환자를 위한 수술 전후 관리 및 치료 발견에 대한 답이 없는 질문을 탐구할 기회를 확대할 것입니다.

MIRS를 이용한 외과적 절제술은 종양 부담의 현저한 감소를 초래한다. 종양 부담이 더 작은 그룹에서 평균 기준선 생체 발광 신호는 절제술을받은 하위 그룹에서 5.5e + 006 광자 / s ± 0.2e + 006이었습니다. 절제술 후 평균 생체 발광 신호는 0.3e + 006 ± 3.09e + 006 광자 / s로 감소했습니다 (p &lt;0.0001, Mann-Whitney 테스트) 9 (그림 2)). 생체발광 신호는 마우스를 안락사시킬 때까지 다음 며칠 동안 증가하였다. 유사하게, 종양 부담이 더 큰 그룹에서 평균 기준선 생체 발광 신호는 절제술을받은 하위 그룹에서 1.68e + 007 광자 / s ± 0.1e + 007이었습니다. 절제술 후, 평균 생체발광 신호는 0.2e+006± 5.19e+006 광자/초로 감소하였다(p &lt...

본 프로토콜은 통합 조직 보존 시스템을 갖춘 최소 침습적 접근법을 통해 설치류에서 뇌종양의 표준화 된 절제술을 설명합니다. 이 기술은 설치류 및 기타 동물 모델의 치료 표준을 정확하게 반영하는 데 의미가 있습니다.

The present protocol describes a standardized paradigm for rodent brain tumor resection and tissue preservation. In clinical practice, maximal tumor ...

이것은 뇌종양 치료제에 대한 전임상 연구에서 매우 필요한 뇌종양 절제술 패러다임입니다. 최소 침습적 접근 방식을 통해 표준화된 절제가 가능하며 동시에 자동화된 조직 보존 시스템과도 결합됩니다. 이 프로토콜은 동물이 수술 후 생존 할 수있게하여 동일한 동물에서 치료 후 질병 상태의 변화를 이해하는 데 도움이됩니다.이것은 순차적 및 시간 경과 치료 응용 프로그램에 도움이 됩니다. 이 기술을 사용하여 질병의 생물학을 평가하고 가능한 후속 관리를 계획 할 수 있습니다. 이는 약물 발견 및 새로운 치료법에 중요한 의미와 기회를 가지고 있습니다.표준화 된 절제술, 최소 침습적 접근법 및 자동화 된 조직 보존의 개념은 간 종양 및 두 경부암과 같은 다른 장기 시스템의 다른 유형의 종양으로 확장 될 수 있습니다. 프로토콜은 간단하고 시스템은 사용자 친화적입니다. 필요한 모든 단계와 문제 해결이 포함 된 게시 된 프로토콜을 읽는 것이 가장 좋습니다.발가락을 꼬집어 진정 작용에 대해 마우스를 평가하여 실험을 시작하십시오. 각막의 건조를 피하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오. 그런 다음 마우스를 입체 프레임에 놓습니다.이전 수술에서 스테이플을 제거하고 클로르헥시딘 또는 베타인 기반 스크럽과 알코올을 번갈아 가며 피부를 소독합니다. 그런 다음 멸균 메스를 사용하여 이전 수술 흉터를 따라 1cm 세로 정중선 절개를 만듭니다. MIRS 핸드피스를 스테이지 어댑터를 통해 스테레오택틱 암에 부착합니다.MIRS 기기를 설정하려면 후면 패널에 설정된 전원 코드를 전원 코드 콘센트에 삽입합니다. 0과 1 사이를 전환하여 시스템 전원을 켜거나 끕니다. 질소 호스의 한쪽 끝을 콘솔 후면 패널의 수 피팅에 삽입합니다.연결 너트를 시계 방향으로 돌려 조입니다. 공급 압력이 100 PSIG를 초과하지 않는지 확인하고 호스를 질소 공급 장치에 연결하십시오. 누출을 방지하기 위해 진공 포트의 뚜껑을 밀봉하십시오.콘솔 전면의 흡인 손잡이가 100으로 설정되어 있는지, 흡인 시스템에 누출이 없는지, 질소 입력 공급 압력이 올바른지 확인하십시오. 딸깍 소리가 날 때까지 회색 풋 페달 커넥터를 회색 콘센트에 삽입합니다. 같은 방법으로 파란색 핸드피스 커넥터를 파란색 콘센트에 삽입합니다.멸균 유체를 튜브와 핸드피스를 통해 조리개로 흡입한 다음 캐니스터로 흡입하여 각 핸드피스를 프라이밍하여 튜브와 핸드피스 내부가 윤활되도록 합니다. 콘솔 전면 패널에서 흡인 모드를 선택하고 풋 페달을 사용하여 시작합니다. 23-G MIRS 캐뉼러를 버 구멍에 2.5mm 깊이까지 삽입합니다.캐뉼러에 연결된 풋 페달을 눌러 절제 과정을 시작하십시오. 핸드피스의 컨트롤 노브를 사용하여 전체 절제술을 수행합니다. 절제 과정 후 23게이지 MIRS 캐뉼러를 빼내고 1X PBS 5밀리리터를 추가하여 튜브를 세척하고 잔류 파편을 제거합니다.그런 다음 스테이플러로 상처를 닫고 입체 프레임에서 마우스를 제거하십시오. 마우스를 케이지에 다시 넣기 전에 마취에서 회복하기 위해 가열 패드로 되돌립니다. 실험 후 식힌 배지와 공기로 캐뉼라를 퍼지하여 절제된 모든 조직을 수집 용기로 다시 밀어냅니다.시스템에서 수집 캐니스터를 제거하고 캡을 놓으십시오. 다음으로 캐뉼라의 말단 팁을 3% 과산화수소에 넣고 흡입을 적용하여 흡입 라인을 흡입 수집 캐니스터에 다시 채웁니다. 60-90초 동안 그대로 두고 간헐적으로 공기와 매체를 펄스하여 플러시합니다.종양 샘플을 RBC 용해 배지를 함유하는 조직 배양 접시에 실온에서 5분 동안 침지시킨다. 그런 다음 70 밀리리터 원추형 튜브에 50 미크론 필터를 놓고 주사기 플런저를 사용하여 종양 샘플을 필터를 통과시킵니다. 전사 피펫을 사용하여 RPMI 1640 배지를 사용하여 세포와 조직 덩어리를 필터를 통과시킵니다.섭씨 4도에서 5 분 동안 G 428 배로 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 준비된 RPMI 1640 배지 5ml에 각 샘플을 재현탁합니다. 샘플을 셰이커 인큐베이터에 섭씨 37도에서 200RPM으로 20분 동안 넣습니다.배양 후, 샘플을 섭씨 4도에서 5분 동안 428배 G로 원심분리하고 상청액을 버린다. 70미크론 세포 여과기를 통해 단일 세포를 여과하고 섭씨 4도에서 3분 동안 274배 G로 원심분리합니다. 트리판 블루와 혈구계로 세포 생존율 분석을 수행합니다.MIRS를 사용하는 마우스에서의 외과적 절제는 크고 작은 종양 부담 둘 다를 갖는 그룹에 대한 평균 기준선 생체발광 신호의 감소에 의해 나타난 바와 같이 종양 부담의 유의한 감소를 야기하였다. 종양의 절제전 MRI 이미지와 비교하여 절제술 구멍은 절제 후 스캔에서 종양 접종 부위의 크고 둥근 저강도 영역으로 식별할 수 있습니다. H & E 염색 된 절편에서, 혈액 제제, 염증 및 잔류 종양 세포의 테두리가있는 명확한 원형 절제 공동이 관찰되었다.절단 개구를 두 번 회전했을 때 절제량이 크게 증가하여 종양 부담에 따라 절제량을 최적화할 수 있었습니다. 미처리 종양이 있는 마우스와 MIRS에 의한 종양 절제술을 받은 마우스에서의 생존율의 비교는 작은 종양 그룹에서 16일에서 22일째까지 생존율의 증가를 보여주었다. 유사하게, 종양 부담이 큰 그룹에서 생존 중앙값은 12일에서 19일로 증가했습니다.조직 보존 시스템에서 채취한 샘플의 광학 현미경 이미지는 0일째에 몇 개의 작은 조직 덩어리가 존재하는 단일 세포로 나타났습니다. 7일 후, MIRS로 수확된 세포는 현탁 배양에서 신경권 형성을 나타냈고, 이는 그들의 종양 개시 가능성을 나타냈다. 시스템이 막히지 않도록 절차 직후 튜브 시스템을 퍼지하고 세척하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 최소 침습 절제 시스템으로 외과적 절제 후 생존 동물에게 치료제의 효능 연구와 진단 및 예후 마커에 대한 연구를 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 종양 괴사 인자 관련 세포자멸사 유도 리간드 또는 TRAIL을 발현하는 유전자 조작 중간엽 줄기 세포 또는 MSC가 파종된 바이오 골격의 이미지 유도 종양 절제 및 이식을 위한 수술 절차를 보여줍니다. 이러한 치료용 MSC는 뇌종양 치료에 잠재력이 있습니다.

쥐 모델에서 형광 유도 종양 절제 및 MSC 시드 골격 이식: 마우스 모델에서 뇌 종양 절제강에 치료용 중간엽 줄기세포를 전달하는 수술 절차

이 비디오는 면역 치료제의 투여를 용이하게 하기 위해 뇌종양 마우스 모델에서 두개내 캐뉼라 이식 절차를 제시합니다. 종양 미세환경에서 글리피칸-2 특이적 키메라 항원 수용체 T 세포의 전달은 T 세포 활성화를 유발하여 종양 용해 및 종양 퇴행을 초래합니다.

뇌종양에 치료제를 전달하기 위해 마우스에 두개내 캐뉼라 이식

출처: Alomari, S., et al. 생존율이 높은 조직 수집을 위한 설치류에서 최소 침습 뇌종양 절제술의 구현. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 최소 침습 절제 시스템(MIRS)을 사용하여 종양을 이식한 마취된 마우스에서 종양 조직을 절제하는 방법을 보여줍니다. 이 절차에는 마우스를 정위 프레임에 고정하고, 뇌에 접근하기 위해 이전 수술 부위를 다시 열고, 흡입과 회전 블레이드를 활용하여 종양 절편을 제거하는 특수 캐뉼라를 삽입하는 작업이 포함됩니다. 절제 후 절제된 조직을 멸균 튜브를 통해 채취하고 상처를 봉합하여 회복할 수 있도록 합니다.

최소 침습 절제 시스템을 사용한 마우스의 뇌종양 절제

우리는 종양의 성장하는 동안 재생에 일반적으로 생물 물리학 적 제약 조건을 되풀이되었습니다의 intravital 두 광자 현미경을위한 마우스에서 대뇌 피질의 소성을 glioblastoma의 모델을 설립했다. 종양 위의 두개골을 대체 만성 유리 창에는 두 개의 광자 현미경에 의해 시간이 지남에 따라 종양의 진행을 추적 할 수 있습니다.

소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

뇌는 잘 시험관이나 자궁외 분석으로 표시되지 않은 자질을 가진 유일한 사이트입니다. 위치 재현성과 성장 특성 정위 마우스 모델을 확실 정위 고정기구 및 저압 주사기 펌프를 사용하여 두개 내 주사로 생성 될 수있다.

만들기 해부학 적으로 정확하고 인간의 두뇌 종양의 재현 두개 내 이종 이식

종양을 추구 치료 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 침략 세포종에 대 한 치료로 서 약속을 보여줍니다. 최적의 이식 건설 기계에 종양 절제술 구멍으로 MSCs의 납품을 포함 한다. 여기, MSC 세포종의 치료를 공부 하기 전 임상 기술을 포함 하 여 제공 됩니다: 이미지 기반 종양 절제술; 주입 장비의 MSC 시드; 그리고 수술 후 치료 추적입니다.

세포종과 치료 줄기 세포 시드 장비의 Intracranial 주입의 이미지 기반 절제

여기에서 우리는 동일한 살아있는 동물 내의 침습적 외과 적 개입 (예를 들어, 생검) 전후 뇌 종양 세포의 고해상도 시간 경과 다광자 이미징을위한 방법을 설명합니다. 이 방법은 종양 세포의 철새, 침략적 인 행동에 대한 이러한 침습적 인 외과 적 절차의 영향을 단일 세포 수준에서 연구 할 수 있습니다.

침략적인 외과 생검에 응하여 뇌종양 세포 행동의 경도 내 활력 화상 진찰

레이저 미세 해부 (LMD)는 신경교종 이질성과 침략을 중재하는 통로를 밝히기 위하여 이용될 수 있는 민감하고 높게 재현가능한 기술입니다. 여기에서, 우리는 전사성 분석에 선행된 레이저 LMD를 사용하여 신경교종 조직에서 이산 지역을 격리하기 위하여 최적화된 프로토콜을 기술합니다.

종양 내 이질성, 온코스트림 및 침략의 공간 및 분자 특성화를 위한 신경교종 소구역의 레이저 캡처 미세 분해

여기에서 우리는 유전자 조작 마우스 모델 종양에서 파생된 세포의 두개내 주입에 의해 확립된 GBM에 대한 전임상 동소 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 인간 GBM의 질병 특징을 표시합니다. 중개 연구를 위해 마우스 뇌종양은 생체 내 MRI 및 조직병리학에 의해 추적됩니다.

다형성 교모세포종의 번역 동소 모델

우리는 마우스 모델에서 형광 표지된 산화철 나노입자를 교모세포종에 전달하는 종양 전달에 대한 이광자 현미경에 대한 새로운 접근 방식을 제시합니다.

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정형소 소아 뇌종양 모델의 개발에는 암세포를 정밀하게 이식하기 위해 입체 장치를 사용하는 세심한 정밀도가 필요합니다. 여기에 제시된 방법론은 뇌종양 세포를 준비하고, 두개내 주사를 수행하고, 뇌종양 생착을 평가하기 위한 수술 후 모니터링 시스템을 구현하는 것과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

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학습하세요 설치류 뇌종양 최소 침습 절제술을 통해 동물 생존과 조직 보존을 동시에 달성하는 방법을. 이 기술은 전임상 연구에서 질병 진행과 치료 효과를 종단적으로 분석하는 데 필수적입니다.

높은 생존력 조직 수집을 위한 설치류의 최소 침습 뇌종양 절제술 시행

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