Name: 일차 붉은털 원숭이 B 세포의 유전자 편집 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 학습하세요 CRISPR/Cas9와 rAAV6를 이용한 일차 붉은털 원숭이 B 세포 유전자 편집 방법입니다. 이 기술은 B 세포 치료제 연구와 전임상 개발에 필수적인 도구를 제공합니다.

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RC1 항원을 제공한 Harry B. Gristick과 Pamela Bjorkman과 비판적인 토론을 위해 전체 Nussenzweig 및 Martin 실험실에 감사드립니다. 이 연구는 빌 앤 멜린다 게이츠 재단 보조금 INV-002777 (MCN에) 및 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (National Institute of Allergy and Infectious Diseases)의 교내 연구 프로그램 (Intramural Research Program)의 지원을 받았다. (R.G. 및 M.A.M). MCN은 HHMI 조사관입니다.

<ol><li>Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Germinal centers.</a> Annual Review of Immunology. 40, 413-442 (2022).</li>
<li>Plotkin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+protection+induced+by+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Correlates of protection induced by vaccination.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 17 (7), 1055-1065 (2010).</li>
<li>Brinkmann, V., Heusser, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dependent+differentiation+of+human+B+cells+into+IgM%2C+IgG%2C+IgA%2C+or+IgE+plasma+cells%3A+High+rate+of+antibody+production+by+IgE+plasma+cells%2C+but+limited+clonal+expansion+of+IgE+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell-dependent differentiation of human B cells into IgM, IgG, IgA, or IgE plasma cells: High rate of antibody production by IgE plasma cells, but limited clonal expansion of IgE precursors.</a> Cellular Immunology. 152 (2), 323-332 (1993).</li>
<li>Chernecky, C. C., Berger, B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChernecky%2C+CC+%22Protein+Electrophoresis+-+Serum.%2C+6th+edition%22">Protein Electrophoresis - Serum., 6th edition</a>. , Elsevier Saunders. St Louis, MO. 917-920 (2013).</li>
<li>Balazs, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+protection+against+HIV+infection+by+vectored+immunoprophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibody-based protection against HIV infection by vectored immunoprophylaxis.</a> Nature. 481 (7379), 81-84 (2011).</li>
<li>Greiner, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+editing+of+the+B+cell+receptor+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated editing of the B cell receptor in primary human B cells.</a> iScience. 12, 369-378 (2019).</li>
<li>Hartweger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+humoral+immune+responses+by+CRISPR%2FCas9-edited+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV-specific humoral immune responses by CRISPR/Cas9-edited B cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1301-1310 (2019).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+elicitation+of+HIV+broadly+neutralizing+antibodies+from+engineered+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Vaccine elicitation of HIV broadly neutralizing antibodies from engineered B cells.</a> Nature Communications. 11, 5850(2020).</li>
<li>Jeske, A. M., Boucher, P., Curiel, D. T., Voss, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+strategies+to+actualize+B+cell-based+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Vector strategies to actualize B cell-based gene therapies.</a> Journal of Immunology. 207 (3), 755-764 (2021).</li>
<li>Nahmad, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+engineered+B+cells+secrete+high+titers+of+broadly+neutralizing+anti-HIV+antibodies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1241-1249 (2022).</li>
<li>Nahmad, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+B+cells+expressing+an+anti-HIV+antibody+enable+memory+retention%2C+isotype+switching+and+clonal+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineered B cells expressing an anti-HIV antibody enable memory retention, isotype switching and clonal expansion.</a> Nature Communications. 11, 5851(2020).</li>
<li>Voss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+antigen+specificity+of+B+cells+using+genome-editing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the antigen specificity of B cells using genome-editing technologies.</a> eLife. 8, 42995(2019).</li>
<li>Pesch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+design%2C+optimization%2C+and+genomic+integration+of+chimeric+B+cell+receptors+in+murine+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular design, optimization, and genomic integration of chimeric B cell receptors in murine B cells.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2630(2019).</li>
<li>Cheong, T. C., Compagno, M., Chiarle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+of+mouse+and+human+immunoglobulin+genes+by+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Editing of mouse and human immunoglobulin genes by CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 7, 10934(2016).</li>
<li>Rogers, G. L., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+edited+B+cells%3A+A+new+frontier+in+immune+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Genome edited B cells: A new frontier in immune cell therapies.</a> Molecular Therapy. 29 (11), 3192-3204 (2021).</li>
<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li>
<li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR%2FCas9+targeted+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Scientific Reports. 8, 12144(2018).</li>
<li>Wu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+in+primary+human+B+cells+with+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering in primary human B cells with CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 33-40 (2018).</li>
<li>Luo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+alpha-PD-1+antibody-expressing+long-lived+plasma+cells+by+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+gene+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Engineering of alpha-PD-1 antibody-expressing long-lived plasma cells by CRISPR/Cas9-mediated targeted gene integration.</a> Cell Death and Disease. 11 (11), 973(2020).</li>
<li>Laoharawee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+of+primary+human+B+cells+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome engineering of primary human B cells using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61855(2020).</li>
<li>Laoharawee, K., Johnson, M. J., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering+of+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome engineering of primary human B cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2115, 435-444 (2020).</li>
<li>Moffett, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+engineered+to+express+pathogen-specific+antibodies+protect+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells engineered to express pathogen-specific antibodies protect against infection.</a> Science Immunology. 4 (35), (2019).</li>
<li>Hartweger, H., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+comes+a-knock-in+to+reprogram+antibodies+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR comes a-knock-in to reprogram antibodies in vivo.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1183-1184 (2022).</li>
<li>Nishimura, Y., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice%2C+macaques%2C+and+men%3A+Broadly+neutralizing+antibody+immunotherapy+for+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Of mice, macaques, and men: Broadly neutralizing antibody immunotherapy for HIV-1.</a> Cell Host & Microbe. 22 (2), 207-216 (2017).</li>
<li>Shedlock, D. J., Silvestri, G., Weiner, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monkeying+around+with+HIV+vaccines%3A+Using+rhesus+macaques+to+define+%27gatekeepers%27+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monkeying around with HIV vaccines: Using rhesus macaques to define 'gatekeepers' for clinical trials.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (10), 717-728 (2009).</li>
<li>Kreuser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+methods+for+generation+and+expansion+of%2C+and+gene+delivery+to+rhesus+macaque+plasma+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient methods for generation and expansion of, and gene delivery to rhesus macaque plasma B cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Gujer, C., Sundling, C., Seder, R. A., Karlsson Hedestam, G. B., Lore, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+rhesus+plasmacytoid+dendritic+cell+and+B-cell+responses+to+Toll-like+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human and rhesus plasmacytoid dendritic cell and B-cell responses to Toll-like receptor stimulation.</a> Immunology. 134 (3), 257-269 (2011).</li>
<li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+enrichment-free+massive+ex-vivo+expansion+of+peripheral+CD20%28%2B%29+B+cells+via+CD40-CD40L+signals+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell enrichment-free massive ex-vivo expansion of peripheral CD20(+) B cells via CD40-CD40L signals in non-human primates.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 473 (1), 92-98 (2016).</li>
<li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-attenuating+adenovirus+enables+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+for+high+manufacturing+yield+without+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-attenuating adenovirus enables production of recombinant adeno-associated virus for high manufacturing yield without contamination.</a> Nature Communications. 13, 1182(2022).</li>
<li>Endo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-+and+long-term+clinical+outcomes+in+rhesus+monkeys+inoculated+with+a+highly+pathogenic+chimeric+simian%2Fhuman+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Short- and long-term clinical outcomes in rhesus monkeys inoculated with a highly pathogenic chimeric simian/human immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 74 (15), 6935-6945 (2000).</li>
<li>Balaphas, A., Buchs, N. C., Meyer, J., Hagen, M. E., Morel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+splenectomy+in+the+era+of+minimally+invasive+surgery%3A+The+current+laparoscopic+and+robotic+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Endoscopy%22%5BJournal%5D)">Partial splenectomy in the era of minimally invasive surgery: The current laparoscopic and robotic experiences.</a> Surgical Endoscopy. 29 (12), 3618-3627 (2015).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Labun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v3%3A+Expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li>
<li>Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+cesium+chloride-+and+iodixanol-based+purification+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+for+preclinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simplified+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus.</a> Journal of Virological Methods. 183 (2), 139-146 (2012).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> The CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12, 686(2021).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+neutralizing+macaque+monoclonal+antibody+against+the+HIV-1+V3-Glycan+patch%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A broadly neutralizing macaque monoclonal antibody against the HIV-1 V3-Glycan patch.</a> eLife. 9, 61991(2020).</li>
<li>Escolano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+expands+B+cells+specific+to+HIV-1+V3+glycan+in+mice+and+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunization expands B cells specific to HIV-1 V3 glycan in mice and macaques.</a> Nature. 570 (7762), 468-473 (2019).</li>
<li>Pathiraja, V., Matar, A. J., Gusha, A., Huang, C. A., Duran-Struuck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukapheresis+protocol+for+nonhuman+primates+weighing+less+than+10+kg%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Leukapheresis protocol for nonhuman primates weighing less than 10 kg.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 70-77 (2013).</li>
<li>Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO+increases+efficiency+of+genome+editing+at+two+non-coding+loci%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci.</a> PLoS One. 13 (6), 0198637(2018).</li>
</ol>

경쟁 이익은 선언되지 않습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 HDRT로서 rAAV6의 높은 수율과 역가를 생성하는 빠르고 효율적인 방법과 시험관 내에서 1차 붉은털 원숭이 B 세포를 효율적으로 유전자 편집하는 새로운 방법을 제공합니다.
rAAV6 생산 프로토콜은 비교적 간단하고 빠르기 때문에 과도한 노동없이 다양한 구조물을 동시에 생산하고 테스트 할 수 있습니다. 원한다면, rAAV6은 완충액 교환 및 농축 전에 요오드옥사놀 구배 초원심분리(34 ) 또는 수성 2상 분할(35 )과 같은 확립된 프로토콜을 사용하여 추가로 정제할 수 있다.
전체 수율이 감소했지만, 대부분의 rAAV6가 배지36으로 방출되고 세포 펠릿에서 정제하는 데 더 많은 비용과 노동력이 추가되기 때문에 세포 펠릿에서 정제하는 대신 rAAV6 정제를 위해 혈청 환원 세포 배양 배지만 사용하기로 결정했습니다. 자가 비활성화 아데노바이러스 헬퍼를 사용하면 평균 수율이 30-40배 증가하여 단일 15cm 접시에 AAV6으로 포장된 구조물을 테스트할 수 있습니다. 우리의 정제 방법은 기본적이지만 이 방법을 사용하면 다양한 세포주 또는 기타 1차 세포를 사용하여 형질도입 후 유전자 편집 효율 또는 세포 생존율에서 배치 간 변동이 상대적으로 적습니다(데이터는 표시되지 않음).
우리는 바람직하지 않은 집단의 음성 고갈을 사용하여 손대지 않은 1차 B 세포를 얻기 위해 붉은털 원숭이 B 세포 정제 프로토콜을 개발했습니다. 이들 세포를 유전자 편집하는 데 필요한 것은 아니지만, 다른 세포 유형이 실험 목표를 방해하는 경우 이 응용 분야 또는 다른 적용을 위해 1차 붉은털 원숭이 B 세포의 비교적 순수한 집단을 얻을 수 있는 방법을 제공합니다. 그러나 순도는 전체 B 세포 수율을 감소시키는 대가를 치르게 됩니다. 특히, 농축 및 비농축 B 세포 배양 모두에서 초기 PBMC 또는 비장세포 제제에서 B 세포의 분획이 중요합니다. 특히 PBMC의 경우, 이 값은 개인마다 크게 다를 수 있으므로 실험을 위해 많은 수의 B 세포를 얻기 위해 말초 혈액에서 B 세포 비율이 높은 개인에 대해 다른 원숭이를 선별하는 것이 좋습니다27. PBMC는 규칙적인 출혈 또는 백혈구 성분채집술에 의해 얻어질 수 있다42.
유전자 편집 프로토콜은 일반적으로 녹아웃의 60%-80%와 녹인 B 세포의 5%-20% 사이에서 효율적인 유전자 편집으로 이어지지만, 최대 90%의 BCR 녹아웃 및 40%의 BCR 녹인 B 세포를 달성했습니다(그림 5 및 그림 6).
붉은털원숭이 B 세포의 효율적인 편집을 위한 주요 파라미터는 sgRNA의 절단 효율, 전기천공 파라미터, MOI 및 rAAV6 제제의 품질입니다. 후보 sgRNA의 절단 효율은 HDRT의 최적 편집 및 설계를 허용하기 위해 경험적으로 결정되어야 합니다. 여기에 제시된 전기천공 파라미터는 효율성과 생존 가능성의 균형을 유지하여 편집된 B 세포의 가장 높은 비율이 아닌 편집된 B 세포의 최대 총 수를 얻습니다. 더 높은 비율의 편집된 셀이 필요한 경우 더 많은 세포 사멸이 관찰될 수 있지만 증가된 전압(최대 1,750V) 또는 변경된 펄스 길이(10-30ms)가 권장됩니다. 우리는 또한 동일한 개인의 PBMC의 B 세포에 비해 비장 B 세포에서 약간 더 높은 편집 효율을 발견했습니다(그림 5). 그러나 이에 대한 근본적인 이유는 현재 알려져 있지 않습니다.
우리는 전기천공 후 1% DMSO를 첨가하면다른 세포의 보고와 일치하여 세포 생존율에 영향을 미치지 않으면서 붉은털 원숭이 B 세포에서 유전자 편집 효율이 ~40%까지 유의하게 증가한다는 것을 발견했습니다(그림 6A-C). 그러나 1% DMSO에서 장기간 배양하는 것은 피해야 하며 세포 생존력에 영향을 미칠 수 있습니다. 원하는 경우 DMSO를 완전히 생략할 수 있습니다.
rAAV6와 함께 몇 시간 동안 전기천공한 후 소량의 세포 배양은 아마도 rAAV6에 의한 HDRT의 더 나은 형질도입으로 인해 더 높은 편집 효율을 가져오고, 따라서 Cas9이 활성화되는 해당 시간에 HDRT의 세포 내 농도가 더 높기 때문일 것입니다. 이러한 방식으로 최대 8시간 동안 세포를 배양해도 세포 생존율에 영향을 미치지 않았지만 편집 효율은 5시간 이상 크게 증가하지 않았습니다(그림 6). knock-in 대신 knock-out만 필요한 경우 이 단계를 생략할 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 시험관 내에서 붉은털 원숭이 B 세포의 유전자 편집 및 원하는 구성물의 효율적인 knock-in에 필요한 rAAV6 HDRT의 생산을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜을 통해 rAAV6로 패키징된 많은 구조물을 빠르고 비용 효율적으로 테스트할 수 있으며 보다 관련성이 높은 비인간 영장류 모델에서 B 세포 요법의 타당성 및 확장성에 대한 전임상 테스트를 수행할 수 있습니다.

B 세포는 체액 면역의 기초입니다. 동족 항원과 2차 신호에 의해 활성화되면 나이브 B 세포는 배중심 B 세포, 기억 B 세포 및 형질 세포를 생성합니다1. 후자는 현재 이용 가능한 대부분의 백신의 보호 기능을 매개하는 분비 항체의 공급원이다2. 형질세포는 혈청 내에서 약 2 ng/day/cell3에 달하는 방대한 양의 항체를 분비하며, 이는 혈청 내 7-16 g/L 혈청에 달하는 항체를 가장 풍부한 세 가지 단백질 중 하나로 만들기 때문에 항체 공장으로 알려져 있습니다4. B 세포는 혈액이 풍부하므로 쉽게 얻을 수 있고 개인에게 다시 주입 할 수 있습니다.
이러한 특성으로 인해 B 세포는 B 세포 수용체(BCR)를 유전자 편집하고 인간 면역결핍 바이러스(HIV)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 및 기타 단백질에 대한 광범위한 중화 항체(bNAbs)를 발현하기 위한 세포 치료 노력의 표적이 되었습니다 16, 17,18,19,20,21. 이러한 접근법은 생체 내 수많은 마우스 연구에서 잠재력을 보여주었습니다 7,8,10,11,16,22. 그러나 임상 번역 9,15,23을 위해서는 여전히 몇 가지 장애물을 극복해야 하며, 그 중 안전성, 지속 기간 및 치료 효능의 크기뿐만 아니라 비인간 영장류(NHP)와 같은 더 큰 동물로의 스케일링도 포함됩니다. 실제로, NHP, 특히 항체 및 HIV 연구24,25에서 오랜 역사를 가진 붉은털 원숭이는 이러한 매개 변수를 테스트하는 데 가장 적합한 모델입니다.
여기에서 우리는 이러한 문제를 해결할 수 있는 프로토콜을 개발했습니다. 현재까지, 붉은털원숭이 B 세포를 생체 외에서 배양하려는 연구는 거의 없었고, 붉은털원숭이 B 세포의 정제에 대해 CD20을 사용한 양성 선택만이 보고되었다26,27,28. 우리는 다른 세포 유형의 음성 고갈에 의해 손대지 않은 붉은털 원숭이 B 세포를 분리하기 위한 프로토콜을 확립했습니다. 또한, 배양 조건은 붉은털 원숭이 B 세포의 표적 유전자 편집을 위해 정의됩니다. 이 프로토콜은 배양된 붉은털 원숭이 B 세포를 유전자 편집하기 위한 상동성 지향 복구 템플릿(HDRT)으로 CRISPR/Cas9 리보핵단백질(RNP) 및 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 6(rAAV6)의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 대용량(~1.5kb) 인서트로 최대 40%의 편집 효율성을 달성했습니다. 우리는 또한 테트라사이클린 활성화, 자가 침묵 아데노바이러스 도우미29를 사용하여 rAAV6를 생산하는 빠르고 비용 효율적인 방법을 제시하여 이 형식에서 HDRT의 빠른 테스트를 가능하게 합니다. 이러한 프로토콜은 붉은털 원숭이 B 세포의 유전자 편집을 위한 효율적인 워크플로우를 설명하여(그림 1) NHP 모델에서 B 세포 요법을 평가할 수 있습니다.
실험을 시작하기 위해 기증자 재료는 상업적 출처에서 주문하거나 정맥 절개술 또는 비장 절제술로 얻을 수 있습니다. 이 연구에서, 정맥 절개술 및 혈액 수집은 항응고제 EDTA를 사용하여 앞서 기술한 바와 같이 수행되었다30 . 비장성, 원발성 붉은털원숭이 B 세포를 얻기 위해 이전에 보고된 기술을 사용하여 부분(25%-50%) 또는 전체 비장 절제술을 시행했습니다31. 동물들은 수술 전에 밤새 금식하였다. 간단히 말해서, 수술 중에 복부를 잘라내어 클로르헥시딘과 70% 이소프로필 알코올을 번갈아 가며 세 번 문질러 준비했습니다. 비장을 확인하고 분리하기 위해 복부에 절개 (5-10cm)가 이루어졌습니다. 비장의 혈관 구조는 봉합사 또는 혈관 클램프로 결찰되었습니다. 절개 부위는 4-0 PDS 폴리디옥사논 봉합사로 2층으로 봉합되었습니다. 비장 절제술은 개별 동물에 대해 한 번 수행되었습니다. 단세포 현탁액은 세포 여과기를 통한 침용에 의해 원숭이 비장으로부터 제조되었습니다. 혈액 및 비장 세포 현탁액으로부터의 단핵 세포는 밀도 구배 원심분리를 사용하여 제조되고 액체 질소에 저장되었다.

<table><tbody><tr><td>1.5mL 튜브 멸균, Dnase, Rnase 및 퓨젠 무함유</td><td>Stellar Scientific</td><td>T17-125</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>10mL 혈청학적 피펫, 폴리스티렌, 멸균, 비발열성, DNase-/RNase-free 및 Human DNA가 없는</td><td>Corning</td><td>4488</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>15cm 조직 배양 접시</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td>또는 유사한</td></tr><tr><td>15mL 폴리프로필렌 원뿔형 타이어</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>또는 이와 유사한</td></tr> 차량<tr><td>25 mL 혈청학적 피펫, 폴리스티렌, 멸균, 비발열성, DNase-/RNase-free, Human DNA-free Corning</td><td></td><td>4489</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>250 mL 폴리프로필렌 원뿔형 tybe</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>또는 유사한</td></tr><tr><td>293AAV 세포주</td><td>Cell Biolabs</td><td>AAV-100</td><td></td></tr><tr><td>2-B-mercapto-ethanol, 55mM (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>48-well tissue culture 플레이트</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>5 mL 혈청학적 피펫, 폴리스티렌, 멸균성, 비발열성, DNase-/RNase-free, Human DNA-free Corning</td><td></td><td>4487</td><td>또는</td></tr><tr><td>Luer-Lok Tip</td><td>BD</td><td>309646</td><td>또는 유사한</td></tr><tr><td>50 mL 폴리프로필렌 원뿔형 타이어</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>또는 이와 유사한</td></tr> <tr><td>5 mL 주사기50 mL 혈청학적 피펫, 폴리스티렌, 멸균, 비발열성, DNase-/RNase-free, Human DNA-free</td><td>Corning</td><td>4490</td><td>또는 유사한</td></tr><tr><td>6-웰 조직 배양 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>또는 유사한</td></tr><tr><td>AAV-6 패키징 시스템(플라스미드)</td><td>Cell Biolabs</td><td>VPK-406</td><td></td></tr><tr><td>AAV6 Reference Materials (full capsids)</td><td>Charles River</td><td>RS-AAV6-FL</td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet S 피펫 컨트롤러</td><td>브랜드</td><td>26350</td><td>또는 유사 피펫 컨트롤러</td></tr><tr><td>항생제/항진균제 100x</td><td>Gibco</td><td>15260-062</td><td></td></tr><tr><td>항인간 CD14 AlexaFluor647</td><td>Biolegend</td><td>301812</td><td></td></tr><tr><td>항인간 CD14 비오틴</td><td>BioLegend</td><td>301826</td><td></td></tr><tr><td>항인간 CD16 AlexaFluor700</td><td>BD Biosciences</td><td>557920</td><td></td></tr><tr><td>항-인간 CD16 비오</td>틴 <td>BioLegend</td><td>302004</td><td></td></tr><tr><td>항-인간 CD20 PECy7</td><td>BioLegend</td><td>302312</td><td></td></tr><tr><td>항-인간 CD3 비오틴</td><td>써모 피셔</td><td>APS0309</td><td></td></tr><tr><td>안티-휴먼 CD3 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552127</td><td></td></tr><tr><td>안티-휴먼 CD33 비오</td>틴 <td>Miltenyi</td><td>130-113-347</td><td></td></tr><tr><td>안티-휴먼 CD64 비오틴</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>305004</tr><tr><td>안티 휴먼 CD66 비오틴</td><td>Miltenyi</td><td>130-100-143</td><td></td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD89 비오</td>틴 <td>BioLegend</td><td>354112</td><td></td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD8a 비오틴</td><td>BioLegend</td><td>301004</td><td></td></tr><tr><td>안티 휴먼 HLA-DR BV605</td><td>Biolegend</td><td>307640</td><td></td></tr><tr><td>안티 휴먼 Ig 경쇄 람다 APC</td><td>Biolegend</td><td>316610</td><td></td></tr><tr><td>anti-human IgM BV421</td><td>Biolegend</td><td>314516</td><td></td></tr><tr><td>anti-Human Kappa Light Chain Fisher</td><td>Scientific</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이</td><td>브 Steris</td><td>Amsco Lab 250</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>세포 배양 CO2 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>51026331</td><td>또는 유사한</td></tr><tr><td>원심 필터 유닛 (Amicon Ultra - 4, 100 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC810024</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5920 R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628188</td><td>또는 기타 냉각 가능한 스윙 버킷 원심분리기, 96웰 플레이트, 15, 50 및 250 mL 크기 튜브용 인서트</td></tr> 클로<tr><td>로포름</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Cpg ODN</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-2395</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI(RNase-free)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘</td><td>없음 Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation 키트(Neon Transfection System 10 &micro; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td>또는 기타 크기 또는 100 uL transfection kit MPK 10096</td></tr><tr><td>Electroporation system (Neon Transfection System)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03*</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-PM400 (Ficoll-Paque PLUS)</td><td>Cytiva</td><td>17144002</td><td>또는 유사한</td></tr><tr><td>Fume Hood</td><td>Fisher Scientific</td><td>FH3943810244</td><td>또는 이와 유사한</td></tr> 차량<tr><td>글루타민 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>눈금 실린더 1L</td><td>Corning</td><td>3022-1L</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z375357-1EA</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트 자기 교반기</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88857200</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>Human BAFF</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>310-13</td><td></td></tr><tr><td>인간 BD Fc 블록</td><td>BD</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>인간 IL-10</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>인간 IL-2</td><td>페프로텍&nbsp;</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>친수성 폴리에테르설폰 주사기 필터, (Supor membrane), 멸균 - 0.2 &마이크로; m, 25 mm&nbsp;</td><td>Pall</td><td>4612</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferin-Selenium, 100x</td><td>Gibco</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>ITR 프라이머 포워드: GGAACCCCTAGTGATGGAGTT</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>ITR 프라이머 리버스: CGGCCTCAGTGAGCGA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>층류 생물 안전 캐비닛</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>대형 자기 공핍 (LD) 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>마젠틱 세퍼레이터 (MidiMACS 분리기 및 멀티스탠드)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-329</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 교반 막대</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-127</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>마그네틱 스트렙타비딘 비드 (Streptavidin MicroBeads)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep 키트</td><td>Machery-Nagel</td><td>740414.5</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>미디어 병 2L 캡 포함</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34514-26</td><td>또는 유사한</td></tr><tr><td>MegaCD40L</td><td>Enzo</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 384웰 반응 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 접착 필름</td><td>Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기, 5424 R</td>, <td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td>또는 기타 1.5 mL 튜브용 탁상용 원심분리기</td></tr><tr><td>, 전자레인지</td>, <td>Panasonic</td><td>NN-SD987SA</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>Nikon TMS Inverted Phase Contrast Microscope</td>, <td>Nikon</td><td>TMS</td><td>또는 기타 세포 배양을 위한 Inverted Phase Contrast 현미경</td></tr>, <tr><td>비필수 아미노산, 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 이중 완충액</td><td>통합 DNA 기술</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>Qiagen</td><td>129115</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Mettler Toledo</td><td>30019028</td><td>또는 유사한</td></tr><tr><td>Pipetman Classic 스타터 키트, 4 피펫 키트, P2, P20, P200, P1000 및 팁</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td>또는 이와 유사한 피펫 및 팁</td></tr><tr><td>세트 Pluronic F-68 10 %</td><td>Gibco</td><td>24040-032</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 8000</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 이민, 선형, MW 25000, 트랜스펙션 등급 (PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-100</td><td></td></tr><tr><td>정밀 저울</td><td>Mettler Toledo</td><td>ME4001TE</td><td>또는 유사한</td></tr><tr><td>사전 분리 필터 (30 &micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>파이렉스 유리 비커 2 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34502-13</td><td>또는 유사한</td></tr><tr><td>파이렉스 유리 비커 250 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS1000250</td><td>또는 유사한</td></tr><tr><td>qPCR 기기</td><td>Fisher Scientific</td><td>4485691</td><td>또는 유사한</td></tr><tr><td>RC1 항원 무작위 비오틴화</td><td>Bjorkman 실험실, CalTech</td><td>사내</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>S.p. Cas9 Nuclease</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081059</td><td></td></tr><tr><td>Scientific 1203 수조</td><td>VWR</td><td>24118</td><td>또는 어떤 수조 세트&nbsp; 37 &deg; C</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루베이트 100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>멸균 일회용 필터 유닛 PES 막 Thermo</td><td>&nbsp; 과학적 Nalgene&nbsp;</td><td>567-0020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td></td></tr><tr><td>SYBR 그린 마스터 믹스&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린 활성화, 자체 침묵 아데노바이러스 벡터 RepCap6&nbsp;</td><td>Oxgene</td><td>TESSA-RepCap6</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td><td>Gibco 25300054</td><td></td><td></td></tr><tr><td>정수 시스템</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZEQ7000TR</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>Zombie-NIR</td><td>Biolegend</td><td>423106</td><td></td></tr></tbody></table>

일차 붉은털 원숭이 b 세포의 유전자 편집

Gene Editing of Primary Rhesus Macaque B Cells

B 세포와 그 자손은 고도로 발현된 항체의 공급원입니다. 풍부한 단백질, 말초 혈액을 통한 쉬운 접근성, 간단한 입양 이식에 대한 접근성과 함께 높은 단백질 발현 능력은 재조합 항체 또는 기타 치료 단백질을 발현하기 위한 유전자 편집 접근법의 매력적인 표적이 되었습니다. 마우스 및 인간 일차 B 세포의 유전자 편집은 효율적이며 생체 내 연구를 위한 마우스 모델은 가능성을 보여주었지만 더 큰 동물 모델에 대한 타당성과 확장성은 지금까지 입증되지 않았습니다. 따라서 우리는 이러한 연구를 가능하게 하기 위해 시험관 내에서 붉은털 원숭이 일차 B 세포를 편집하는 프로토콜을 개발했습니다. 우리는 CRISPR/Cas9를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포 또는 비장 세포에서 일차 붉은털 원숭이 B 세포의 시험관 내 배양 및 유전자 편집 조건을 보고합니다. 대형(<4.5kb) 카세트의 표적 통합을 달성하기 위해 테트라사이클린 활성화 자가 침묵 아데노바이러스 헬퍼 벡터를 사용하여 상동성 지향 복구 템플릿으로 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 6을 준비하기 위한 빠르고 효율적인 프로토콜이 포함되었습니다. 이러한 프로토콜을 통해 붉은털 원숭이의 전향적 B 세포 치료제를 연구할 수 있습니다.

B세포 치료제 연구를 위해 CRISPR/Cas9 및 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 6을 이용하여 일차 붉은털원숭이 B세포를 배양하고 유전자를 편집하는 방법을 제시합니다.

일차 붉은털 원숭이 B 세포의 유전자 편집

B cells and their progeny are the sources of highly expressed antibodies. Their high protein expression capabilities together with their abundance, easy ...

이 방법은 비교적 간단하며 붉은털 원숭이 B 세포의 효율적인 유전자 편집을 가능하게 합니다. 이 방법을 사용하면 붉은털 원숭이의 치료 목적으로 유전자 편집 B 세포를 테스트할 수 있습니다. 전임상 B 세포 치료 연구에도 적합합니다.일반적인 방법은 다른 세포 유형에 적합할 수 있다. 절차를 올바르게 수행하면 어려움을 기대해서는 안됩니다. 그러나, gRNA 절단 효율 및 재조합 AAV6 제공 주형의 양질의 배치가 중요하기 때문이다.시작하려면 섭씨 37도의 수조에서 B 세포 배양 배지를 예열합니다. 얼음에서 B 세포 각성제를 해동하십시오. 예열된 해동 매체가 들어 있는 적절한 크기의 튜브를 준비합니다.1차 붉은털 원숭이 비장세포 또는 PBMC의 1-2개 바이알을 섭씨 37도의 수조에서 해동합니다. 미리 예열된 해동 배지가 들어 있는 준비된 튜브에 비장세포를 디캔팅합니다. cryotube를 헹구어 모든 세포를 수집합니다.실온에서 10분 동안 200G에서 세포를 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세척을 위해 10 밀리리터의 해동 배지에 세포를 재현탁하십시오. 원심분리를 세 번 반복하여 동결 매체를 제거합니다.마지막 원심분리 후, 세포를 B 세포 배양 배지에서 밀리리터당 10 내지 6개의 세포로 추정 5배로 재현탁시킨다. 10 마이크로리터의 세포 현탁액과 10 마이크로리터의 0.4% 트리판 블루를 결합하고 혈구계에서 세포 수를 세십시오. 세포 수에 따라 B 세포 배양 배지로 밀리리터당 6개의 세포를 10배로 3회 조절한다.그런 다음 B 세포 각성제를 최종 농도에 첨가하고 혼합합니다. 세포를 세포 배양 접시에 옮기고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 48시간 동안 배양합니다. 침전 후, 세포는 조밀 한 단층을 형성해야하며 작은 세포 클러스터가 이미 보일 수 있습니다.약 이틀 후, 세포는 건강하고 불규칙하며 눈에 띄게 더 큰 클러스터를 형성해야 합니다. B 세포를 활성화시킨 후, 전기천공 및 형질도입을 위한 시약을 준비한다. DMSO 뉴클레아제가 없는 듀플렉스 버퍼, 버퍼 T 및 버퍼 E 또는 E2를 전기천공 키트에서 실온으로 예열합니다.rAAV6 상동성 지향 복구 템플릿 또는 HDRT 및 B 세포 자극제를 얼음에서 해동합니다. CRISPR Cas9 single-guide RNA 또는 sgRNA를 듀플렉스 버퍼에서 100마이크로몰로 재현탁합니다. 실온에서 10분간 재구성하고 볼텍싱과 플릭으로 혼합한다.재구성된 sgRNA를 사용할 때까지 얼음 위에 놓습니다. 10마이크로리터 전기천공의 경우 각성제 및 1% DMSO가 포함된 550마이크로리터의 B 세포 배양 배지를 준비합니다. 항생제를 사용하거나 사용하지 않고 이 배지 50마이크로리터를 48웰 세포 배양 플레이트에 추가합니다.그런 다음 rAAV6 HDRT를 웰 부피의 최대 20%까지 웰의 매체에 추가합니다. 준비된 접시와 남은 배지를 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5% 이산화탄소로 예열합니다. 다음으로, 10 마이크로리터 전기천공을 위해, 듀플렉스 완충액에서 0.4 마이크로리터의 61 마이크로몰 Cas9와 0.75 마이크로리터의 100 마이크로몰 sgRNA를 혼합하여 1.15 마이크로리터의 리보핵단백질 또는 RNP를 준비한다.RNP를 세포와 혼합하기 전에 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, 하나 이상의 유전자좌가 동시에 표적화되는 경우 여러 RNP를 결합할 수 있습니다. 다음으로, 전기 천공을 위해 셀을 준비합니다.온도 충격을 피하기 위해 셀을 실온에 두십시오. 배양 후, 세포를 적절한 용기로 수확한다. DPBS로 접시를 헹구어 최대 세포 수를 수집하십시오.세포를 200G에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고, 배양물에 투입된 세포의 수를 기준으로 약 2배 내지 밀리리터당 6개의 세포로 DPBS에 세포를 재현탁시킨다. 동일한 부피의 세포 현탁액과 0.4% 트리판 블루를 결합하고 혈구계를 사용하여 계산합니다.원심분리하고 상청액을 버린 후, 세포 계수를 기준으로 5.55 x 10 내지 7개의 세포로 예열된 완충액 T에서 세포를 재현탁한다. 기계를 켜고 1, 350볼트, 15밀리초 및 1펄스로 설정하여 형질주입 시스템을 설정합니다. 층류 후드 안에 피펫 스테이션을 놓습니다.10개의 전기천공법의 각 세트에 대해, 3밀리리터의 완충액 E.가 있는 형질주입 튜브를 준비하고, 튜브를 피펫 스테이션에 삽입한다. 전기천공당 1.15마이크로리터의 RNP와 9마이크로리터의 세포를 결합합니다. 기포를 피하기 위해 최소 20% 이상 준비하고 전기천공 전에 실온에서 1분 동안 배양합니다.10마이크로리터의 RNP와 세포 혼합물을 전기천공 피펫의 전기천공 팁으로 흡인합니다. 로드된 피펫을 피펫 스테이션에 삽입하고 전기천공을 시작합니다. 아크를 방지하기 위해 팁에 기포가 완전히 없는지 확인하십시오.전기 천공 된 셀을 48 웰 내부의 rAAV6 유무에 관계없이 준비된 예열 된 소량의 배지로 즉시 배출합니다. transfection하지 않고 대조군 샘플을 배양 웰에 추가합니다. 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 4-6 시간 동안 세포를 배양하십시오.배양이 끝나면 각성제, DMSO 및 항생제를 포함하거나 포함하지 않는 예열 된 B 세포 배양 배지 450 마이크로 리터를 플레이트에 첨가하십시오. 24시간 후에 게놈 DNA 분석을 수행합니다. 상동성 암 외부의 프라이머와 삽입물 내부의 프라이머를 사용하여 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 편집 효율을 정량화합니다.PCR을 수행하여 삽입 부위를 증폭하고 Sanger 염기서열 분석을 수행하여 올바른 편집을 확인합니다. 단백질 수준을 분석하기 위해, 단백질 발현 변화를 허용하도록 전기천공 후 40 내지 48시간 동안 세포를 배양하고 유세포 분석에 의한 분석을 수행한다. 테트라사이클린이 활성화된 자가 침묵 아데노바이러스 헬퍼를 사용한 rAAV6의 생산은 세포 배양 배지 밀리리터당 10 내지 10 GC의 4배를 생산하여 헬퍼가 없는 삼중 형질감염을 사용한 생산을 30배에서 40배 능가했습니다.선택적 정제를 통해 대부분의 CD3+T 세포와 CD14+ 및 CD16+골수 세포가 제거되었으며, 순도 80 내지 95%의 CD20+B 세포가 일상적으로 얻어졌습니다. 일차 붉은털 원숭이 B 세포의 유전자 편집이 여기에 나와 있습니다. 이 연구는 높은 세포 생존율을 유지하면서 동시에 80%B 세포에서 경쇄 발현을 삭제했습니다.대부분의 B 세포는 여전히 이소타입 IgM을 발현했습니다. 항체 1485 HDRT를 코딩하는 rAAV6의 첨가는 편집되지 않은 B 세포보다 항체 사슬에 대한 형광 강도가 낮았음에도 불구하고 B 세포의 16 내지 21%에서 유전자 편집 및 항체 1485 표면 발현을 초래했습니다. 1% DMSO를 추가하고 rAAV6 HDRT를 사용한 확장된 농축 배양은 일반적으로 편집 효율성을 높였습니다.이 방법을 사용하면 일반적으로 5-20 % 및 최대 40 %의 편집 효율이 개별 붉은털 원숭이 및 rAAV6 HDRT 배치의 품질에 따라 달성되었습니다. 전기천공을 수행하는 동안 형질주입을 위한 충분한 혼합물이 있고 팁에 기포가 없는지 확인합니다. 세포는 임의의 원하는 방법에 의해 분석될 수 있거나, 또는 공여체 붉은털 원숭이 내로의 자가 이식이 수행될 수 있다.

gene-editing-of-primary-rhesus-macaque-b-cells

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 총뿐만 아니라 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 CD4 +와 CD8 + T 세포, HIV / AIDS 백신 연구를위한 이상적인 모델의 메모리 하위 집합에 대한 자세한 phenotypic와 기능 특성에 대한 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 유틸리티를 보여줍니다.

붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 세포 면역 반응의 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 분석

우리는 유전자 비 바이러스를 사용하여 transgene과 기본 인간의 T 세포를 수정하는 방법을...

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

여기에서는 AIDS 바이러스를 붉은 털 원숭이 CD8 + T 세포를 열거하고 특성화하기위한 최적의 프로토콜을 제시한다. 이 문서에서는 HIV의 면역학 분야에뿐만 아니라, CD8 + T 세포 반응이 질병의 결과에 영향을 미치는 것으로 알려져있다 생물 의학 연구의 다른 영역뿐만 아니라 유용합니다.

유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석 + 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

이 프로토콜의 목표 nonhuman 영장류 CD34 분리 하는+ 세포 액된 골, 유전자-수정 lentiviral 벡터와이 셀 하 고 주입 헌 호스트에 대 한 제품을 준비에서. 총 프로토콜 길이 약 48 h입니다.

준비 및 Nonhuman 영장류 조 혈 줄기와 조상 세포의 유전자 수정

여기에 제시된 것은 튜브 전기포공을 이용한 포유류 세포에서 효율적인 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질 매개 유전자 편집을 위한 프로토콜이다.

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

우리는 세포 효능의 주입 연구를 위한 충분한 수에 있는 관심 있는 유전자의 우수한 공동 발현을 가진 세포를 산출하는 rhesus macaque 말초 혈액 단핵 세포의 transduction 그리고 확장을 위한 9 일 프로토콜을 개략적으로 설명합니다.

중앙 메모리 표현형의 유지 보수와 함께 9 일 만에 1 차 T 세포의 전환 및 확장

여기서 우리는 B 세포에서 유전자의 생물학적 기능을 연구하고 B 세포 치료제의 개발을 연구하기 위해 유전자 녹아웃 (KO) 및 노크 인 (KI)에 대한 1 차 인간 B 세포의 CRISPR / Cas9 기반 게놈 공학을위한 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 1차 인간 B 세포의 게놈 공학

이 프로토콜의 목표는 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체와 스크리닝을 위한 dpy-10 공동 CRISPR 마커를 사용하여 C. elegans 게놈의 원활한 CRISPR/Cas9 편집을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 삽입, 삭제, 유전자 대체 및 코돈 대체를 포함하여 C. elegans에 있는 유전 수정의 각종을 만들기 위하여 이용될 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

이 프로토콜은 시험관내에서 조립되고 전기천공법으로 전달되는 Cas9-sgRNA 리보핵단백질 복합체를 사용하여 마우스 골수 유래 대식세포에서 게놈 편집 절차를 설명합니다.

전기천공된 Cas9-sgRNA 복합체를 사용한 일차 골수 유래 대식세포의 고효율 유전자 파괴

RNA로서 게놈 편집자를 전달하는 것은 1차 포유류 세포와 세포주의 게놈을 변형하는 데 특히 강력한 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 유전체 편집기를 mRNA로 1차 포유류 세포와 세포주에 전달한 후, 표적 Illumina 시퀀싱과 분석을 통해 편집 결과를 정량화하는 것입니다.

1차 포유류 세포에서 편집자 RNA의 전기천공을 통한 유전체 편집

학습하세요 CRISPR/Cas9와 rAAV6를 이용한 일차 붉은털 원숭이 B 세포 유전자 편집 방법입니다. 이 기술은 B 세포 치료제 연구와 전임상 개발에 필수적인 도구를 제공합니다.

일차 붉은털 원숭이 B 세포의 유전자 편집

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