면역 능력이 있는 마우스를 기관내로 접종하기 위한 한천 비드 내장 마이코박테리움 농양의 제조

우리는 전임상 연구에서 항생제 효능을 테스트하기 위해 만성 마이코박테리움 농양 폐 감염의 마우스 모델을 개발하고 있습니다. 첫 번째 과제는 마이코박테리움 농양에 대한 생쥐의 본질적인 내성을 극복하는 것입니다. 두 번째 과제는 기관내 감염을 위한 한천 박동 박테리아의 재현 가능한 배치를 생성하는 것입니다. 우리는 생쥐에서 신약을 테스트하기 위해 다른 실험실에서 쉽게 구현할 수 있는 한천 박동 준비 및 감염에 대한 자세한 프로토콜을 공유하고자 합니다.

유리 박테리아 대신 한천 박테리아 박테리아로 감염하면 면역 능력이 있는 마우스가 자발적으로 감염을 제거하는 능력을 부분적으로 극복합니다. 이 모델은 마이코박테리움 농양에 대한 새로운 항생제를 평가하기 위한 강력한 전임상 도구를 제공하여 폐 감염에 대해 절실히 필요한 항생제의 발견 및 개발을 촉진합니다.

[강사] 시작하려면 광학 밀도 30으로 조정된 기하급수적으로 성장하는 마이코박테리움 농양 현탁액 배양물을 얻습니다. 섭씨 50도에서 미리 평형화된 용융된 삼부작 콩 오거 27밀리리터를 박테리아 현탁액 3밀리리터가 들어 있는 튜브에 옮깁니다. 피펫팅으로 현탁액을 혼합합니다. 박테리아 오거 혼합물을 플라스크에 60밀리리터의 미네랄 오일이 들어 있는 플라스크에 조심스럽게 피펫팅합니다. 플라스크를 보조 용기에 넣고 즉시 자기 교반 막대를 사용하여 자기 교반에서 중간 속도로 교반을 시작합니다. 오일 오거 혼합물에 눈에 보이는 소용돌이가 형성되는지 확인하고 실온에서 6분 동안 계속 저어줍니다. 현탁액이 식을 수 있도록 보조 용기에 얼음을 넣습니다. 그런 다음 슬러리 혼합물을 250밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 처음 5사이클 동안 섭씨 4도에서 6분 동안 현탁액을 3,700G에서 원심분리하고 오거 비드 펠릿을 DPBS로 재현탁합니다. 또한 깔때기 셀 스트레이너, 커넥터 링 및 50밀리리터 튜브를 단일 장치로 조립합니다. 10번째 세척 후 펠릿을 재현탁하고 비드 현탁액을 4배 희석합니다. 희석된 샘플 재료를 스트레이너에 추가하여 비드 현탁액을 여과합니다. 커넥터 링에 부착된 30밀리리터 주사기의 피스톤을 천천히 당겨 흡입력을 생성하고 여과를 강화합니다. 그런 다음 희석된 현탁액을 1000G에서 2분 동안 원심분리하여 농축합니다. 비드 펠릿을 50밀리리터 튜브에 넣은 후 섭씨 4도에서 최대 1주일 동안 보관하되 각 실험 배치에 대해 신선한 비드를 준비하십시오. 시작하려면 맞춤형 디자인의 3차원 인쇄된 기울어진 스탠드를 사용하여 진정된 CD One 마우스를 제지합니다. 스탠드의 중앙 막대에 부착된 봉합사 끈을 사용하여 앞니로 마우스를 고정합니다. 마우스를 머리를 들고 복부 누운 자세로 배치합니다. 금속 24게이지 동물 사료 바늘을 마이코박테리움 농양 오거 비드 서스펜션으로 채워진 유리 주사기에 부착합니다. 플런저에 나일론 클립이나 마개를 놓아 마우스당 50마이크로리터의 접종량을 제어합니다. 이제 금속 위관 바늘을 마우스 위에 수직으로 놓습니다. 바늘을 상단에 조심스럽게 삽입하고 기관 안으로 더 아래로 밀어 넣습니다. 나일론 클립이나 마개를 제거하고 50마이크로리터의 마이코박테리움 농양 오거 비드 현탁액을 폐에 천천히 분배합니다. 마우스를 5분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 접종 절차를 두 번째로 반복하여 전체 접종물이 폐에 깊고 재현 가능한 침착되도록 합니다. 마이코박테리움 농양을 함유한 오거 비드는 mCherry 적색 형광 단백질을 발현했으며 크기는 약 70 내지 250마이크로미터까지 다양했습니다. 6개의 독립적인 비드 제제에 걸친 박테리아 부담은 높은 재현성을 보여주었습니다. 유리 주사기를 통과하기 전과 후의 박테리아 계수에서는 박테리아 부담의 현저한 손실이 나타나지 않았습니다. 기관간 접종 방법은 감염 후 24시간에 폐 CFU 수에서 알 수 있듯이 3개의 독립적인 비드 제제에 걸쳐 재현 가능했습니다. 감염 후 24시간의 폐 CFU 수치가 모든 그룹에서 일관되게 유지되었기 때문에 3명의 독립적인 시술자 간의 감염 재현성이 확인되었습니다.