초음파 국소화 현미경을 사용한 쥐 뇌 미세혈관 구조의 2차원 초해상도 시각화

우리 연구의 범위는 쥐 뇌 미세혈관 구조의 초고해상도 이미징을 달성하기 위한 초음파 국소화 현미경 프로토콜을 개발하는 데 중점을 둡니다. 우리는 작은 혈관을 이미징할 때 특수 해상도와 침투 깊이의 균형을 맞추는 문제를 해결하여 건강한 상태와 질병 상태의 혈관 구조와 혈류 역학에 대한 자세한 통찰력을 제공하는 것을 목표로 합니다.

당사의 프로토콜은 MRI, CT 및 이중 초음파와 같은 기존 방법을 능가하는 최대 12mm의 침투 깊이를 유지하면서 12.5마이크로미터의 높은 공간 해상도를 달성할 수 있는 이점을 제공합니다. 광학 기술과 달리 뇌 심부 영역을 이미징하고, 미세혈관 구조를 재구성하고, 혈류 역학을 동시에 시각화할 수 있습니다.

우리의 결과는 교모세포 종양 및 알츠하이머병과 같은 신경 장애의 미세혈관 변화를 조사할 수 있는 길을 열어줍니다. 혈류 역학과 미세혈관 구조를 고해상도로 시각화하는 능력은 질병 진행, 치료 효능, 근육 변화와 뇌 기능 사이의 관계를 연구할 수 있는 새로운 기회를 열어줍니다.

[해설자] 시작하려면 마취된 쥐를 수술대에 놓습니다. 쥐의 윗 앞니를 앞니 막대의 노치에 고정하고 아래턱을 막대 아래에 위치시킵니다. 이어바를 외이도보다 약간 앞쪽과 위쪽의 뼈 움푹 들어간 부분에 배치하여 두개골 표면이 수평을 유지하도록 합니다. 안정성을 평가하기 위해 머리의 여러 부분에 약간의 압력을 가합니다. 이미징 플랫폼의 높이를 미세 조정하고 앞니 노치를 사용하여 쥐의 머리 각도를 조정하여 호흡이 방해받지 않도록 합니다. 쥐의 눈에 에리스로마이신 연고나 글리세린 용액 30%를 바르면 수술용 조명으로부터 눈을 보호하고 수분을 유지할 수 있습니다. 휴대용 전기 이발기로 쥐의 머리를 털이 자라는 방향에 맞춰 면도하여 귀 사이와 눈에서 목까지 덮습니다. 이제 쥐 두개골의 시상 봉합사를 따라 후두골부터 시작하여 전방으로 약 4cm까지 절개합니다. 지혈제를 사용하여 양쪽 피부를 후퇴시킵니다. 선택적으로 더 쉽게 접근할 수 있도록 두개골 위의 피부를 절제합니다. 작은 가위를 사용하여 두개골에서 골막을 제거하고 단단한 뼈층을 완전히 노출시킵니다. 2.5mm 구형 드릴 비트가 있는 휴대용 미니 두개골 드릴로 개두술을 수행합니다. 뼈를 깎기 위해 부드럽게 두드려 한 번에 2-3초 동안 구멍을 뚫고 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 진행합니다. 2분마다 약 1밀리리터의 0.9% 염화나트륨 용액을 드릴링 영역에 주입하여 식히고 잔해물을 헹굽니다. 백골 조직이 더 이상 일관되게 연결되어 있지 않으면 더 미세한 1mm 드릴 비트로 전환하십시오. 중앙 주요 혈관이 짙은 갈색으로 선명하게 보이고 주변 조직은 분홍색으로 보이고 미세 혈관은 약간 붉은색을 띤 채 계속 드릴링했습니다. 조영제를 준비하려면 SF6 가스와 동결건조 조영제 분말을 0.9% 염화나트륨 5밀리리터에 녹입니다. 혼합물을 세게 흔들어 미세 기포 또는 MB 현탁액을 형성하고 최종 SF6 농도는 밀리리터당 8마이크로리터입니다. 0.8밀리리터의 MB 현탁액을 미세 주입 펌프에 부착된 1밀리리터 주사기에 끌어 당깁니다. 카테터가 있는 26게이지 주내 바늘을 쥐의 꼬리 정맥에 삽입하고 주입합니다. 이미징하기 전에 클램프가 장착된 뇌 정위 고정 기기의 조작기 암에 중심 주파수가 15.625메가헤르츠인 프로브를 장착합니다. 노출된 쥐의 뇌 바로 위에 초음파 프로브를 배치하고 노출된 뇌 표면에 커플링 젤을 도포하여 최적의 신호 전달을 보장합니다. 랩 브레인 아틀라스와 모터 모션 제어 프로그램을 통합하는 소프트웨어의 기본 인터페이스를 엽니다. BGMA 포인트를 원점으로 설정하고 소프트웨어의 실시간 디스플레이를 사용하여 프로브의 궤적과 해당 쥐 뇌 슬라이스 위치를 모니터링합니다. BGMA에서 1mm를 뺀 것과 같은 대상 이미징 평면을 선택합니다. MATLAB 2021a 소프트웨어를 실행하고 MATLAB 2021a에 데이터 수집 스크립트를 입력합니다. 루트 디렉토리의 명령줄 창에 "activate"를 입력하여 런타임 환경을 활성화합니다. 그런 다음 데이터 수집 시작 및 종료 깊이를 각각 5개 및 120개 파장으로 설정하여 관심 영역을 효과적으로 캡처합니다. 평면파 전송 조향 각도를 영하 5도에서 5도까지 2.5도 단위로 설정하여 이미지 해상도와 대비를 향상시킵니다. 초음파 국소화 현미경 검사는 최대 12mm 깊이에서 미세혈관의 선명한 시각화를 보여주었습니다. 절반 최대에서 전체 너비를 분석한 결과 감지 가능한 가장 작은 혈관 직경이 13마이크로미터로 나타났습니다. 푸리에 링 상관관계는 미세혈관 영상의 공간 해상도를 12.5마이크로미터로 확인했습니다. 쥐 뇌의 단면 절편에서 혈류 방향은 각각 파란색과 빨간색으로 표시되는 작은 피질 동맥에서 하향 흐름과 작은 정맥에서 상향 흐름을 나타냈습니다. 속도 지도는 더 큰 용기에서 더 높은 유속을 보여주었으며 대부분의 속도는 초당 10-25mm 범위에 집중되어 있었습니다. 교모세포종 쥐 모델의 영상화는 비정상적인 혈관 확장, 종양 근처의 구조적 불규칙성, 종양 부위의 변화된 혈류 패턴, 종양 내부 및 주변의 이질적인 혈관 흐름을 보여주었습니다.