June 6th, 2025
이 프로토콜은 밀도 구배 원심분리를 사용하여 HSD를 먹인 염분에 민감한 쥐로부터 장내 미생물 EV를 분리하는 방법을 설명합니다. EV는 나노입자 추적, TEM, LPS/BCA 분석 및 16S rRNA 염기서열분석을 통해 크기, 형태, 구성 및 미생물군 기원을 분석했습니다.
이 연구는 고염 식단을 섭취하는 염분에 민감한 고혈압 쥐에서 장내 미생물 세포외 소포의 역할을 탐구하고, 고염 식단이 어떻게 소포를 변화시키고 고혈압 및 면역 상호 작용에 영향을 미치는지 조사합니다. 이 분야의 최근 발전에는 고혈압에서 장내 미생물 세포외 소포의 역할 이해, 고염 식단이 미생물 다양성에 미치는 영향 평가, 대사 및 면역 조절에서 소포를 표적으로 하는 식물 기반 개입 구현이 포함됩니다. 현재 실험 과제에는 우선 순위가 높은 세포외 소포를 분리하고, 미생물군집 소포에서 파생된 소포를 구별하고, 표준 염색 프로토콜에서 샘플 손실을 최소화하여 연구 전반에 걸쳐 재현성을 보장하는 것이 포함됩니다. 이 밀도 그리드 및 원심분리 프로토콜은 기존 방법에 비해 무결성과 재현성이 향상된 세포외 소포에 더 높은 우선순위를 제공하여 고혈압 연구에서 보다 신뢰할 수 있는 장내 미생물군집 세포외 소포 연구를 가능하게 합니다.
[해설자] 시작하려면 대변 5g을 미리 무게가 측정된 50밀리리터 원심분리기 튜브에 옮깁니다. 섭씨 37도로 예열된 내독소가 없는 PBS 50밀리리터를 튜브에 넣고 튜브를 30분 동안 회전시킵니다. 고속 원심분리기를 섭씨 4도로 식힙니다. 그런 다음 샘플을 원심분리기에 대칭으로 넣고 8,000G에서 15분 동안 회전시킵니다. 원심분리 후 상청액을 흡인하여 새로운 멸균 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다시 15분 동안 원심분리한 후 상청액을 조심스럽게 흡인하여 추가 분석에 사용합니다. 멸균 0.22마이크로미터 필터 장치를 얼음 위에 놓습니다. 상청액을 필터 상단으로 옮기고 진공 펌프를 켜서 여과된 샘플을 수집합니다. 여과액을 10킬로달톤 컷오프와 15밀리리터 용량의 원심 필터로 옮깁니다. 섭씨 4도 3000G에서 30분 동안 원심분리하여 샘플을 최소 1,400마이크로리터까지 농축합니다. 즉시 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 1부피의 그래디언트 버퍼 A와 5부피의 밀도 그래디언트 매체를 혼합하여 작업 용액을 준비합니다. 10% 요오딕산올 용액을 1단위의 작업 용액과 4단위의 완충액 B를 혼합하여 준비합니다. 유사하게, 20% 요오딕산올 용액의 경우 2단위의 작업 용액과 3단위의 완충액 B를 혼합하고, 40% 요오딕산올 용액의 경우 4단위의 작업 용액과 1단위의 완충액 B를 혼합합니다. 이제 이전에 준비된 농축 샘플을 7밀리리터의 밀도 구배 배지와 혼합하여 50% 요오딕산올 용액을 만듭니다. 밀도 구배를 준비하려면 40% 및 10% 요오딕산올 용액에 트리판 블루 용액을 첨가합니다. 50% 요오딕산올 용액 8밀리리터를 얇은 벽의 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 바닥으로 옮깁니다. 튜브를 70도로 기울이고 8밀리리터의 40% 요오딕산올 용액을 액체 표면으로 옮깁니다. 다음으로, 20% 요오딕산올 용액 8밀리리터를 첨가한 다음 10% 요오딕산올 용액 7밀리리터와 내독소가 없는 PBS 2밀리리터를 첨가합니다. 준비된 밀도 구배 튜브를 가져와 예냉된 초원심분리기에 넣습니다. 초원심분리 매개변수를 100,000G, 20시간 및 섭씨 10도로 설정하고 실행을 시작합니다. 수집을 위한 수동 구배 밀도 분리의 경우 밀도 구배는 약 34밀리리터의 액체입니다. 액체 표면 중앙에서 2밀리리터의 용액을 천천히 추출하고 각 2밀리리터 용액은 구배입니다. 따라서 밀도 구배 솔루션은 17개의 구배로 나뉩니다. 마지막으로 피펫을 사용하여 밀도 분율을 멸균 샘플 튜브로 옮기고 즉시 얼음 위에 놓습니다. 나노 입자 추적 분석은 다양한 밀도 구배 분율에서 수집된 세포외 소포의 크기, 분포 및 농도 프로파일을 밝혔습니다. 모든 분획에 걸쳐 대부분의 세포외 소포는 일반적인 분포 패턴에 따라 30 내지 100 나노미터 크기 범위 내에 집중되었습니다. 세포외 소포의 농도는 분수 9에서 최고 수준에 도달하여 밀리리터당 9개의 입자의 거듭제곱으로 약 3.85 x 10에서 정점에 도달했습니다. 비신코닌산 키트를 사용하여 측정한 단백질 함량도 마이크로리터당 0.417마이크로그램으로 분획 9에서 가장 높았습니다. 또한, 내독소 검출 키트를 사용하여 결정된 지질다당류 발현 수준은 분획 9와 10에서 유의하게 증가했습니다. 도데실 황산나트륨 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동 분석 중 분획 9에서도 더 많은 양의 단백질이 관찰되었습니다. 투과 전자 현미경 또는 TEM 이미지는 원형 막과 같은 형태로 소유한 세포외 소포를 밝혔습니다.
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본 연구는 고나트륨 식이를 섭취하는 염에 민감한 고혈압 백서에서 장내 미생물 세포외 소포(EVs)의 역할을 조사합니다. 이 연구는 고나트륨 식이가 이러한 소포와 고혈압 및 면역 상호 작용에 미치는 영향에 대한 통찰력을 제공합니다.
Efficient separation and characterization of gut microbial extracellular vesicles (EVs) under high-salt dietary conditions addresses a critical gap in understanding hypertension mechanisms at the molecular level. This workflow enables precise profiling of EVs, supporting predictive confidence in linking microbiome-derived factors to disease-relevant pathways. The approach strengthens early discovery and target validation for microbiome-influenced cardiovascular risk portfolios.
This density gradient EV isolation method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for microbiome-cardiovascular research.