Deze video-artikel beschrijft stap voor stap, hoe je een sperma monster proces om goede kwaliteit te bereiken fluorescentie In situ Hybridisatie op de menselijke spermatozoa. Verkregen preparaten kunnen gebruikt worden voor aneuploidie screening in de context van de klinische diagnose.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH) Protocol in menselijk sperma
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Aneuploïdieën zijn de meest voorkomende chromosomale afwijkingen bij de mens. De meeste van deze afwijkingen het gevolg zijn van fouten tijdens de meiose gametogene proces in de ouders. In de menselijke mannetjes, kunnen deze fouten leiden tot de productie van spermatozoa met numerieke chromosoomafwijkingen die een verhoogd risico van overdracht van deze afwijkingen aan het nageslacht te vertegenwoordigen.
Om deze reden heeft de techniek van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) op het sperma kernen wordt een protocol op grote schaal opgenomen in de context van de klinische diagnose. Deze werkwijze geeft een schatting van de frequenties van numerieke chromosoom afwijkingen in de gameten van de patiënten die zoeken naar genetische voortplanting advies.
Tot op heden, de chromosomen het vaakst opgenomen in het sperma FISH analyse zijn chromosomen X, Y, 13, 18 en 21.
Deze video-artikel beschrijft stap voor stap, hoe te verwerken en vast een menselijk sperma, hoe decondense en denatureren het sperma chromatine, hoe over te gaan tot zaadcellen visbereidingen te krijgen, en hoe u de resultaten op de microscoop zichtbaar te maken. Bijzondere opmerkingen van de meest relevante stappen worden gegeven aan de beste resultaten te bereiken.
Protocol
I. Voorbeeld verwerking en cel-fixatie
- Laat het sperma monster in steriele recipiënten bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten totdat het vloeibaar maken.
- Breng het monster op een centrifugebuis en de spin het bij 1000g gedurende 5 minuten.
- Verwijder voorzichtig en gooi het supernatant met behulp van een Pasteur pipet.
- Voeg hypotone oplossing (KCl, 0.075M) voorverwarmde bij 37 ° C, druppel voor druppel, terwijl het mengen op een vortex tot een uiteindelijk volume van 10 ml te verkrijgen.
- Plaats de buis in een waterbad bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer bij 1000g gedurende 5 minuten. Verwijder v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft hoe menselijk sperma monsters proces voor het verkrijgen van sperma visbereidingen. Met behulp van dit protocol is het mogelijk om chromosomale afwijkingen te analyseren in mannelijke gameten. Spermatozoa aneuploidie screening heeft toepassingen hetzij in het kader van fundamenteel onderzoek en in de reproductieve advies aan onvruchtbare mannen. Hoewel in de klinische diagnose van de meest bestudeerde chromosomen zijn X, Y, 13, 18 en 21, andere commerciële probes voor een breed scala van chromoso.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te verklaren.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). De auteurs danken aan J. Blanco en F. Vidal voor hun toezicht en aanmoediging, en J. Lucas voor zijn technische bijstand.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| 1,4-Dithiothreïtol (DTT) | Materiaal | Roche Group | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propaan-1,3-diol | Materialen | Roche Group | 10708976001 | |
| Azijnzuur | Materialen | Merck & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Multicolor DNA-sondekit
| Materiaal | Vysis Inc. | 32-161075
| |
| Centrifuge 5804R | Instrument | Eppendorf | ||
| Centrifugebuis | Materiaal | Nalge Nunc international | 347856 | |
| Coplin-pot (glas) | Materialen | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| Coplin-pot (plastic) | Materiaal | Deltalab | 191087 | |
| Dekglasjes (15x15) | Materiaal | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Dekglasjes (18x18) | Materialen | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Diamanten kraspen | Materiaal | Hammacher | 335117010 | |
| Ethanol | Materiaal | Merck & Co., Inc. | 100.983 | |
| Formamide | Materialen | Roche Group | 11814320001 | |
| Vriezer | Instrument | Zanussi | ||
| Handschoenen | Materiaal | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Instrument | Vysis Inc. | ||
| immersie-olie | Materiaal | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubator | Instrument | Heraeus Instruments | ||
| Methanol | Materiaal | Merck & Co., Inc. | 106.009 | |
| Micropipet | Materiaal | Laboratuursystemen | Finnpipette (4500000) | |
| Vervangingspunt voor micropipet | Materiaal | Daslab | 16-2001 | |
| Nagellak | Materiaal | Quo-cosmetica | ||
| Olympus BX60 epifluorescentiemicroscoop | Instrument | Olympus Corporation | Uitgerust met een driebandsfilter voor DAPI/Texas Red/FITC en eenbandsfilters voor Aqua, FITC en Texas Red. | |
| Pasteurpipet | Materiaal | Rubilabor | 211.0230 | |
| Fasecontrastmicroscoop | Instrument | Nikon Instruments | ||
| Plastic pipet (3 ml) | Materialen | Deltalab | 200007 | |
| Kaliumchloride (KCl) | Materiaal | Fluka | 60128 | |
| Rubbercement | Materiaal | Beste test | ||
| Preparaten | Materiaal | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Objectglassenvijlen | Materiaal | Deltalab | 19276.1 | |
| Steriele container | Materiaal | Deltalab | 409726 | |
| Spuit | Materialen | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermometer | Materialen | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Trivoudig gedistilleerd water | Materiaal | |||
| Triton X-100 | Materiaal | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Pincet | Materiaal | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Verticale laminaire stroming laminaire flowkast | Instrument | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Vortexmixer | Instrument | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Waterbad | Instrument | Raypa® |
Referenties
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
