Hier beschrijven we een basisprotocol voor TL-etikettering van de verschillende elementen van het hart buizen van larven en volwassen Drosophila melanogaster. Deze exemplaren zijn zeer geschikt voor imaging via fluorescentie of confocale microscopie. Deze techniek maakt gedetailleerde structurele analyse van de kenmerken van de harten van een krachtig model organisme.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
TL-etikettering van Drosophila Hart Structuren
In dit artikel
Samenvatting
Protocol
Voordat u begint
- Bereid de volgende oplossingen:
- ontspannende buffer (kunstmatige Drosophila hemolymfe (ADH) (zie "Het visualiseren van het kloppende hart in Drosophila"), die 10 mM EGTA bevat)
- fixatief (4% formaldehyde in 1x PBS)
- PBSTx (PBS met 0,1% Triton-X-100)
- Juiste wijze verdund primaire en soortspecifieke fluorescent gelabelde secundaire antilichamen in PBSTx
- Ontleden Drosophila om de cardiale buizen (van volwassen vliegen en / of larven) bloot volgende
- de semi-intacte Drosophila hart voorbereiding pr....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier presenteren wij een protocol nuttig voor het opstellen en kleuren van de Drosophila melanogaster dorsale vat en de omliggende weefsels voor imaging via fluorescentie of confocale microscopie. Wij bieden een beknopt verslag van de stappen verfijnd door en algemeen gebruikt in ons lab voor effectieve kleuren die goed opgelost vergunningen in situ beeldvorming van larven en volwassen Drosophila hart buizen. Anderen hebben soortgelijke methoden beschreven in verkorte vorm 2, 3, 4. .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
De auteurs danken SI Bernstein (San Diego State University) voor het kritisch lezen en nuttige suggesties met betrekking tot de voorbereiding van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH beurzen aan SI Bernstein, SDSU, en R. Bodmer, BIMR en door een post-doctorale beurs uit de Westerse staten Partner van de American Heart Association aan G. Vogler en A. Cammarato.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| Ethyleenglycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N’,N’-tetra-azijnzuur (EGTA) | Reagens | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Formaldehyde, 10%, methanolvrij, Ultra Pure | Reagens | Polysciences, Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | Reagens | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 phalloïdine | Reagens | Invitrogen | A12381 | |
| Vectashield® Montage-medium voor fluorescentie met DAPI | Reagens | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wolfraampinnen | Reagens | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pinhouder | Reagens | Fine Science Tools | 26018-17 |
Referenties
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech Dev. 1, 51-59 (2001).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
