ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Methode voor Mycotoxine Detection

Samenvatting

Een protocol om trichothecenen (mycotoxinen van zorg voor de gezondheid van de mens) met behulp van een nieuw ontwikkelde screening methode gebaseerd op een competitief immunochemische methode en een laatste elektrochemische detectie te detecteren is aangetoond.

Samenvatting

Immunoassays zijn een goed alternatief voor de duurdere en tijdrovende kwantitatieve HPLC of GC ^{1, 2} methoden voor het screenen detectie van gevaarlijke mycotoxinen in levensmiddelen. In dit protocol laten we zien hoe te fabriceren en te ondervragen een elektrochemische competitieve enzyme linked immunomagnetische assay gebaseerd op het gebruik van magnetische beads als vaste ondersteuning voor de immunochemische keten ³ en gezeefdrukt elektroden sensing platform.

Onze methode heeft tot doel vast te stellen het totale bedrag van de HT-2 en T-2-toxine, mycotoxinen die behoren tot de trichothecenen familie en van groot belang voor de gezondheid van de mens ^4. Het gebruik van een antilichaam kloon met een kruis reactiviteit van 100% naar HT-2 en T-2 maakt het mogelijk om gelijktijdig zowel de toxines te detecteren met een vergelijkbare gevoeligheid ^5.

De eerste stap van onze test is de coating stap waar we HT2-KLH conjugaat toxine immobiliseren op het oppervlak van de magnetische kralen. Na een blokkerende stap die nodig is om niet-specifieke absorptie te voorkomen, de toevoeging van een monoklonaal antilichaam kan de concurrentie tussen de geïmmobiliseerde HT-2 en gratis HT-2 of T-2 aanwezig is in het monster of opgelost in een standaard oplossing.

Aan het einde van de wedstrijd stap, het bedrag van monoklonale antilichaam gekoppeld aan het geïmmobiliseerde HT-2 zullen worden omgekeerd evenredig aan de hoeveelheid gif in de monsteroplossing.

Een secundaire antilichaam gelabeld met alkalische fosfatase (AP) wordt gebruikt om de binding tussen de specifieke antilichaam en het geïmmobiliseerde HT-2 te onthullen. De laatste meting stap wordt uitgevoerd door het droppen van een hoeveelheid van magnetische kraal ophanging, wat overeenkomt met een specifiek monster / standaard oplossing, op het oppervlak van een gezeefdrukte werkende elektrode, magnetische korrels worden geïmmobiliseerd en geconcentreerd door middel van een magneet precies onder de gezeefdrukt elektrode. Na twee minuten incubatie tussen magnetische kralen en een substraat voor AP, is de enzymatische product gedetecteerd door Differential Pulse voltammetrie (DPV) met behulp van een draagbaar instrument (PalmSens) ook in staat om automatisch acht metingen te starten binnen een interval van enkele seconden.

Protocol

1) Het blokkeren van gecoate magnetische Beads:

Ga als volgt te gecoate magnetische kralen te blokkeren:

1. Bereid een set van 2 ml Eppendorf buizen;
2. Homogeniseer (schudden, maar niet vortexen) gecoate magnetische kralen (zie de bijlage voor de bereiding van gecoate magnetische korrels) met behulp van het monster draaiende mixer;
3. Onmiddellijk na homogenisering, pipet 10 ul van gecoate magnetische korrels in elk afzonderlijk Eppendorf buizen;
4. Voeg 1 ml magere melk te blokkeren oplossing in elk eppendorfbuisje van de set;
5. Laat magnetische korrels incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur....

Discussie

Het gebruik van antilichamen als biomoleculaire erkenning probe heeft gezien een wijdverbreide gebruik voor het waarnemen van technologieën; immunochemische detectie methoden, zoals ELISA's en MEIAs, zijn tegenwoordig een van de meest gebruikte platforms en toegepast in veel laboratoria ^7.

Hoewel deze benaderingen uitzonderlijke gevoeligheid en specificiteit, een primaire doelstelling van vele onderzoeksgroepen te bereiken in de afgelopen jaren is het verbeteren en optimaliser.......

Materialen

Reagentia

Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
Kaliumchloride	Sigma	P9333
Kaliumdiwaterstoffosfaat	Sigma	P9791
Dinatriumwaterstoffosfaat	Sigma	S3264
Natriumchloride	Sigma	S3014
MgCl 2 watervrij	Sigma	M8266
DEA (99,5%)	Sigma	31589
HCl 37%	Sigma	320331
H 3 BO 3	Sigma	B6768
Tris [hydroxymethyl]-aminomethaan	Sigma	252859
BSA (bovine serum albumine)	Sigma	A4503
NaOH	Sigma	S5881
Tween 20	Sigma	P9416
NaN 3	Aldrich	71290
1-naftyl fosfaat dinatriumzout	Fluka	N7255
Magere melk blokkeren oplossing - niet-vette droge melk	Bio-Rad	170-6404
HT-2-geconjugeerd met KLH (Keyhole Limpet Hemocyanine), voorraad-oplossing (1 mg / ml in PBS):	Biopure	004050	De HT-2-KLH conjugaat werd verkregen door de CDI-methode waarbij de vrije OH-groepen op positie 3 en 4 bij de HT-2-toxine werden geactiveerd door N, N'-carbonyldiimidazool (CDI) en de geactiveerde HT-2-toxine werd laat om te reageren met aminogroups van het eiwit (KLH) om een ​​stabiele carbammate koppeling te genereren.
Secundaire gelabelde antilichaam: Anti-muis IgG (H + L), van paarden, geconjugeerd met alkalische fosfatase, concentratie 1 mg / ml.	Vector Laboratories	AP-2000
HT-2-toxine	Biopure
Magnetische korrels: Dynabeads ®	Dynal	M-280 Tosylactivated	Concentratie 2 x 10 9 kralen / ml.

Oplossingen

Naam van het serum	Voorbereiding	Commentaar (optioneel)
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4	Los 0,20 g kaliumchloride, 0,20 g kaliumdiwaterstoffosfaat, 1,16 g dinatriumwaterstoffosfaat en 8,00 g natriumchloride in 900 ml water
Diethanolamine buffer, DEA, 0,97 M + 1 mM MgCl 2 + 0,15 M KCl, pH 9,8	Los 0.0476g van MgCl 2 watervrije en 7.3.59 g KCl in ~ 300 ml water. Voeg na oplossing 51 ml van de DEA (99,5%). Pas de pH op 9,8 met HCl (6 M). Verdun tot 500 ml met water.
Boraat buffer, 0,1 M, pH 9,5	Los 3,09 g van H 3 BO 3 in ~ 300 ml gedestilleerd water, de pH instellen op 9,5 met NaOH en / of HCl (6 M of lagere concentraties). Verdun tot 500 ml met gedestilleerd water.
TRIS buffer, 0,2 M, pH 8,5	Los 3,85 g Tris [hydroxymethyl]-aminomethaan in 100 ml water. Aan te passen aan de pH 8.5 met NaOH en / of HCl (6 M of lagere concentraties). Verdun tot 200 ml met water.
Tris-buffer + BSA-oplossing (0,1%), pH 8,4	Los 0,050 g van de BSA in 50 ml van de TRIS-buffer pH 8,4.	Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik.
PBS-buffer + Tween ® 0,05%	Los 0,250 g Tween 20 in 500 ml van de vooraf bereide PBS-buffer, pH 7,4
PBS-buffer + BSA-oplossing 0,1%	Los 0,050 g van de BSA in 50 ml PBS-buffer, pH 7,3.	Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik.
PBS-buffer + BSA 0,1% + 0,02% NaN 3	Los 0,050 g van de BSA en 0.010 van NaN 3 in 50 ml PBS-buffer, pH 7,3.	Opslag solution
Enzymatische substraat	Los 0,010 g 1-naftyl fosfaat natriumzout in 100 ml van de DEA buffer pH 9,8. Strak Wikkel de kolf in aluminiumfolie.	Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik.
Magere melk blockingbuffer	Voeg 0,20 g Blotting Grade Blocker niet-vette droge melk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) tot 200 ml PBS buffer pH 7,3.	Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik.
HT-2-stockoplossing	Los 10 mg trichothecenen HT-2-toxine flacon, in 10 ml acetonitril te geven een oplossing met een concentratie van 1 mg / ml.	Opgesplitst deze oplossing in voor eenmalig gebruik aliquots van 30 ml en sla ze op minder dan -30 ° C.
HT-2 standaard-werkoplossing	Pipetteer 20 ml van de HT-2-toxine voorraad oplossing in een 2 ml geijkte maatkolf en verdun met acetonitril om een ​​HT-2-werkende oplossing met 10 ug / ml van trichothecenen toxine te verkrijgen.	Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik.
HT-2 Werken kalibrant oplossingen	Verdun de HT-2 standaard-werkoplossing (10 ug / ml) aan het werken kalibratieoplossing 100 ng / ml te bereiden. Verdunnen HT-2 werkdagen kalibratieoplossing 100 ng / ml te bereiden op het werken kalibratieoplossing oplossingen van de volgende concentraties 0 (leeg), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng / ml.	Deze oplossingen moeten vers worden bereid op de dag van gebruik.
HT-2-geconjugeerd met KLH	Opgesplitst HT-2-geconjugeerd met KLH (Keyhole Limpet Hemocyanine) stockoplossing (1 mg / ml in PBS) in voor eenmalig gebruik porties van 350 ui.	Bewaar aliquots bij -30 ° C.
Specifiek monoklonaal antilichaam	1:350 verdunnen (v: v) de voorraad concentratie (1,383 mg / ml) van het monoklonale antilichaam in PBS om te gebruiken in de concurrentie stap	Deze oplossing moet vers worden bereid op het moment van gebruik. 10 ml antilichaam voorraad oplossing in PBS voor een uiteindelijk volume van 3,5 ml, genoeg zijn om 17 normen en / of monsters te analyseren.
Secundaire gelabelde antilichaam	Anti-muis IgG (H + L) geconjugeerd met alkalische fosfatase is verdund 1:100 (v: v) in PBS om te gebruiken in de concurrentie stap.	100 pi antilichaam voorraad oplossing in PBS voor een uiteindelijk volume van 10 ml, is voldoende om 25 normen en / of monsters te analyseren. Deze oplossing moet vers worden bereid op het moment van gebruik.

Apparaat

Naam van het serum	Vennootschap	Commentaar (optioneel)
Magnetic Particle Concentrator: MPC ®-S	Dynal
PalmSens instrument	PalmSens	Voorzien van PalmSens Lite, Serial kabel tussen PC en laptop Mux opties software
CH8 PalmSens Multiplexer	PalmSens
Acht kanaals Mux elektrisch contact	met de hand gemaakt
Strip met acht gezeefdrukt elektroden (SPE's)	met de hand gemaakt
Speciaal ontworpen voor de ondersteuning van elektroden strip	met de hand gemaakt	Inclusief 8 neodymium magneten die elk bevindt zich onder elke werkdag elektrode-oppervlak van de SPE
Gekalibreerde microliter pipetten	Gilson
Magnetische roerder en roer bars.
Glazen bekers (100, 50, 20 ml).
Maatkolven (2 ml).
0,2 en 2 ml Eppendorf buizen.	Eppendorf
Falcon ™ tubes van 5 ml en 15 ml.	Valk
Laboratorium Vortex Mixer		Gebruik geen vortexmixer aan magnetische bolletjes gecoat met HT2-KLH of gekoppelde mengen met een immunologische ketting om te voorkomen dat denaturering van proteic onderdelen
Laboratorium oven of thermostaat ruimte		Kies een oven in staat om een ​​temperatuur van 37 ± 3 ° C te houden