ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Methode voor Mycotoxine Detection

Samenvatting

Een protocol om trichothecenen (mycotoxinen van zorg voor de gezondheid van de mens) met behulp van een nieuw ontwikkelde screening methode gebaseerd op een competitief immunochemische methode en een laatste elektrochemische detectie te detecteren is aangetoond.

Samenvatting

Immunoassays zijn een goed alternatief voor de duurdere en tijdrovende kwantitatieve HPLC of GC ^{1, 2} methoden voor het screenen detectie van gevaarlijke mycotoxinen in levensmiddelen. In dit protocol laten we zien hoe te fabriceren en te ondervragen een elektrochemische competitieve enzyme linked immunomagnetische assay gebaseerd op het gebruik van magnetische beads als vaste ondersteuning voor de immunochemische keten ³ en gezeefdrukt elektroden sensing platform.

Onze methode heeft tot doel vast te stellen het totale bedrag van de HT-2 en T-2-toxine, mycotoxinen die behoren tot de trichothecenen familie en van groot belang voor de gezondheid van de mens ^4. Het gebruik van een antilichaam kloon met een kruis reactiviteit van 100% naar HT-2 en T-2 maakt het mogelijk om gelijktijdig zowel de toxines te detecteren met een vergelijkbare gevoeligheid ^5.

De eerste stap van onze test is de coating stap waar we HT2-KLH conjugaat toxine immobiliseren op het oppervlak van de magnetische kralen. Na een blokkerende stap die nodig is om niet-specifieke absorptie te voorkomen, de toevoeging van een monoklonaal antilichaam kan de concurrentie tussen de geïmmobiliseerde HT-2 en gratis HT-2 of T-2 aanwezig is in het monster of opgelost in een standaard oplossing.

Aan het einde van de wedstrijd stap, het bedrag van monoklonale antilichaam gekoppeld aan het geïmmobiliseerde HT-2 zullen worden omgekeerd evenredig aan de hoeveelheid gif in de monsteroplossing.

Een secundaire antilichaam gelabeld met alkalische fosfatase (AP) wordt gebruikt om de binding tussen de specifieke antilichaam en het geïmmobiliseerde HT-2 te onthullen. De laatste meting stap wordt uitgevoerd door het droppen van een hoeveelheid van magnetische kraal ophanging, wat overeenkomt met een specifiek monster / standaard oplossing, op het oppervlak van een gezeefdrukte werkende elektrode, magnetische korrels worden geïmmobiliseerd en geconcentreerd door middel van een magneet precies onder de gezeefdrukt elektrode. Na twee minuten incubatie tussen magnetische kralen en een substraat voor AP, is de enzymatische product gedetecteerd door Differential Pulse voltammetrie (DPV) met behulp van een draagbaar instrument (PalmSens) ook in staat om automatisch acht metingen te starten binnen een interval van enkele seconden.

Protocol

1) Het blokkeren van gecoate magnetische Beads:

Ga als volgt te gecoate magnetische kralen te blokkeren:

1. Bereid een set van 2 ml Eppendorf buizen;
2. Homogeniseer (schudden, maar niet vortexen) gecoate magnetische kralen (zie de bijlage voor de bereiding van gecoate magnetische korrels) met behulp van het monster draaiende mixer;
3. Onmiddellijk na homogenisering, pipet 10 ul van gecoate magnetische korrels in elk afzonderlijk Eppendorf buizen;
4. Voeg 1 ml magere melk te blokkeren oplossing in elk eppendorfbuisje van de set;
5. Laat magnetische korrels incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op de draaiende mixer monster;
6. Verwijder de blokkering oplossing: om dit te doen plaats de buis in magnetische deeltjes concentrator met het magnetisch deel op voor de 2 min (zie magnetische korrels plakken op de laterale wand van de buis) zijn, dus wees pipet uit de bovendrijvende, waardoor kralen ongestoord;
7. Voeg 1 ml PBS buffer + NaN ₃ + BSA als opslag-oplossing voor elke buis;
8. Store gecoat en geblokkeerd magnetische korrels bij 4 ° C (let op dat gecoate magnetische korrels stabiel zijn voor ten minste 2 maanden bij 4 ° C);

2) Immunologische ketting op magnetische korrels voor de bouw van de ijklijn en de monsteranalyse

Ga als volgt te magnetische korrels klaar voor de meting zijn:

1. Neem een ​​Eppendorf buis (2 ml) van gecoate en geblokkeerd oplossing voor elk monsterextract je gaat analyseren;
2. Neem een ​​extra eppendorfbuisje voor elk werkgebied kalibratieoplossing;
3. Homogeniseer magnetische korrels gedurende 2 minuten op de roterende steekproef mixer voor gebruik;
4. Verwijder de opslag van vloeibaar met behulp van magnetische deeltjes concentrator;
5. Was de magnetische korrels drie keer met PBS / BSA wasoplossing. Verwijder wasmiddel;
6. Concurrentie stap: Voeg voor elke buis met daarin de gewassen magnetische korrels, 200μl van het monsterextract voorbereid; gebruik maken van een magnetische kraal buis voor elk monster. Herhaal deze procedure voor elke standaard-oplossing. Voeg 200 ul van monoklonaal antilichaam oplossing voor elk magnetische kraal buis. Laat magnetische korrels Incubeer gedurende een half uur op de draaiende mixer monster bij kamertemperatuur;
7. Verwijderen uit Eppendorf buisjes de oplossing voor de concurrentie-stap;
8. Labeling stap: Voeg 400μl van gelabeld secundair antilichaam aan elke magnetische bead eppendorfbuisje. Laat magnetische korrels Incubeer gedurende een half uur op de draaiende mixer monster bij kamertemperatuur;
9. Verwijder de etikettering oplossing van Eppendorf buizen;
10. Was de magnetische korrels drie keer met PBS / Tween ® 20 wasoplossing. Verwijder de vloeistof;
11. Resuspendeer met 100μl van DEA buffer elk aliquot van magnetische kralen. Nu zijn de magnetische korrels zijn klaar voor elektrochemische metingen stap;

3) Montage van PalmSens met multiplexer (Mux) opties

Let op: enzymatische hydrolyse product van substraat fouten het elektrode-oppervlak, om deze reden een nieuwe elektrode is nodig voor elke meting.

1. Sluit een PC laptop PalmSens via de seriële kabel;
2. Sluit de 9-DIN-stekker van CH8 multiplexer met PalmSens.
3. Sluit de seriële kabel van Achtkanaals Mux elektrisch contact met CH8 multiplexer;
4. Plaats elektrode strip op de acht magneet blok. Besteed aandacht aan elk magneet plaats onder elke werkdag elektroden (van nota, de noodzaak van een magneet voor elke elektrode is noodzakelijk omdat anders de magnetische deeltjes zullen niet worden geconcentreerd op de werkende elektrode gebied);
5. Steek de stekker in elektrodes strip in acht kanaals Mux elektrisch contact;

Voor DPV meting gebruik maken van de volgende parameters in de betreffende vakken:
E beginnen: 0 (V); E end: 0,6 (V); E stap: 0.016 (V); E pulse: 0.0339 (V); E conditionering: 0 (V); E depositie: 0 (V); Scan tarief : 0,1 (V / s); T pulse: 0.06 (s); T conditionering: 0 (s), T depositie: 0 (s), T evenwicht: acht (s).

4) enzymatische reactie en elektrochemische meting

1. Meng door zachtjes te schudden elk Eppendorf-buisje met magnetische korrels klaar voor elektrochemische metingen stap om tot een goed gedispergeerd opschorting van de magnetische beads te verkrijgen;
2. Pipetteer van elk Eppendorf, onmiddellijk na homogenisering, een hoeveelheid van 20 ul van het magnetische kraal dispersie op de overeenkomstige werkende elektrode oppervlak. Voor elke elektrode van een strook gebruik 20 ul van magnetische beads uit verschillende Eppendorf buizen (bijvoorbeeld voor acht elektrode acht verschillende Eppendorf);
3. Voeg 80 ul van enzymatische substraat oplossing op de eerste elektrode. Start 2 min. aftellen. Na 14 seconden, voeg 80 ul van enzymatische substraat oplossing op de tweede elektrode. Na nog eens 14 seconden, voeg 80 ul van enzymatische substraat-oplossing op de derde elektrode. Ga op hetzelfde moment interval (14 seconden) tot de laatste elektrode (dat betekent: druppel elk aliquot van substraat met intervallen van 14 sec). De interval tijd van 14 sec wordt berekend als de tijd die nodig is door de potentiostaat om de meting uit te voeren, van de nota, de 80 ui oplossing op elke sensor moet de werkende, referentie-en contra-elektrode te dekken. Bovendien moeten de oplossingen voor elke sensor niet in contact komen met oplossingen van naburige elektroden.
4. Na de 2 minuten af ​​te tellen vanaf de eerste toevoeging van enzymatische substraat oplossing, start de elektrochemische meting;
5. Gebruik de PalmSens Lite software om de huidige pieken (uA) te verkrijgen voor elke oplossing.

5) Berekening

Stel een ijklijn met behulp van een logistische 4 parameters vergelijking en bereken de concentratie van het totale HT-2/T-2 toxine bedrag in nanogram per milliliter voor elke Eppendorf buis met onbekende monster.

De experimentele gegevens, piekhoogte (uA) tegen de concentratie van de kalibranten (ng / ml), moeten worden uitgerust met een niet-lineaire vier-parameter logistiek (4-PL) vergelijking plot (1) (met behulp van Sigma Plot 8.0 of Kaleidagraph). De niet-lineaire 4-PL-model wordt meestal aangenomen om ligandbinding assays (LBA's) ⁶ beschrijven.

(1)
a, b, x0, y0 zijn logistieke parameters zoals gegeven door de Sigma Plot curve fit programma.
Gebruik de geëxpliciteerd formule om de inhoud van de HT-2/T-2 toxine totale bedrag te berekenen in de verdunde oplossing monsterextract
(2)
x is de massaconcentratie van de totale hoeveelheid HT-2/T-2 toxines in de verdunde extract oplossing, berekend op basis van de logistieke 4 parameters vergelijking in nanogram per milliltre (ng / ml)
y is de huidige waarde in uA verkregen voor het onbekende monster

Appendix

6) gecoate magnetische Beads

Ga als volgt te gecoate magnetische kralen hebben:

Wasprocedure

1. Homogeniseren tosylactivated Dynabeads ® M-280 (voorraadoplossing 2 x 109 kralen / ml) door te schudden en vortexen (max snelheid) gedurende 1 minuut (voorkoming van schuimvorming) (let op de concentratie van de magnetische beads moet altijd hetzelfde zijn om te zorgen voor reproduceerbaarheid in de meting);
2. Onmiddellijk pipet 1 ml van de bovenstaande gehomogeniseerd kralen in een 2 ml Eppendorf buis;
3. Plaats de buis in magnetische deeltjes concentrator met het magnetisch deel op voor de 2 min (zie magnetische korrels plakken op de laterale wand van de buis);
4. Voorzichtig pipet uit de bovendrijvende, waardoor kralen ongestoord;
5. Haal de eppendorfbuisje van de magnetische deeltjes concentrator en resuspendeer de kralen in 1 ml van 0,1 M boraatbuffer pH 9,5. Mix zachtjes gedurende 2 minuten in de roterende steekproef mixer gedurende 2 minuten;
6. Pipet uit de bovendrijvende;
7. Pipetteer 1 ml van boraatbuffer oplossing in het Eppendorf buis. Magnetische kralen zijn nu klaar voor het coaten stap;

Coating procedure

8. Voeg 600 ml van de HT-2-geconjugeerd met KLH (Keyhole Limpet Hemocyanine) stockoplossing aan 1 ml van de magnetische kralen) (laatste HT-2-KLH concentratie van 375 mg / ml); incubeer magnetische korrels en HT-2-KLH oplossing voor 20u bij 37 ° C * met langzame tilt rotatie op roterende steekproef mixer;
9. Na incubatie plaats de buis in de magnetische deeltjes concentrator en pipet uit de bovendrijvende;
   Was de gecoate parels twee keer met 1 ml PBS / BSA bufferoplossing. Tussen elke wassen te verwijderen PBS / BSA-oplossing. Alle wasstap werden uitgevoerd instelling magnetische korrels en PBS / BSA op de draaiende mixer gedurende 5 minuten;
10. Was magnetische korrels een keer met 1 ml van de TRIS / BSA bufferoplossing. Verwijder de TRIS / BSA-oplossing. Voer deze stap door magnetische korrels en TRIS / BSA buffer op de draaiende mixer gedurende 4 uur bij 37 ° C *;
11. Was magnetische korrels een keer met 1 ml vernieuwd (in de koelkast bewaren bij 4 ° C) PBS / BSA bufferoplossing. Verwijder PBS / BSA-oplossing. Het uitvoeren van deze stap instelling magnetische korrels en PBS / BSA buffer op de draaiende mixer voor 5 min bij kamertemperatuur;
12. Na het wassen stap verwijder alle wasmiddel en voeg 1 ml PBS buffer + NaN ₃ + BSA als opslag vloeistof;
13. Store gecoate magnetische korrels bij 4 ° C (let op dat gecoate magnetische korrels stabiel zijn voor ten minste 2 maanden bij 4 ° C);

* Voor dit doel de mixer wordt geplaatst in de oven is uitgerust met een gat dat het inbrengen van de kabel voor de voeding mogelijk maakt. Als alternatief kan de mixer kon worden geplaatst in een thermostatisch kamer bij 37 ° C.

7) Voorbereiding van het monster en extractie

25 g fijn gemalen monster (babyvoeding of ontbijtgranen) zijn wijighed in een blender pot en geëxtraheerd met 100 ml acetonitril / water-oplossing (86/14) voor 3 min in een high-speed blender. Na het centrifugeren bij 4000 rpm (3000 g) voor 5 min, 8 ml van de bovenstaande werden genomen en gezuiverd met Mycosep kolom, werden 4 ml van de gereinigde extract gedroogd onder stikstofstroom. Gedroogde monsters kan worden opgeslagen bij -30 ° C tot enkele maanden.

8) Voorbeeld reconstitutie

Ontbijtgranen

Los het droge ontbijtgranen extract (op basis van granen voeding bestemd voor volwassen consumptie) met 40 ml PBS pH 7,4. Op deze manier wordt een monster met een concentratie van toxine die gelijk is aan de veronderstelde wettelijke limiet (200 ng / g) geeft in de meting stap een signaal vallen in het midden van het werkgebied.

Babyvoedsel

Reconstitueer de gedroogde babyvoeding extract (op basis van granen voedsel bestemd voor babyvoeding) met 4 ml PBS. Op deze manier wordt een monster met een concentratie van giftige stoffen die gelijk is aan de veronderstelde wettelijke limiet (20-25 ng / g) geeft in de meting stap een signaal vallen in het midden van het werkgebied.

Discussie

Het gebruik van antilichamen als biomoleculaire erkenning probe heeft gezien een wijdverbreide gebruik voor het waarnemen van technologieën; immunochemische detectie methoden, zoals ELISA's en MEIAs, zijn tegenwoordig een van de meest gebruikte platforms en toegepast in veel laboratoria ^7.

Hoewel deze benaderingen uitzonderlijke gevoeligheid en specificiteit, een primaire doelstelling van vele onderzoeksgroepen te bereiken in de afgelopen jaren is het verbeteren en optimaliser...

Materialen

Reagentia

Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
Kaliumchloride	Sigma	P9333
Kaliumdiwaterstoffosfaat	Sigma	P9791
Dinatriumwaterstoffosfaat	Sigma	S3264
Natriumchloride	Sigma	S3014
MgCl 2 watervrij	Sigma	M8266
DEA (99,5%)	Sigma	31589
HCl 37%	Sigma	320331
H 3 BO 3	Sigma	B6768
Tris [hydroxymethyl]-aminomethaan	Sigma	252859
BSA (bovine serum albumine)	Sigma	A4503
NaOH	Sigma	S5881
Tween 20	Sigma	P9416
NaN 3	Aldrich	71290
1-naftyl fosfaat dinatriumzout	Fluka	N7255
Magere melk blokkeren oplossing - niet-vette droge melk	Bio-Rad	170-6404
HT-2-geconjugeerd met KLH (Keyhole Limpet Hemocyanine), voorraad-oplossing (1 mg / ml in PBS):	Biopure	004050	De HT-2-KLH conjugaat werd verkregen door de CDI-methode waarbij de vrije OH-groepen op positie 3 en 4 bij de HT-2-toxine werden geactiveerd door N, N'-carbonyldiimidazool (CDI) en de geactiveerde HT-2-toxine werd laat om te reageren met aminogroups van het eiwit (KLH) om een ​​stabiele carbammate koppeling te genereren.
Secundaire gelabelde antilichaam: Anti-muis IgG (H + L), van paarden, geconjugeerd met alkalische fosfatase, concentratie 1 mg / ml.	Vector Laboratories	AP-2000
HT-2-toxine	Biopure
Magnetische korrels: Dynabeads ®	Dynal	M-280 Tosylactivated	Concentratie 2 x 10 9 kralen / ml.

Oplossingen

Naam van het serum	Voorbereiding	Commentaar (optioneel)
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4	Los 0,20 g kaliumchloride, 0,20 g kaliumdiwaterstoffosfaat, 1,16 g dinatriumwaterstoffosfaat en 8,00 g natriumchloride in 900 ml water
Diethanolamine buffer, DEA, 0,97 M + 1 mM MgCl 2 + 0,15 M KCl, pH 9,8	Los 0.0476g van MgCl 2 watervrije en 7.3.59 g KCl in ~ 300 ml water. Voeg na oplossing 51 ml van de DEA (99,5%). Pas de pH op 9,8 met HCl (6 M). Verdun tot 500 ml met water.
Boraat buffer, 0,1 M, pH 9,5	Los 3,09 g van H 3 BO 3 in ~ 300 ml gedestilleerd water, de pH instellen op 9,5 met NaOH en / of HCl (6 M of lagere concentraties). Verdun tot 500 ml met gedestilleerd water.
TRIS buffer, 0,2 M, pH 8,5	Los 3,85 g Tris [hydroxymethyl]-aminomethaan in 100 ml water. Aan te passen aan de pH 8.5 met NaOH en / of HCl (6 M of lagere concentraties). Verdun tot 200 ml met water.
Tris-buffer + BSA-oplossing (0,1%), pH 8,4	Los 0,050 g van de BSA in 50 ml van de TRIS-buffer pH 8,4.	Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik.
PBS-buffer + Tween ® 0,05%	Los 0,250 g Tween 20 in 500 ml van de vooraf bereide PBS-buffer, pH 7,4
PBS-buffer + BSA-oplossing 0,1%	Los 0,050 g van de BSA in 50 ml PBS-buffer, pH 7,3.	Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik.
PBS-buffer + BSA 0,1% + 0,02% NaN 3	Los 0,050 g van de BSA en 0.010 van NaN 3 in 50 ml PBS-buffer, pH 7,3.	Opslag solution
Enzymatische substraat	Los 0,010 g 1-naftyl fosfaat natriumzout in 100 ml van de DEA buffer pH 9,8. Strak Wikkel de kolf in aluminiumfolie.	Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik.
Magere melk blockingbuffer	Voeg 0,20 g Blotting Grade Blocker niet-vette droge melk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) tot 200 ml PBS buffer pH 7,3.	Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik.
HT-2-stockoplossing	Los 10 mg trichothecenen HT-2-toxine flacon, in 10 ml acetonitril te geven een oplossing met een concentratie van 1 mg / ml.	Opgesplitst deze oplossing in voor eenmalig gebruik aliquots van 30 ml en sla ze op minder dan -30 ° C.
HT-2 standaard-werkoplossing	Pipetteer 20 ml van de HT-2-toxine voorraad oplossing in een 2 ml geijkte maatkolf en verdun met acetonitril om een ​​HT-2-werkende oplossing met 10 ug / ml van trichothecenen toxine te verkrijgen.	Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik.
HT-2 Werken kalibrant oplossingen	Verdun de HT-2 standaard-werkoplossing (10 ug / ml) aan het werken kalibratieoplossing 100 ng / ml te bereiden. Verdunnen HT-2 werkdagen kalibratieoplossing 100 ng / ml te bereiden op het werken kalibratieoplossing oplossingen van de volgende concentraties 0 (leeg), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng / ml.	Deze oplossingen moeten vers worden bereid op de dag van gebruik.
HT-2-geconjugeerd met KLH	Opgesplitst HT-2-geconjugeerd met KLH (Keyhole Limpet Hemocyanine) stockoplossing (1 mg / ml in PBS) in voor eenmalig gebruik porties van 350 ui.	Bewaar aliquots bij -30 ° C.
Specifiek monoklonaal antilichaam	1:350 verdunnen (v: v) de voorraad concentratie (1,383 mg / ml) van het monoklonale antilichaam in PBS om te gebruiken in de concurrentie stap	Deze oplossing moet vers worden bereid op het moment van gebruik. 10 ml antilichaam voorraad oplossing in PBS voor een uiteindelijk volume van 3,5 ml, genoeg zijn om 17 normen en / of monsters te analyseren.
Secundaire gelabelde antilichaam	Anti-muis IgG (H + L) geconjugeerd met alkalische fosfatase is verdund 1:100 (v: v) in PBS om te gebruiken in de concurrentie stap.	100 pi antilichaam voorraad oplossing in PBS voor een uiteindelijk volume van 10 ml, is voldoende om 25 normen en / of monsters te analyseren. Deze oplossing moet vers worden bereid op het moment van gebruik.

Apparaat

Naam van het serum	Vennootschap	Commentaar (optioneel)
Magnetic Particle Concentrator: MPC ®-S	Dynal
PalmSens instrument	PalmSens	Voorzien van PalmSens Lite, Serial kabel tussen PC en laptop Mux opties software
CH8 PalmSens Multiplexer	PalmSens
Acht kanaals Mux elektrisch contact	met de hand gemaakt
Strip met acht gezeefdrukt elektroden (SPE's)	met de hand gemaakt
Speciaal ontworpen voor de ondersteuning van elektroden strip	met de hand gemaakt	Inclusief 8 neodymium magneten die elk bevindt zich onder elke werkdag elektrode-oppervlak van de SPE
Gekalibreerde microliter pipetten	Gilson
Magnetische roerder en roer bars.
Glazen bekers (100, 50, 20 ml).
Maatkolven (2 ml).
0,2 en 2 ml Eppendorf buizen.	Eppendorf
Falcon ™ tubes van 5 ml en 15 ml.	Valk
Laboratorium Vortex Mixer		Gebruik geen vortexmixer aan magnetische bolletjes gecoat met HT2-KLH of gekoppelde mengen met een immunologische ketting om te voorkomen dat denaturering van proteic onderdelen
Laboratorium oven of thermostaat ruimte		Kies een oven in staat om een ​​temperatuur van 37 ± 3 ° C te houden