Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

Samenvatting

Deze procedure laat zien hoe de Gene Puiser MXcell elektroporatie systeem te gebruiken om snel en gemakkelijk identificeren van de beste elektroporatie voorwaarden voor muis embryonale fibroblasten (MEF) of andere primaire cellen. Overwegingen voor het oplossen van problemen worden ook besproken in de bijbehorende video.

Samenvatting

Het wordt steeds duidelijker dat elektroporatie is de meest effectieve manier om plasmide DNA of siRNA introduceren in primaire cellen. De Gene Puiser MXcell elektroporatie systeem en Gene Puiser elektroporatie buffer (Bio-Rad) werden speciaal ontwikkeld om eenvoudig nucleïnezuren transfecteren in zoogdiercellen en moeilijk te transfecteren cellen, zoals de primaire en stamcellen. We zullen laten zien hoe je een eenvoudig experiment om snel de beste elektroporatie omstandigheden te vervullen. We zullen zien hoe verschillende monsters lopen door een waaier van elektroporatie condities, zodat een experiment kan worden uitgevoerd op hetzelfde moment als optimalisatie is uitgevoerd. We zullen ook zien hoe optimale omstandigheden geïdentificeerd 96-well platen met behulp van elektroporatie kan gebruikt worden met standaard elektroporatie cuvetten, het vergemakkelijken van de overstap van elektroporatie platen om elektroporatie cuvetten met behoud van dezelfde elektroporatie efficiëntie. In de video, zullen we ook bespreken een aantal van de belangrijkste factoren die kunnen leiden tot het succes of falen van elektroporatie experimenten.

Protocol

1) celpreparaat

1. Bij het gebruik van hechtende cellen, is het noodzakelijk om trypsinize en vóór het verzamelen van de cellen elektroporatie.
2. Te vergelijken transfectie van de vier muis embryonale fibroblasten (MEF) culturen, die drie verschillende passage nummers, voer dan de volgende op elke fles.
3. Aspireren uit celcultuur media.
4. Voeg PBS aan cellen te wassen.
5. Verwijder PBS, voeg voldoende trypsine aan cellen te dekken, en wacht een paar minuten zodat trypsine aan cellen los te maken.
6. Controleer kolven met een microscoop om de conditie van de cellen te controleren, smakken kolf met cellen los, en dan weer controleren fles om er zeker van cellen zijn allemaal vrijstaand.
7. Wacht extra tijd en herhaal indien nodig.
8. Als alle cellen zijn vrijstaand, toe te voegen serum bevattende media te trypsine te neutraliseren.
9. Overdracht cellen om een ​​centrifugebuis, en pellet-cellen door centrifugeren (RCF = 300 xg).
10. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in een bekend volume van de PBS.
11. Tellen cellen.
12. Transfer naar een nieuwe buis de juiste hoeveelheid celsuspensie aan het vereiste aantal van cellen voor experimenten (je zult 150 ul van cellen per well nodig bij een dichtheid van 1 x 10 ⁶ cellen / ml) te geven.
13. Centrifuge cellen.
14. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in de juiste hoeveelheid van Gene Puiser elektroporatie buffer aan een cel dichtheid van 1 x 10 ⁶ cellen / ml te bereiken.
15. Voeg 20 ug van plasmide per ml celsuspensie toe en meng voorzichtig.

2) Elektroporatie schip setup en elektroporatie

Plaat opzet en elektroporatie

1. Plug plaat kamer op de power module van de Gene Puiser MXcell elektroporatie systeem.
2. Pipetteer 150 ul cel mengsel of buffer in de putjes van een 96-wells plaat elektroporatie.
3. Leg plaat in plaat kamer en pols.
4. Verwijder de plaat uit kamer.
5. Meng goed door de inhoud en neer te pipetteren in elk putje.
6. Breng de cellen van elk putje naar voorverwarmde buffer in 12-wells platen.
7. Tik op plaat naar de cellen te verspreiden en het in incubator.
8. Laat cellen herstellen voor 24 uur.

Kuvet setup en elektroporatie

9. Haal de stekker plaat kamer van de power module van de Gene Puiser MXcell elektroporatie systeem en sluit de ShockPod ™ cuvette kamer.
10. Pipetteer 600 ul van celsuspensie in een 0,4 cm gat elektroporatie cuvette.
11. Zet cuvet in ShockPod kamer en leveren elektrische puls.
12. Verwijder de cuvet uit kamer.
13. Meng kuvet inhoud door en neer te pipetteren in de cuvette.
14. Breng de cellen van elk putje naar voorverwarmde buffer in 12-wells platen.
15. Tik op plaat naar de cellen te verspreiden en het in incubator.
16. Laat de cellen herstellen voor 24 uur.

3) representatieve resultaten

Na het transfecteren cellen en om te herstellen, kwalitatief analyseren van de transfectie-efficiëntie, met behulp van epifluorescerende microscopie, en kwantitatief, met behulp van flow cytometrie.

Figuur 1. Cellen die met succes zijn geëlektroporeerd en zijn nu de uiting van de GFP-gen verschijnen onder epifluorescerende microscopie.

Figuur 2. Bekijken van de cellen onder fasecontrast maakt visualisatie van zowel de getransfecteerde en ongetransfecteerde cellen. Dit zijn de cellen die waren om de laagste spanning elektroporatie puls blootgesteld bij 200V. De cellen zijn grotendeels confluent wijten aan de hoge celdichtheid.

Figuur 3. Hetzelfde beeldveld onder epifluorescentie toont een aantal van de cellen zijn de uiting van de GFP marker, maar deze zijn slechts een klein percentage van de cellen zichtbaar is in de vorige afbeelding.

Figuur 4. Op 250V, het totale aantal levende cellen gezien onder fasecontrast daalt licht.

Figuur 5. Onder epifluorescentie, kan men zien dat het aantal GFP tot expressie brengen is toegenomen.

Figuur 6. Op het hoogste spanning, 375V, er zijn minder levende cellen zichtbaar.

Figuur 7. Echter, een groot percentage van de resterende cellen die GFP. Die voorwaarde is een optimale hangt af van het experimenteel ontwerp. In sommige experimenten het grootste aantal van de getransfecteerde cellen zou kunnen worden optimaal, in andere experimenten het hoogste percentage transfectie best zou kunnen zijn.

Wij zijn geïnteresseerd in het percentage van cellen die GFP positieve onder elke conditie en hoe de percentages variëren met de cel leeftijd. Flowcytometrie kan kwantitatieve informatie over de transfectie resultaten onder elk van de verschillende elektroporatie voorwaarden.

Figuur 8. Hier is het percentage van de cellen die GFP positief in de passage 5 cellen onder elk van de 12 elektroporatie voorwaarden worden weergegeven. De maximale transfectie percentage was ongeveer 80% onder de hoogste spanning exponentiële verval pols, voorwaarde 6, en 70% onder de sterkste blokgolf getest, conditie 12.

Figuur 9. Met de cellen doorgegeven 9 keer voorafgaand aan de elektroporatie, het algemene patroon van de transfectie percentage is vrijwel identiek, maar met een zeer lichte daling in de transfectie percentages.

Figuur 10. Hier worden de percentages van GFP cellen in de passage 13 cellen die een duidelijke afname in transfectie percentage ten opzichte van de jongere cellen vertonen. De hoogste percentages transfectie werden ongeveer de helft van wat werd bereikt met de jongere cellen die het belang aantonen van het gebruik van gezonde cellen zo snel na isolatie mogelijk.

Elektroporatie Voorwaarden voor transfecteren MEF cellen met behulp van de Gene Puiser MXcell
Voorwaarde (1-6) Exponentiële Decay pulsen, alle met 350 uF, 1000ohm	Spanning (V)
1	200
2	250
3	300
4	326
5	350
6	376
Voorwaarde (7-12) Vierkante Wave pulsen, alle met 2000 uF, 1000 ohm, en een puls	Spanning (V)	Pulsduur (ms)
7	200	10
8	250	10
9	300	10
10	200	20
11	250	20
12	300	20

Discussie

Deze video artikel legt uit hoe het MXcell elektroporatie systeem te gebruiken om gemakkelijk te identificeren optimale omstandigheden voor elektroporatie MEFs of andere primaire cellijnen. De 96-wells plaat-indeling kan voor vele herhalingen van experimentele of optimalisatie voorwaarden gelijktijdig worden uitgevoerd, die de noodzaak voor vele afzonderlijke experimenten kan elimineren. Bij de uitvoering van deze procedure, moet men aan te denken om gezonde cellen te gebruiken als snel na isolatie mogelijk en elektroporatie voorwaarden die zijn afgestemd op de elektroporatie buffer te gebruiken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Gene Pulser® electroporatiebuffer	Bio-Rad	165-2676
Gene Pulser MXcell™ electroporatiesysteem	Bio-Rad	165-2670
Gene Pulser MXcell™ ShockPod™ cuvettekamer	Bio-Rad	165-2673
Gene Pulser MXcell™ electroporatiesysteem met ShockPod™ cuvettekamer	Bio-Rad	165-2674