Ontcijfering Axonale Pathways van genetisch bepaalde groepen van neuronen in de Chick Neural Tube Door gebruik te maken In ovo Elektroporatie

Samenvatting

Deze video laat zien hoe axonale paden van genetisch bepaalde groepen neuronen te visualiseren in de embryonale kuiken ruggenmerg gebruik te maken van In ovo Elektroporatie van de reportergenen onder de controle van specifieke enhancer elementen.

Samenvatting

Tewerkstelling van enhancer elementen om de expressie van reportergenen rijden in neuronen is een veel gebruikt model voor het bijhouden van axonale projectie. Voor het volgen van axonale projectie van spinale interneuronen in gewervelde dieren, kiemlijn gerichte reportergenen opbrengst bilateraal symmetrisch etikettering. Daarom is het moeilijk om onderscheid te maken tussen de ipsi-en contra-lateraal uitstekende axonen. Eenzijdige elektroporatie in het kuiken neurale buis is een nuttig middel om de expressie van een reportergen te beperken tot een kant van het centrale zenuwstelsel, en om axonale projectie te volgen aan beide zijden

Protocol

I. Elektroporatie

Eierbehandeling

1. Leg de eieren in een vochtige incubator ingesteld op 37-38 ° C, bij voorkeur een incubator met een rockende laden.
2. Embryo worden geëlektroporeerd na ongeveer 66 uur van de incubatietijd, wanneer zij hebben bereikt Hamburger & Hamilton (HH) fase 18-20. In dit stadium het hoofd ligt in een rechte hoek ten opzichte van de romp (aandoening, de zogenaamde cervicale buiging) en een uitgebreide set van extra-embryonale bloedvaten, zoals de voorste, achterste, rechts en links vitelline aderen moet worden gezien. Dit is een optimale podium voor enhancer-afhankelijke specifieke expressie ^1,3,4. Het is belangrijk om de temperatuur en vochtigheid van de incubator te controleren, om levensvatbare en gesynchroniseerd embryo's te verkrijgen.
3. Na 66 uur incubatie, verwijder dan de eieren van de incubator. Horizontaal plaatsen van de eieren. Wacht 5-10 minuten. Het embryo is nu gevestigd op de bovenste pool van het ei.

Voorbereidingen

1. Bereid Hank's oplossing met penicilline / streptomycine (P / S) (1:100 verdunning).
2. Trek de glazen capillairen (0,5 mm diameter) aan microcapillaire.
3. Plaats de elektroden (tungsten) in micromanipulator en sluit elektroden op de pulsgenerator (ECM 830).
4. Stel de pulsgenerator met de volgende parameters: spanning 30V, aantal pulsen - 3, lengte van de impuls 50 ms.
5. Bereid een mond pipet, een injectienaald en een tape.
6. Bereid een gewenste mix van DNA (2-5μg/μl) en voeg een snel groen kleurstof.

Windowing en elektroporatie

1. Met behulp van een spuit, moet u 5-6 ml van albumine uit elk ei.
2. Met een kleine schaar opent een ovale venster aan de bovenzijde van het ei.
3. Vochtig het embryo met 0,5-1ml Hank's + P / S-oplossing.
4. Gebruik een mond pipet, het laden van de glazen microcapillaire met DNA mengsel.
5. Plaats de embryo met zijn staart naar u toe. In dit stadium is het embryo's ruggenmerg duidelijk te zien. Vandaar dat er geen contrasterende technieken die nodig zijn. Het ruggenmerg is afgedicht aan beide uiteinden, de kop en de staart, maar als je microcapillaire is dun genoeg is, zul je in staat om het doorprikken een klein gaatje en dringen de neurale buis op een ondiepe hoek. Een microcapillaire van de juiste diameter moet gemakkelijk worden geladen met DNA, de buis binnen te dringen zonder het te beschadigen en laat het DNA met een gewone uitademing.
6. Injecteer het DNA met behulp van een pipet mond. De groene kleurstof moet zich vanaf het uiteinde van de staart tot aan de blaasjes van de zich ontwikkelende hersenen.
7. Plaats de elektroden in parallel aan de neurale buis, zo dicht als je kunt, zonder het aanraken van de buis zelf en pols. Op het moment van de puls, moeten de elektroden worden afgedekt met een vloeistof voor het toestaan ​​van elektrische geleidbaarheid. Meestal is het bedrag van Hank's toegevoegd aan het bedelen is voldoende. Als dat niet een druppel van Hank's net voor de puls.
8. Verwijder voorzichtig de elektroden en sluit het venster met een tape. Het is belangrijk om het ei volledig zegel om uitdroging te voorkomen van het embryo tijdens de volgende incubatietijd.
9. Leg het ei terug in de incubator.

II. Ruggenmerg open-boek voorbereiding

Onthechting van het ruggenmerg van het embryo

1. Verwijder de eletroporated embryo, op E6, uit het ei en plaats deze in een petrischaal gecoat met siliconen met PBS.
2. Knip de membranen en rek het embryo aan zijn buikzijde met behulp van pinnen om het te houden.
3. Met behulp van een scherpe wolfraam microcapillaire maken een longitudinale incisie langs de dakplaat van de achterhersenen tot aan de staart.
4. Maak een extra twee longitudinale incisies aan beide zijden van het ruggenmerg, het losmaken van de achterwortelganglia (DRG) van het ruggenmerg.
5. Maak de vloerplaat van het weefsel vanaf de staart naar de achterhersenen, waardoor het ruggenmerg intact.
6. Snijd het ruggenmerg in een dwarsdoorsnede van de achterhersenen met behulp van fijne schaar en scheiden van het lichaam.

Bevestiging

1. Spreid de geïsoleerde ruggenmerg in een nieuwe petrischaal gecoat met siliconen met PBS, met behulp van pinnen om het te houden, uit de achterhersenen tot de staart het produceren van een flat-mount voorbereiding.
2. Giet de PBS uit de schotel en vervang deze met 4% paraformaldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing.
3. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.

Immunohistochemie

1. Breng de vaste ruggenmerg in een flacon met primair antilichaam in PBS.
2. Incubeer met zachte onrust 's nachts bij 4 ° C.
3. Was het antilichaam X5 maal met PBS, elke wasbeurt gedurende 1 uur met zachte onrust.
4. Voeg secundair antilichaam en incubeer met zachte onrust 's nachts bij 4 ° C.
5. Was het antilichaam X5 keer met PBS, elkWas gedurende 1 uur met zachte beroeringen.

Montage open boek voor de beeldvorming

1. Smeer vet of siliconen in een rechthoek op een dia en druppel PBS binnen.
2. Plaats het ruggenmerg uitgerekt in het midden van de rechthoek met een pincet en trek uit de vloeistof rond met een Pasteur pipet.
3. Plaats 1-2 druppels van de montage van media op het ruggenmerg en dek af met deksel slip. Squash is om luchtbellen te voorkomen.
4. Houd de dia's in het donker in 4 ° C.
5. Inspecteer het ruggenmerg met behulp van confocale microscopie.

Discussie

Elektroporatie van plasmide DNA in het kippenembryo ontwikkelt zich als een krachtige techniek voor in vivo ectopische expressie. De combinatie van specifieke enhancers, en chick elektroporatie biedt een snelle en efficiënte tool voor het ontcijferen van axonale paden van een genetisch bepaalde groep neuronen ^1,3,5. Gebruik makend van de Cre / loxP en de Gal4/UAS versterking systemen kunnen vergroten het niveau en de duur van meningsuiting. De opkomende beeld is van een complex divergentie van axonale signale...